Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na odkrycie ruchomości limfocytów oraz oddziaływań komórkowych w obrębie węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy demonstrujemy adoptywny transfer limfocytów T, izolację węzłów chłonnych oraz obrazowanie ruchomości limfocytów T CD4+ w wypreparowanym węźle chłonnym.
Artykuł metodologiczny
Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie dwufotonowe ujawniło precyzyjną choreografię ruchliwości i oddziaływań komórkowych wewnątrz węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz w momencie inicjacji odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy przedstawiamy metody adoptywnego transferu znakowanych limfocytów T, izolacji węzłów chłonnych oraz obrazowania ruchliwości limfocytów T CD4+ w wyekscyzyjnym węźle chłonnym, zgodnie z opisem z 2002 roku 2. Obrazowanie dwufotonowe komórek odpornościowych wymaga, aby komórki były znakowane fluorescencyjnie, albo poprzez barwienie barwnikiem śledzącym komórki, albo poprzez ekspresję białka fluorescencyjnego. Prezentujemy procedurę adoptywnego transferu polegającą na wstrzyknięciu komórek pochodzących od myszy dawcy do żyły ogonowej zwierzęcia biorcy, skąd w ciągu około 15-30 min migrują one do organów limfatycznych. Ilustrujemy proces izolacji węzła chłonnego i opisujemy metody zapewniające prawidłowe zamocowanie wyciętego węzła. Omówiono również inne kwestie, takie jak odpowiednie natlenienie perfundowanego medium, temperatura oraz moc lasera. Na koniec przedstawiamy trójwymiarowe nagrania wideo naiwnych limfocytów T CD4+ wykazujących ruchliwość w stanie spoczynku w temperaturze 37°C.
Protokół
1. Adopcyjny transfer komórek:
Wstrzykiwanie do żyły ogonowej lub do wnętrza oka to odpowiednie metody wprowadzania limfocytów znakowanych trackerem komórkowym lub wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych. W niniejszym filmie prezentujemy adoptywny transfer komórek poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej.
a. Materiały
Komórki T CD4+ znakuje się 1,4 μM CFSE przez 30 minut w temperaturze 37ºC, płucze dwukrotnie i zawiesza ponownie w 100 μL RPMI-1640. Komórki nanosi się do sterylnej strzykawki insulinowej o rozmiarze 28G w celu iniekcji. Liczba użytych komórek zależy od rodzaju prowadzonego eksperymentu. Zazwyczaj 5 milionów komórek T jest wystarczających do prostej wizualizacji komórek T. Aby zapobiec zranieniu zwierzęcia oraz operatora, konieczne jest zastosowanie ograniczacza ruchów dla myszy.
b. Unieruchomienie zwierzęcia
Myszy unieruchamia się do transferu adopcyjnego, powoli wprowadzając zwierzę tyłem do ograniczacza dla gryzoni (patrz wideo) i zamykając otwarty koniec rurki poprzez delikatne dociśnięcie tłoka. Podczas tego procesu nie należy puszczać ogona myszy, ponieważ niektóre mniejsze zwierzęta mogą obrócić się wewnątrz ograniczacza. Metoda ta zapobiega zranieniu się zwierzęcia oraz jego przemieszczaniu się podczas wstrzykiwania. Podczas ustawiania ograniczacza dla gryzoni nie należy wsuwać tłoka głębiej, niż jest to konieczne, aby zapobiec wyskoczeniu zwierzęcia do przodu. Ponadto, nie należy dociskać tłoka do zwierzęcia ani pozostawiać zwierzęcia w ograniczaczu przez dłuższy czas.
c. Wizualizacja żyły ogonowej
Delikatnie pociągnij ogon w swoją stronę, tak aby lekko owinął się wokół palca wskazującego i został dociśnięty do wewnętrznej strony palca kciukiem. Zlokalizuj żyły ogonowe znajdujące się po obu stronach wyprostowanego ogona. Wizualizację ułatwia ogrzanie ogona ciepłą wodą, a następnie przetarcie go etanolem.
d. Iniekcja komórek
Po zlokalizowaniu żyły wprowadź strzykawkę skośną stroną do góry pod płytym kątem, równolegle do żyły. Po wprowadzeniu do żyły delikatnie przeciśnij tłok; jeśli igła znajduje się w naczyniu, nie powinno być żadnego oporu podczas wstrzykiwania. W przypadku wystąpienia jakiegokolwiek oporu wyjmij strzykawkę i spróbuj ponownie w innym miejscu.
