Niniejszy protokół opisuje metodę znakowania i śledzenia losów niewielkich grup komórek w embrionach ryb danio pręgowany poprzez UV-odblokowanie uwięzionej fluoresceiny, a następnie immunoznakowanie całego preparatu w celu wzmocnienia sygnału z odblokowanej fluoresceiny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Znakowanie linii komórkowych ryb danio-pręgowanych za pomocą dekstranu fluoresceiny uwalnianego laserowo
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Centralnym problemem biologii rozwoju jest wywnioskowanie pochodzenia niezliczonych typów komórek występujących u kręgowców, które powstają z niezróżnicowanych prekursorów. Badacze stosowali różne metody znakowania linii komórkowych, takie jak znakowanie DiI1 oraz wstrzykiwanie pod ciśnieniem enzymów śledzących2, aby ustalić los komórek w późniejszych etapach rozwoju w systemach modelowych. Pierwsze mapy losu w rybach danio (Danio rerio) sporządzono poprzez jontoforezę barwników fluorescencyjnych, takich jak dekstran rodamanowy, do pojedynczych komórek w odrębnych obszarach zarodka i śledzenie losu znakowanej komórki w czasie3-5. Choć skuteczne, metody te są wymagające technicznie i wymagają specjalistycznego sprzętu, który nie jest powszechnie dostępny w laboratoriach zajmujących się rybami danio. Ostatnio w badaniach nad rybami danio coraz częściej wykorzystuje się fotokonwertowalne białka fluorescencyjne, takie jak Eos i Kaede, które pod wpływem światła ultrafioletowego nieodwracalnie zmieniają fluorescencję z zielonej na czerwoną6-8. Przejrzystość optyczna zarodka ryby danio oraz względna łatwość transgenezy sprawiły, że stały się one szczególnie atrakcyjnymi narzędziami do znakowania linii komórkowych i obserwacji migracji komórek in vivo7. Mimo swojej użyteczności białka te mają pewne wady w porównaniu z metodami znakowania linii komórkowych za pomocą barwników. Najistotniejszą z nich jest trudność, jaką napotkaliśmy w uzyskaniu wysokiej rozdzielczości 3-D podczas fotokonwersji tych białek. W tym świetle prawdopodobnie najlepsze połączenie rozdzielczości i łatwości zastosowania w znakowaniu linii komórkowych u ryb danio oferuje klatkowany dekstran fluoresceiny — barwnik fluorescencyjny związany z grupą gaszącą, która maskuje jego fluorescencję9. Barwnik ten może zostać następnie „uwolniony z klatki” (odłączony od grupy gaszącej) w konkretnej komórce przy użyciu światła UV z lasera lub lampy rtęciowej, co umożliwia wizualizację jego fluorescencji lub detekcję immunologiczną. W przeciwieństwie do metod jontoforetycznych, klatkowaną fluoresceinę można wstrzykiwać za pomocą standardowych aparatów do iniekcji i uwalniać z klatki przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w otwór regulowany (pinhole)10. Ponadto przeciwciała przeciwko fluoresceinie wykrywają tylko formę uwolnioną z klatki, a epitop dobrze znosi utrwalanie11. Wreszcie, klatkowana fluoresceina może być aktywowana z bardzo wysoką rozdzielczością 3-D, zwłaszcza przy zastosowaniu mikroskopii dwufotonowej12,13. Niniejszy protokół opisuje metodę znakowania linii komórkowych za pomocą klatkowanej fluoresceiny i laserowego uwalniania z klatki. Następnie uwolniona fluoresceina jest wykrywana jednocześnie z innymi epitopami, takimi jak GFP, poprzez znakowanie przeciwciałami.
Protokół
1. Synteza klatkowanej flurosceinowej dekstrany
- Odmierz 3,5 - 4 mg aminodextranu i dodaj do dostarczonej przez firmę Invitrogen barwionej probówki zawierającej 1 mg fluoresceiny SE z klatką CMNB. W naszych doświadczeniach stosunek ten pozwala uzyskać średnie obciążenie rzędu ~ 2,5 cząsteczek barwnika na cząsteczkę dextranu.
