Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Podsumowanie

Niniejsza praca opisuje prostą technikę indukowania anergii specyficznej dla alloantygenów w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej. Technikę tę można zastosować klinicznie w celu generowania niealloreaktywnych komórek dawcy. Infuzja tych komórek mogłaby poprawić rekonstrukcję immunologiczną i zmniejszyć toksyczność po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

Streszczenie

Allogeniczne przeszczepienie hematopoetycznych komórek macierzystych (AHSCT) daje największą szansę na wyleczenie wielu pacjentów z wrodzonymi i nabytymi chorobami hematologicznymi. Niestety, przeszczepienie alloreaktywnych limfocytów T dawcy, które rozpoznają i uszkadzają zdrowe tkanki pacjenta, może prowadzić do choroby przeszczep kontra gospodarz (GvHD)¹. Jednym z wyzwań w skutecznym AHSCT jest zapobieganie GvHD bez jednoczesnego upośledzenia korzystnych efektów limfocytów T dawcy, w szczególności odbudowy odporności i zapobiegania nawrotom choroby. Można zapobiegać GvHD poprzez nieswoistą deplecję limfocytów T dawcy z graftów komórek macierzystych lub poprzez stosowanie farmakologicznej immunosupresji. Niestety, podejścia te zwiększają ryzyko infekcji i nawrotu choroby^2-4. Alternatywną strategią jest selektywna deplecja alloreaktywnych limfocytów T dawcy po allostymulacji przez antygenprezentujące komórki (APC) biorcy przed przeszczepem. Wczesne badania kliniczne tych strategii allodeplecji poprawiły odbudowę odporności po HSCT z niezgodnością HLA bez nadmiernego występowania GvHD^{5, 6}. Jednak niektóre techniki allodeplecji wymagają specjalistycznej produkcji APC biorcy^{6, 7}, a niektóre podejścia mogą wywoływać efekty pozatarczasowe, w tym deplecję specyficznych dla patogenów limfocytów T dawcy⁸ oraz regulatorowych limfocytów T CD4⁹. Jednym z alternatywnych podejść jest inaktywacja alloreaktywnych limfocytów T dawcy poprzez indukcję hiporeaktywności specyficznej dla alloantygenu. Osiąga się to poprzez stymulowanie komórek dawcy za pomocą APC biorcy przy jednoczesnej blokadzie sygnałów kostymulacji zależnych od CD28¹⁰. To podejście „alloanergyzacji” redukuje alloreaktywność o 1-2 rzędy wielkości, zachowując in vitro odpowiedzi limfocytów T na antygeny związane z patogenami i guzami¹¹. Strategia ta została z powodzeniem zastosowana w 2 zakończonych i 1 trwającym pilotażowym badaniu klinicznym, w których alloanergyzowane limfocyty T dawcy były infundowane w trakcie lub po HSCT z niezgodnością HLA, co skutkowało szybką odbudową odporności, niewielką liczbą infekcji oraz mniej nasiloną ostrą i przewlekłą postacią GvHD w porównaniu do historycznych grup kontrolnych biorców po niezmodyfikowanym przeszczepie z niezgodnością HLA¹². W niniejszym opracowaniu opisujemy nasz aktualny protokół generowania mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC), które zostały poddane alloanergyzacji względem niezgodnych pod względem HLA PBMC stymulatora od niespokrewnionego dawcy. Alloanergyzację osiąga się poprzez allostymulację w obecności przeciwciał monoklonalnych przeciwko ligandom B7.1 i B7.2 w celu zablokowania kostymulacji zależnej od CD28. Technika ta nie wymaga produkcji specjalistycznych APC stymulatora i jest prosta w wykonaniu, wymagając jedynie jednego, stosunkowo krótkiego etapu inkubacji ex vivo. W związku z tym podejście to można łatwo zestandaryzować do użytku klinicznego w celu generowania limfocytów T dawcy o zredukowanej alloreaktywności, ale zachowującej specyficzną dla patogenów odporność, do transferu adoptywnego w ramach AHSCT, aby poprawić odbudowę odporności bez nadmiernego GvHD.