Jeśli igła znajduje się w naczyniu, powoli naciskaj tłok, aż do zakończenia iniekcji. Ogon nie powinien nabrzmiewać podczas wstrzykiwania. Jeśli tak się stanie, oznacza to, że igła nie znajduje się w żyle. Możliwe jest „zgubienie” żyły w trakcie iniekcji. W takim przypadku wyjmij igłę i spróbuj wykonać wstrzyknięcie w innym miejscu. Jeśli konieczna jest próba wykonania więcej niż jednej iniekcji, najlepiej przesuwać się z pierwotnego miejsca wstrzyknięcia w górę ogona, w stronę ciała myszy. Zaplanuj taką możliwość, zaczynając od części dystalnej ogona, aby zostawić sobie miejsce na kolejną próbę transferu adopcyjnego.
e. Uwagi po iniekcji
Po zakończeniu wstrzyknięcia wystąpi niewielki cofanie się krwi z żyły. Delikatnie uciskaj miejsce wstrzyknięcia czystym gazikiem, aż krwawienie ustanie. Wyjmij tłok i pozwól zwierzęciu wyjść naprzód z ograniczacza, delikatnie trzymając je za ogon.
Zawsze konsultuj się z komisją ds. opieki nad zwierzętami oraz sprawdź protokoły wykorzystania zwierząt, aby upewnić się, że działasz zgodnie z przepisami. Przed przystąpieniem do właściwego eksperymentu ważne jest, aby kilkakrotnie przećwiczyć tę technikę.
2. Izolacja węzłów chłonnych
Izolacja węzłów chłonnych do obrazowania dwufotonowego wymaga ostrożnego usunięcia odpowiedniego węzła chłonnego z otaczającej go tkanki.
a. Wybór i lokalizacja obwodowych węzłów chłonnych
Wybór węzłów chłonnych do obrazowania zależy od celów eksperymentalnych. Należy uwzględnić obecność miejscowych infekcji lub węzłów chłonnych drenujących miejsce iniekcji i wybrać odpowiedni węzeł do obrazowania. Artykuł Van den Broeck i wsp. szczegółowo opisuje lokalizację i morfologię węzłów chłonnych myszy3. W niniejszym filmie prezentujemy wycięcie sześciu dużych obwodowych węzłów chłonnych, które nadają się do izolacji komórek lub obrazowania.
b. Usunięcie węzła chłonnego:
Podczas usuwania węzłów chłonnych należy dbać o zachowanie integralności tkanki. Należy uważać, aby nie przerwać torebki ani w żaden sposób nie uszkodzić struktury węzła chłonnego. Utrata integralności strukturalnej węzła chłonnego wpłynie negatywnie na wynik eksperymentu. W razie potrzeby tłuszcz z powierzchni węzła chłonnego należy usunąć za pomocą precyzyjnej pęsety do sekcji (#5 Dumont) pod mikroskopem stereoskopowym. Na powierzchni węzła nie powinno pozostać żadnych złogów tłuszczu, ponieważ spowodowałoby to rozproszenie światła i utrudniło obrazowanie.
Prawidłowe wycięcie węzłów chłonnych to kolejna ważna technika, którą należy przećwiczyć przed pierwszym właściwym eksperymentem.
3. Konfiguracja i uwagi dotyczące obrazowania węzłów chłonnych
Węzeł chłonny należy przymocować do stołu obrazującego, który w tym przypadku składa się z wgłębnej komory. Ogrzane, natlenione podłoże jest pompowane do komory z jednej strony za pomocą pompy perystaltycznej i grzałki przepływowej, a następnie odpływa przez kanał o nachyleniu w dół do komory zbiorczej z rurką próżniową prowadzącą do kolby na odpady. W naszym systemie węzeł chłonny jest zanurzony w podłożu o temperaturze 37°C i superperfundowany karbogenem klasy medycznej (5% CO2, 95% O2). Temperaturę podłoża perfuzyjnego należy rejestrować jak najbliżej węzła chłonnego. Konkretny system może wymagać modyfikacji szybkości przepływu podłoża oraz konstrukcji stołu, aby dostosować go do stołu i obiektywu mikroskopu.
a. Konfiguracja obrazowania węzłów chłonnych:
Jak pokazano na filmie, unieruchamiamy węzeł chłonny, przyklejając go najpierw stroną rdzeniową do dołu (aby obrazować strefy komórek T lub B przy użyciu mikroskopu pionowego) do plastikowej laminki dociętej do odpowiedniego rozmiaru. Ważne jest zastosowanie nietoksycznego kleju tkankowego (my stosujemy VetBond™ firmy 3M Corporation).
Kryszalkę mocuje się w przepływających mediach, nakładając niewielką ilość smaru silikonowego na jej dolną powierzchnię, a następnie przytwierdzając ją do szklanej podstawy komory obrazowania.
b. Uwagi dotyczące obrazowania dwufotonowego:
Kilka czynników może spowodować zahamowanie ruchu limfocytów: zbyt wysoka lub zbyt niska temperatura, nadmierna moc lasera, ucisk lub inne uszkodzenia węzła chłonnego oraz brak tlenu. Uszkodzenia spowodowane nadmierną mocą lasera lub temperaturami > ~39°C są nieodwracalne.