- Do probówki dodaj 500 μL buforu 0,1 M Na2B4O7 (boranu sodu).
- Zakręć probówkę i mieszaj na wortexie przez 30 sekund, aby rozpuścić aminodextran i fluoresceinę z klatką.
- Pozostaw do reakcji przez noc na mieszalniku wortexowym.
- Odkręć dolną zaślepkę kolumny wirówkowej Zeba i poluzuj korek. Zaznacz kropkę na kolumnie pisakiem z filcu. Umieść kolumnę w stożkowej probówce o pojemności 15 mL.
- Wiruj przy 1000 x g przez 2 min, tak aby kropka była skierowana w stronę centrum rotora. Użyj kolumny natychmiast po zagęszczeniu.
- Umieść zagęszczoną kolumnę w nowej stożkowej probówce 15-mL.
- Złącz mieszaninę reakcyjną i przenieś ją na środek złoża żywicy w zagęszczonej kolumnie. Zakręć korek.
- Wiruj przy 1000 x g przez 2 min, tak aby kropka była skierowana w stronę centrum rotora. Po wirowaniu eluent i górna część kolumny będą miały zbliżony żółty odcień.
- Przenieś żółty eluent (~350 μL) do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
- Liofilizuj do suchości w SpeedVacu. Przykryj SpeedVac folią.
- Zawiesz otrzymane ~ 2-3 mg bladożółtej piany w wodzie do końcowego stężenia 1% w/v.
- Przechowuj ten roztwór w temperaturze -20 °C w probówkach przykrytych folią. Zaleca się podzielenie roztworu dextranu na alikwoty, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
2. Wstrzykiwanie klatkowanego dekstranu z fluoresceiną do zarodków danio pręgowanego
- Rozcieńczyć roztwór stokowy 1% w/v klatkowanego dekstranu z fluoresceiną w stosunku 1:5 lub 1:10 w 0,2M KCl.
- Wstrzyknąć 0,5 – 1,0 nL roztworu klatkowanej fluoresceiny do żółtka embrionów w stadium jednej komórki, używając wtryskiwacza ciśnieniowego. Po wstrzyknięciu partie embrionów należy przechowywać w ciemności w temperaturze 28,5°C, aby zminimalizować nieswoiste odklatkowanie.
- Ręcznie usunąć choriony z embrionów.
- Zznieczulić embriony w 4% trikainie.
- Embriony zostaną zamontowane w 0,8% agarozie w szalce Petriego o wymiarach 35mmx10mm, a następnie przykryte wodą z jaj.
- Równoważyć roztopioną agarozę w bloku grzewczym o temperaturze 50°C przez co najmniej 15 minut.
- Za pomocą szklanej pipety pobrać jeden embrion w minimalnej ilości wody i przenieść go do agarozy. Uwaga: Ważne jest, aby schłodzić probówkę z agarozą w dłoni przez około 30 sekund przed umieszczeniem w niej embrionu, aby uniknąć jego śmierci.
- Pobrać pipetą embrion z probówki wraz z około 50μL agarozy i wycisnąć zawartość na środek szalki Petriego.
- Szybko ustawić embrion za pomocą plastikowej nitki tak, aby komórki przeznaczone do odklatkowania były skierowane do góry. Uwaga: Agaroza szybko stygnie, dlatego należy sprawnie ustawić embrion. Manipulacje po stwardnieniu agarozy mogą uszkodzić embriony.
- Pozostawić agarozę do całkowitego zestalenia (trwa to kilka minut) i wypełnić szalkę w dwóch trzecich wodą z jaj zawierającą 4% trikainy i 0,003% PTU.
3. Laserowe uwalnianie flurosceninowego dekstranu
- Mikroskop używany do uwalniania z klatek (uncaging) musi być wyposażony w obiektyw imersyjny wodny 40X.
- Stosujemy laser Photonics Instruments z ogniwem barwnikowym 365 nm oraz dichroicznym lustrem dzielącym 70%/30%.