Protokół

1. Przygotowanie PBMC

1. Podczas przeprowadzania niniejszego protokołu należy przestrzegać zasad właściwej techniki aseptycznej oraz środków ostrożności uniwersalnych.
2. Wyizolować PBMC od zdrowych ochotników poprzez wirowanie w gradiencie gęstości z użyciem Ficoll-Hypaque. Alternatywnie można wykorzystać rozmrożone PBMC kriokonserwowane.
3. Policzyć żywe PBMC po barwieniu błękitem trypanowym za pomocą hemocytometru. Resuspender PBMC w pełnej pożywce hodowlanej (CM) do stężenia 1 milion żywych komórek/mL w probówce Falcon o pojemności 15mL.

2. Przygotowanie masowej ko-kultury alloanergyzującej

1. Do przygotowania kultur alloanergizacji potrzebne są PBMC od dwóch oddzielnych dawców. Komórki od jednego dawcy będą pełnić rolę respondenta, a komórki od innego dawcy będą pełnić rolę stymulatora (zwanego stymulatorem Pierwszej Strony).
2. Przenieść 10 milionów PBMC stymulatora w stężeniu 1 milion/ml do probówki Falcon 15 mL i dodać 100mg przeciwciał anty-B7.1 oraz 100mg przeciwciał anty-B7.2 w celu zablokowania kostymulacji. Delikatnie wymieszać zawartość probówki i inkubować przez 30 minut. Warunki inkubacji dla tego oraz wszystkich kolejnych kroków to 37°C/5% CO₂/80% wilgotności
3. Naświetlić PBMC stymulatora (33 Gy) i przenieść do kolby hodowlanej T-25 50cm³ z nakrętką przepuszczalną dla gazów. Oznaczyć kolbę jako „Masowa kokultura alloanergizująca”.
4. Do kolby dodać 10mL PBMC respondenta (w stężeniu 1 milion/ml w CM).
5. Dodać kolejne 100mg przeciwciał anty-B7.1 oraz 100mg przeciwciał anty-B7.2 i delikatnie wymieszać przed umieszczeniem kolby w pozycji pionowej w inkubatorze na 72 godziny

3. Przygotowanie masowej ko-kultury kontrolnej

1. Umieścić 10 milionów stymulujących PBMC (w stężeniu 1 milion/ml) w probówce Falcon 15mL.
2. Naświetlić 10 milionów stymulujących PBMC (33 Gy) i przenieść je do kolby hodowlanej 50cm³. Oznaczyć jako „Bulk control co-culture”.
3. Dodać do kolby 10mL odpowiadających PBMC w stężeniu 1 milion/ml w CM i delikatnie wymieszać przed ustawieniem kolby pionowo w inkubatorze na 72 godziny.

4. Przygotowanie podstawowej reakcji mieszanych limfocytów (MLR) w celu pomiaru skuteczności blokady kostymulującej

1. Skuteczność blokady kostymulującej mierzy się w pierwotnej reakcji mieszanej leukocytów (MLR), którą przygotowuje się z wykorzystaniem PBMC z masowych kokultur alloanergizujących oraz kontrolnych
2. Pierwotną MLR przygotowuje się w tym samym dniu, w którym utworzono kultury masowe
3. Najpierw należy opisać jedną płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery U jako „Primary MLR” dla każdego z trzech mierzonych punktów czasowych (dzień 4, 5 i 6 po przygotowaniu płytek).
4. Przelać 5 mL z każdej z masowych kokultur kontrolnych i alloanergizujących do probówek typu Falcon o pojemności 15 mL.
5. Pipetować 200 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki Falcon do trzech powtórzeń w dołkach na każdej płytce. Dołki z komórkami z masowych kokultur kontrolnych należy opisać jako „no costimulatory blockade (CSB)”, a dołki z komórkami z masowych kokultur alloanergizujących jako „CSB”
6. Do 6 dołków na każdej płytce dodać 200 µL CM jako kontrole negatywne. Do wszystkich pustych dołków należy dodać 200 µL PBS w celu ograniczenia parowania. Płytki umieścić w inkubatorze.