Jeśli komórki są słabo widoczne, zazwyczaj lepiej jest zwiększyć wzmocnienie detektora lub zoptymalizować protokół znakowania komórek, zamiast stosować większą moc lasera w celu ich wizualizacji. Może być konieczna optymalizacja znakowania lub ekspresji białek fluorescencyjnych, aby podnieść poziom fluorescencji powyżej poziomu autofluorescencji tła. Przy rozsądnych ustawieniach wzmocnienia i mocy lasera, przesunięcie fluorescencji o około dwa rzędy wielkości powyżej linii bazowej (mierzone za pomocą cytometrii przepływowej) jest wystarczające do wizualizacji komórek.
W przypadku laserów dwufotonowych z regulowaną długością fali, długość fali wykorzystywana do wzbudzenia powinna być nieco mniejsza niż dwukrotność maksimum wzbudzenia jednofotonowego fluoroforu poddawanego obrazowaniu. W eksperymentach dwufotonowych z wykorzystaniem więcej niż jednego znacznika lub białka fluorescencyjnego może być konieczne przeprowadzenie prób z różnymi długościami fali wzbudzenia w celu znalezienia optymalnych ustawień dla obu znaczników. Wzbudzenie dwufotonowe może być również wykorzystane do obrazowania endogennych struktur kolagenowych dzięki wykorzystaniu wewnętrznej niebieskiej generacji drugiej harmonicznej. Generacja drugiej harmonicznej (SHG) zachodzi, gdy dwa fotony łączą się wewnątrz materiału i emitują pojedynczy foton o częstotliwości dwukrotnie większej od fotonów pierwotnych. W tkankach wzbudzenie dwufotonowe występuje, gdy padające światło laserowe jest prostopadłe do wysoko uporządkowanej struktury białkowej, takiej jak kolagen.
Praktyczne kwestie dotyczące obrazowania dwufotonowego zostały omówione w poprzednich przeglądach4, 5.
Dyskusja
W niniejszym protokole wideo przedstawiamy procedury adoptywnego transferu komórek oraz izolacji i przygotowania węzłów chłonnych niezbędne do obrazowania ruchliwości limfocytów w obwodowym węźle chłonnym. Obrazowanie dwufotonowe posiada kilka zalet w stosunku do obrazowania konfokalnego, zarówno w przypadku tkanek eksplantowanych (pokazanych tutaj), jak i w preparatach intravitalnych. W szczególności zastosowanie wzbudzania w podczerwieni minimalizuje rozpraszanie światła i pozwala na obrazowanie na głębokości ~300 µm pod torebką węzła chłonnego, a w niektórych tkankach jeszcze głębiej4. Ponadto wzbudzanie wielofotonowe ogranicza się do punktu ogniskowego obiektywu, co minimalizuje fotowybielanie i uszkodzenia tkanek poza płaszczyzną ogniskowania. Jednak podobnie jak w przypadku każdej nowej techniki, obrazowanie dwufotonowe nie jest panaceum i należy pamiętać o jego ograniczeniach oraz potencjalnych pułapkach5. Należą do nich wymagania, zgodnie z którymi – z wyjątkiem sygnałów endogennych, takich jak generowanie drugiej harmonicznej przez kolagen – komórki będące przedmiotem zainteresowania muszą być znakowane fluorescencyjnie za pomocą sond zewnętrznych lub poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych. Powstaje zatem wrażenie, że znakowane komórki pływają w czarnej próżni, podczas gdy w rzeczywistości są one zanurzone w złożonym środowisku elementów strukturalnych i niezliczonych innych nieznakowanych, niewidocznych komórek i wchodzą z nimi w interakcje.
W ciągu sześciu lat od wprowadzenia obrazowania dwufotonowego do immunologii technika ta pozwoliła badaczom odpowiedzieć na nurtujące od dawna pytania poprzez bezpośrednią wizualizację w nienaruszonych żywych tkankach procesów takich jak oddziaływania międzykomórkowe, motywność i lokalizacja komórek, szlaki sygnalizacji komórkowej oraz zdarzenia cytotoksycznego zabijania komórek. Dziedzina ta szybko ewoluowała poza wstępne opisy fenomenologiczne, a analizy ilościowe wraz z modelowaniem i symulacjami komputerowymi zaczynają teraz wyjaśniać, w jaki sposób pozornie chaotyczne ruchy i oddziaływania komórkowe w węzłach chłonnych prowadzą do wydajnej odpowiedzi immunologicznej. Postęp ten został szczegółowo omówiony w niedawnej publikacji1, w której wymieniono ponad 100 prac opisujących zastosowanie mikroskopii dwufotonowej w obrazowaniu immunologicznym.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Rebeccie Paquette za pomoc w przygotowaniu odczynników. MPM jest wspierany przez stypendium przeddoktoranckie Ruth L. Kirchstein z National Institutes of Health oraz wsparcie z grantów GM-41514 (MDC), NS-48252 (KGC), GM-48071 (IP), również z National Institutes of Health.
Bibliografia
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol. Annu Rev Immunol. , (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
- Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
Przedruki i uprawnienia