- Przed rozpoczęciem uwalniania z klatek laser musi zostać ustawiony parfokalnie z obiektywem i osłabiony do odpowiedniej mocy.
- Aby ustawić ostrość lasera, należy umieścić pod obiektywem lustrzane szkiełko przedmiotowe i regulować ostrość obiektywu do momentu, aż rysy na szkiełku staną się widoczne.
- Należy regulować tłumik lasera, aż laser będzie w stanie wywołać wyraźnie widoczną rysę w lustrze za pomocą pojedynczego impulsu.
- Należy regulować ostrość obiektywu w górę i w dół. Jeśli laser wywołuje rysę, gdy obiektyw jest poza zakresem ostrości, należy przekręcić regulację ostrości lasera o ¼ obrotu w górę lub w dół. Czynność tę należy powtarzać do momentu, aż laser będzie w stanie zarysować lustro wyłącznie przy ustawionej ostrości obiektywu.
- Należy umieścić zamontowany embrion pod obiektywem i ustawić ostrość na obszarze, z którego nastąpi uwalnianie.
- Aby przeprowadzić uwalnianie, należy ustawić ostrość na interesującej komórce i naświetlić ją 10–20 impulsami z częstotliwością 2–3 Hz.
- Po uwalnianiu z klatek należy uwolnić embrion, oddzielając agar pęsetą i przenosząc go do wody z jajem zawierającej 0,003% PTU. Embriony powinny rozwijać się w szczelnym pudełku odpornym na światło aż do momentu ich utrwalenia.
4. Znakowanie przeciwciałami i detekcja uwolnionej flurosceinowej dekstrany
- Utrwal embriony w utrwalaczu Ab (4% paraformaldehyd, 0,3 mM CaCl2)2, 8% sacharozy, 1X roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, pH 7,3) przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc (O/N) w 4°CPrzez cały czas trwania etapów znakowania przechowywać embriony w szczelnym przed dostępem światła pudełku lub w probówce owiniętej folią aluminiową.
- Usunąć utrwalacz i zastąpić go 100% MeOH, pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej, usunąć MeOH i zastąpić go świeżym 100% MeOH.
- Przechowywać w MeOH w temperaturze -20°C przez co najmniej 30 minut. Uwaga: Próbki można przechowywać w MeOH przez maksymalnie dwa tygodnie, zanim rozpocznie się degradacja epitopów.
- Rehydratyzuj zarodki, wykonując 5-minutowe przemycia w temperaturze pokojowej w kolejno: 75% MeOH/1X soli fosforanowej buforowanej z 0,1% Tween 20 (1X PBSTw), 50% MeOH/50% 1X PBSTw oraz 25% MeOH/75% 1X PBSTw.
- Przemyć trzykrotnie przez 5 minut w 1XPBSTw.
- Jeśli embriony są >24-godzinne zarodki poddać permeabilizacji za pomocą 10 μg/mL proteinaza K w 1XPBSTw. Czas permeabilizacji zależy od etapu rozwoju. Pięć minut w proteinazie K jest wystarczające, jeśli zarodki znajdują się między 24. a 48. godziną po zapłodnieniu (hpf). W przypadku starszych larw może być wymagany dłuższy czas. Ponownie utrwalić w utrwalaczu Ab przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Przemyć pięciokrotnie przez 5 minut w 1XPBSTw w temperaturze pokojowej.
- Inkubować w roztworze blokującym (1XPBS, 0,1% Triton x100, 10% surowicy owczej, 10% albuminy surowicy bydlęcej, 1% dimetylosulfoksydu) przez 1–2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Rozcieńczyć przeciwciała pierwotne (anty-fluoresceinę oraz przeciwciała przeciwko markerom specyficznym dla danego typu komórek) w roztworze blokującym.
- Inkubować zarodki przez noc w temperaturze 4°C w roztworze zawierającym przeciwciała pierwszorzędowe.
- Przemyć cztery razy po 20 minut w 1X roztworze buforu fosforanowego (PBS) z dodatkiem 0,1% Triton x100 (PBSTx) w temperaturze pokojowej.