5. Przygotowanie wtórnego MLR w celu pomiaru skuteczności alloanergizacji

1. 72 godziny po przygotowaniu zbiorczych kokultur, resztkowe odpowiedzi allogeniczne w alloanergizowanych PBMC są mierzone w wtórnej reakcji MLR. W wtórnej MLR PBMC zarówno ze zbiorczej alloanergizującej kokultury, jak i ze zbiorczej kokultury kontrolnej są płukane i restymulowane napromieniowanymi PBMC allostymulującymi
2. Aby przygotować wtórną MLR, należy opisać płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery U jako „Secondary MLR” dla każdego z trzech mierzonych punktów czasowych (dzień 3, 5 i 7 po przygotowaniu).
3. Należy pobrać 5mL z każdej ze zbiorczych kokultur kontrolnej i alloanergizującej, przenieść je do probótek Falcon 15mL i wirować przez 5-10 minut przy 2000 rpm. Ostrożnie odessać nadosad, rozbić pellet, dodać 10mL CM i ponownie odwirować komórki. Powtórzyć ten etap płukania.
4. Komórki resuspendować w 1mL CM. Policzyć żywe komórki przy użyciu barwienia błękitem trypanu i dostosować stężenie komórek do 1 miliona żywych komórek responderów/mL.
5. Pipetować 100mL zawiesiny komórkowej z każdej probówki Falcon do trzech powtórzeń w każdym dołku na każdej płytce. Oznaczyć te dołki jako „First Party (FP) allorestimulation”
6. Pipetować 100mL zawiesiny komórkowej z każdej probówki Falcon do kolejnych 3 dołków na każdej płytce i oznaczyć te dołki jako „CD3/28 stimulation”
7. Aby przygotować komórki stymulujące do wtórnej MLR, należy wyizolować PBMC ze świeżej krwi (lub zregenerować kriokonserwowane PBMC) od tego samego zdrowego dawcy, z którego pobrano stymulujące PBMC pierwszej strony do kultur alloanergizujących i kontrolnych.
8. Suspendować PBMC od dawcy FP w stężeniu 1 milion/mL i napromieniować (33Gy)
9. Dodać 100mL napromieniowanych komórek stymulujących do dołków oznaczonych jako „FP allorestimulation”
10. W przypadku kontroli pozytywnych, dodać po 1 mL przeciwciał monoklonalnych CD3 i CD28 oraz 98mL CM do dołków oznaczonych jako „CD3/28 stimulation”. Dodać 200 mL CM do 6 dołków na każdej płytce jako kontrolę negatywną oraz 200mL PBS do pustych dołków. Umieścić płytki w inkubatorze.

6. Pomiar specyficzności alloanergizacji

1. Specyficzność aloanergizacji określa się poprzez porównanie proliferacji komórek responderów pobranych z zakończonych kokultur aloanergizujących i kontrolnych po stymulacji napromieniowanymi PBMC otrzymanymi od zdrowego dawcy „trzeciej strony” (tj. innego dawcy niż Pierwsza Strona) w wtórnej reakcji MLR.
2. Oznacz trzy płytki 96-dołkowe jako „Wtórna specyficzność MLR” Dzień 3, 5 i 7.
3. Pobierz 5mL z każdej z masowych kokultur kontrolnej i aloanergizującej, przenieś do probówek Falcon 15mL i wiruj przez 5-10 minut przy 2000 rpm. Ostrożnie odessij nadsącz, rozbij pellet, dodaj 10mL CM i ponownie odwiruj komórki. Powtórz ten etap płukania.
4. Resuspenduj komórki w 1mL CM. Policz je za pomocą barwienia błękitem trypanu i dostosuj stężenie komórek do 1 miliona żywych komórek responderów/mL.
5. Aby przygotować komórki stymulatora trzeciej strony do wtórnej reakcji MLR, wyizoluj PBMC ze świeżej krwi (lub zregeneruj kriokonserwowane PBMC) od nowego zdrowego dawcy. Pipetuj 100mL zawiesiny komórkowej z każdej probówki Falcon do trzech powtórzeń w dołkach każdej płytki. Oznacz te dołki jako „TP allostimulation”
6. Zawieś PBMC od dawcy TP w stężeniu 1 milion/mL i napromieniuj (33 Gy)
7. Dodaj 200mL napromieniowanych komórek stymulatora TP do dołków oznaczonych jako „TP allostimulation”
8. Specyficzność aloanergizacji można również określić poprzez porównanie proliferacji komórek responderów pobranych z zakończonych kokultur aloanergizujących i kontrolnych po stymulacji patogenem zakaźnym, takim jak CMV. Na tym etapie niezbędne jest użycie PBMC responderów od dawców z wcześniej wykazanymi odpowiedziami proliferacyjnymi na lizat CMV.
9. Oznacz trzy płytki 96-dołkowe jako „Wtórna MLR CMV” Dzień 3, 5 i 7.
10. Aby przygotować komórki responderów do wtórnej reakcji MLR w celu pomiaru odpowiedzi na CMV, przenieś 5 ml z każdej z masowych kokultur kontrolnej i aloanergizującej do probówek 15 ml i wypłucz, policz oraz resuspenduj w stężeniu 1 milion komórek/ml w CM, jak opisano wcześniej. Pipetuj 100mL zawiesiny komórkowej z każdej probówki Falcon do 3 dołków na każdej płytce.
11. Dodaj do dołków 0,1 mL lizatu CMV w 100ul CM
12. Dodaj 200 mL CM do 6 dołków na wszystkich płytkach jako kontrolę negatywną i dodaj 200mL PBS do pustych dołków. Umieść płytki w inkubatorze.

7. Pomiar proliferacji w pierwotnych i wtórnych MLR

1. Proliferację komórek respondera mierzy się za pomocą testu wbudowywania tymidyny w pierwotnych i wtórnych MLR. Proliferację ocenia się w 4., 5. i 6. dniu po przygotowaniu płytek do pierwotnego MLR oraz w 3., 5. i 7. dniu po przygotowaniu płytek do wtórnego MLR.
2. Na 16 godzin przed zbiorem do studni dodaje się 1mCi tymidyny trytowanej
3. Po dodaniu tymidyny trytowanej płytkę inkubuje się przez kolejne 16 godzin, a następnie materiał zbiera się na matę filtracyjną przy użyciu harvestera Tomtec (lub podobnego urządzenia). Matę filtracyjną suszy się na powietrzu przez jedną godzinę, następnie umieszcza w woreczku na próbki, dodaje 5 mL płynu scyntylacyjnego i szczelnie zamyka. Płytkę odczytuje się w liczniku scyntylacyjnym Wallac Micro beta lub podobnym urządzeniu.

8. Obliczanie skuteczności blokady kostymulującej w pierwotnej reakcji MLR

1. Procent hamowania (PI) pierwotnych odpowiedzi allogenicznych oblicza się jako 100 x [średnie cpm w studzienkach allostymulacji (masowa ko-kultura PBMC w stanie aloanergi) - średnie cpm w studzienkach allostymulacji (masowa ko-kultura kontrolna PBMC)}
   

9. Obliczanie skuteczności alloanergizacji w wtórnej reakcji MLR

Wskaźnik PI wtórnych odpowiedzi allogenicznych jest obliczany jako

10. Obliczanie swoistości aloanergyzacji w wtórnej reakcji MLR

1. Po ponownej stymulacji komórek za pomocą CD3 i CD28, allostymulatorów TP lub antygenu CMV, można również obliczyć PI odpowiedzi na te bodźce, korzystając z powyższego wzoru. Pozwala to na określenie swoistości procesu alloanergizacji

11. Generowanie alloanergicznych PBMC od dawcy do zastosowań klinicznych po allogenicznym przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT)

1. Alloanergizowane PBMC dawcy do użytku klinicznego można wygenerować po allogenicznym przeszczepieniu komórek macierzystych krwi obwodowej (HSCT) z niedopasowaniem HLA, stosując opisany powyżej protokół
2. Podczas generowania komórek do użytku klinicznego, PBMC respondenta pozyskuje się od dawcy HSCT, a PBMC stymulatora od biorcy HSCT przed transplantacją.
3. Przy generowaniu PBMC do użytku klinicznego wszystkie etapy są wykonywane zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP) w akredytowanych ośrodkach przetwarzania komórek macierzystych.
4. Przed dopuszczeniem komórek do użytku klinicznego przeprowadza się dodatkowe testy kontroli jakości, w tym testy na obecność endotoksyn, barwienie metodą Grama oraz posiewy, aby spełnić kryteria bezpieczeństwa

12. Reprezentatywne wyniki

Przy użyciu PBMC stymulatora i respondenta niedopasowanych pod względem HLA, obecność blokady kostymulującej w pierwotnej reakcji MLR redukuje średnią alloproliferację PBMC respondenta w 5. dniu do około 30% (+/- 10%, średnia +/- odchylenie standardowe) wartości obserwowanej w kontrolnej pierwotnej reakcji MLR bez blokady kostymulującej. Odpowiada to średniemu zahamowaniu pierwotnej alloproliferacji na poziomie około 70% (+/- 10%) w D5, Rycina 1 A i B.