- Rozcieńczyć przeciwciała wtórne znakowane fluorescencyjnie (zazwyczaj w stosunku 1:300) w roztworze blokującym.
- Inkubować przez noc w temperaturze 4°C w roztworze zawierającym przeciwciała wtórne.
- Przemyć czterokrotnie przez 20 minut w 1XPBSTx w temperaturze pokojowej.
- Przezroczyć zarodki w 50% glicerolu/50% 1XPBS przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej, następnie usunąć mieszaninę glicerolu/PBS, dodać 100% glicerolu i pozostawić przez noc w 4°C.
5. Reprezentatywne wyniki:
Po immunoznakowaniu w komórkach poddanych procesowi uncagingu (uwolnienia z klatki) powinien widnieć obszar o zwiększonym natężeniu barwienia (Rysunek 1). Często obserwuje się stosunkowo wysoki stosunek sygnału do szumu w >48-godzinne zarodki zebrafish, ze względu na spontaniczne uwalnianie fluoresceiny.
Rysunek 1. Markowanie linii komórkowych kompleksu szyszynkowego danio pręgowanego. W 24 hpf część przedniego zrębka szyszynkowego, wyznaczona przez ekspresję foxd3:GFP, została uwolniona z klatek za pomocą impulsów laserowych UV. A) Do 48 hpf z obszaru uwolnienia (białe koło) wyłoniła się lewostronna grupa komórek nazywana ciałem parapinealnym (czerwone koło). B) Sygnał z uwolnionej fluoresceiny jest wzmocniony w ciele parapinealnym (czerwone koło) oraz w narządzie szyszynkowym (białe koło).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jak opisano, niniejszy protokół zapewnia stosunkowo szybką metodę znakowania linii komórkowych u danio pręgowanego, opartą na powszechnie stosowanych technikach mikroiniekcji, mikroskopii i immunofluorescencji. Ustaliliśmy, że odblokowywanie laserowe jest najwydajniejszym i najbardziej opłacalnym sposobem lokalnego odblokowywania fluoresceiny. Metoda ta może być wykorzystana do znakowania linii z punktami końcowymi eksperymentu do 4 dpf. Jednak w miarę podziałów komórek stężenie odblokowanej fluoresceiny w pojedynczej ko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Danowi Carlinowi za pomoc w przygotowaniu klatkowej fluoresceiny. Ponadto chcielibyśmy podziękować następującym źródłom finansowania: Vanderbilt University Medical School Program for Developmental Biology Training Grant dla JAC oraz NIH HD054534 dla JTG.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| Aminodekstran, 10kDa | Invitrogen | D1860 | |
| Kolumny odsalające Zeba desalt spin columns | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| kozie przeciwciało przeciw fluoresceinie | Invitrogen | A11095 | |
| Alexa Fluor 633 osiołcze przeciwciało przeciw kozie | Invitrogen | A21082 | |
| szalki Petriego 35mmx10mm | BD Biosciences | 351008 | |
| Pionowy mikroskop złożony z obiektywem imersyjnym wodnym 40x | Leica Microsystems | DM6000B | |
| Ręczny system iluminacji laserowej MicroPoint | Photonic Instruments | ||
| Fenylotiomocznik (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | |
| Trikaina | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Proteinaza K | Roche Group | 03115836991 | |
| Nitka plastikowa | Dowolny dostawca | ||
| Agaroza | Research Products International Corp. | A20090 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Savant SPD131DDA | |
| Mieszadło wiroksyjne | VWR international | Vortex Genie 2 | |
| Iniektor ciśnieniowy | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
Bibliografia
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina. Science. 239, 1142-1145 (1988).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages. Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis. 44, 136-142 (2006).
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).
- Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. , 9th Edition, 707-711 (2002).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry. Dev Biol. 175, 177-183 (1996).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Posted by JoVE Editors on 5/25/2011. Citeable Link.
A correction was made to Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to:
Ilya A. Shestopalov and James K. Chen
instead of:
Ilya Shestopalov and James Chen