W wtórnej reakcji MLR w 5. dniu, alloproliferacja FP alloanergetycznych PBMC wynosi zazwyczaj 10-15% (+/- 10%) wartości obserwowanej dla kontrolnych PBMC, co odpowiada średniemu zahamowaniu proliferacji na poziomie 85-90% (+/- 10%), Rysunek 2A i B. Dowodzi to, że alloanergetyczne PBMC są hiporeaktywne na allostymulatory FP.

W przeciwieństwie do tego, alloanergiczne PBMC zazwyczaj zachowują 70-100% swojej zdolności do proliferacji w odpowiedzi na mitogeny (przeciwciała CD3/CD28), allostymulatory TP oraz lizat CMV (u dawców reaktywnych na CMV). Dowodzi to, że hiporeaktywność alloanergicznych PBMC jest specyficzna dla alloantygenów FP.

Rycina 1. A.Proliferacja (oznaczona poprzez wbudowywanie tymidyny) w pierwotnej reakcji limfocytów mieszanych (MLR) z wykorzystaniem niedopasowanych pod kątem HLA komórek mononuklearnych krwi obwodowej (PBMC) stymulatora i respondenta w obecności lub przy braku blokady kostymulującej z użyciem humanizowanych przeciwciał monoklonalnych anty-B7.1 i -B7.2. Wyniki przedstawiono jako średnią (+/-odchylenie standardowe) dla 8 reprezentatywnych eksperymentów z użyciem unikalnych par stymulator-respondent. B. Procentowa inhibicja alloproliferacji w pierwotnych MLR przeprowadzonych w obecności blokady kostymulującej z użyciem humanizowanych przeciwciał monoklonalnych anty-B7.1 i -B7.2. Wyniki przedstawiono jako średnią (+/-odchylenie standardowe) dla tych samych 8 unikalnych par stymulator-respondent przedstawionych na Rycinie 1A.

Rysunek 2. A. Proliferacja (oznaczona poprzez wbudowywanie tymidyny) w wtórnych reakcjach MLR, w których PBMC odpowiadające z pierwotnych MLR przeprowadzonych wobec braku (PBMC kontrolne) lub obecności blokady kostymulującej (PBMC alloanergiczne) są restymulowane napromieniowanymi stymulatorami pierwszej strony. Wyniki przedstawiono jako średnią (+/-odchylenie standardowe) dla 8 unikalnych par stymulator-responder przedstawionych na Rysunku 1. B. Procentowa inhibicja alloproliferacji pierwszej strony w wtórnych reakcjach MLR, w których PBMC odpowiadające z pierwotnych MLR przeprowadzonych wobec braku (PBMC kontrolne) lub obecności blokady kostymulującej (PBMC alloanergiczne) są restymulowane napromieniowanymi stymulatorami pierwszej strony. Wyniki przedstawiono jako średnią (+/-odchylenie standardowe) dla 8 unikalnych par stymulator-responder przedstawionych na Rysunku 1 oraz Rysunku 2A.

Dyskusja

Indukcja hiporeaktywności specyficznej dla alloantygenu, czyli anergii, w PBMC dawcy poprzez alostymulację w obecności blokady kostymulacyjnej jest prostą techniką generowania PBMC dawcy o zredukowanej aloreaktywności. Opracowaliśmy ten proces w laboratorium i obecnie stosujemy tę strategię w praktyce klinicznej w celu uzyskania PBMC dawcy o zredukowanej aloreaktywności do infuzji po allogenicznym HSCT z niedopasowaniem HLA. Celem zastosowania takiej terapii jest poprawa reconstitucji immunologicznej bez nadmiernej toksyczności. Choć nasze obecne kliniczne zastosowanie tej strategii ogranicza się do kontekstu allogenicznego HSCT, podejście to mogłoby zostać zastosowane w innych sytuacjach, w których uszkodzenia tkanek są powodowane przez niepożądane odpowiedzi limfocytów T, takich jak odrzucanie transplantacji narządów stałych czy schorzenia autoimmunologiczne.

Do blokowania sygnałów kostymulujących zależnych od CD28 podczas procesu współhodowli w alloanergizacji można zastosować kilka odczynników. W niniejszej procedurze opisujemy nasz aktualny protokół z wykorzystaniem humanizowanych mysich przeciwciał monoklonalnych klasy klinicznej skierowanych przeciwko ligandom CD28 (B7.1 i B7.2). Mysie przeciwciała antyludzkie B7.1 i B7.2 klasy nieklinicznej są dostępne komercyjnie u kilku producentów. Alternatywnie, do blokowania kostymulacji CD28 podczas procesu alloanergizacji można użyć białka fuzyjnego CTLA4-Ig (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4-Immunoglobulin). CTLA4-Ig, składający się z części zewnątrzkomórkowej cząsteczki CTLA4 połączonej z receptorem Fc gamma IgG, wiąże się z wysokim powinowactwem do B7.1 i B7.2. Zastosowanie CTLA4-Ig skutkuje podobną skutecznością i specyficznością alloanergizacji ludzkich PBMC.

Technika alloanergetyzacji jest prosta w wykonaniu. Do procesu można wykorzystać świeże lub wcześniej kriokonserwowane PBMC stymulatora bez istotnych różnic w końcowym wyniku. Wymaganie jedynie jednego, stosunkowo krótkiego etapu inkubacji ex vivo, bez konieczności stosowania procedur sortowania komórek, minimalizuje ryzyko śmierci komórek oraz ich kontaminacji bakteryjnej przed infuzją, co sprawia, że strategia ta jest stosunkowo łatwa do zastosowania w skali klinicznej.

Jednym z ograniczeń opisywanego przez nas podejścia (oraz innych metod selektywnego zmniejszania alloreaktywności komórek ludzkich) jest brak testu w czasie rzeczywistym pozwalającego określić pozostałą alloreaktywność. Testy proliferacji wymagają od 3 do 5 dni w celu potwierdzenia zmniejszenia alloreaktywności, a komórki przygotowane do zastosowania klinicznego muszą zostać przetoczone, zanim wyniki tych testów będą dostępne. Co więcej, pomiar proliferacji PBMC poprzez wbudowywanie tymidyny, choć jest łatwy do wykonania, mierzy proliferację limfocytów B oraz innych podzbiorów komórek oprócz proliferacji limfocytów T. Jako alternatywny test można zastosować rozcieńczanie barwnika CFSE w odpowiadających PBMC, co pozwala na oznaczenie alloproliferacji specyficznej dla podzbiorów limfocytów T. Jednym ze sposobów poprawy zastosowania klinicznego naszej strategii byłoby opracowanie i walidacja testu alloreaktywności, którego wykonanie zajmuje zaledwie kilka godzin, co umożliwiłoby jego przeprowadzenie przed zwolnieniem alloanergizowanych komórek do użytku klinicznego.

Oprócz wykazania skuteczności strategii, istotne jest również potwierdzenie swoistości procesu alloanergizacji. Można to łatwo przeprowadzić poprzez oznaczenie względnego zachowania alloresponsi swoistych dla allostymulatorów pochodzących od osób trzecich, a w przypadku alloanergizacji komórek donora reaktywnych na CMV – poprzez zachowanie odpowiedzi proliferacyjnej na CMV

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamycyna	Invitrogen	15750-060
Ludzka surowica AB (inaktywowana ciepłem)	Gemini Bio Products	100-512	Stosować partie zwalidowane
Pełna pożywka hodowlana (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml surowicy AB, 5ml Hepesu, 5 ml glutaminy, 167µL gentamycyny
Naświetlacz	GammaCell 1000
Flaski do hodowli komórkowych T-25 z nakrętkami przepuszczającymi gazy	Corning	3056
Humanizowane przeciwciała monoklonalne anty-B7.1 i anty B7.2			Patrz w tekście protokołu
96-dołkowe płytki hodowlane o dnie w kształcie litery U	BD Biosciences	353077
Przeciwciało monoklonalne CD3	Beckman Coulter Inc.	IM0178	Rekonstytuować w 200ml wody destylowanej
Przeciwciało monoklonalne CD28	Beckman Coulter Inc.	IM1376	Rekonstytuować w 200ml wody destylowanej
Antygen CMV klasy 2	Microbix	EL-01-02
Trytyzowana tymydyna	NEN	NET027
Płyn scyntylacyjny	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester (zbieracz)	Tomtec
Drukarka do filtrów Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Worek na filtry	PerkinElmer, Inc.	1450-432
Licznik scyntylacyjny 1450 MicroBeta TriLux	Wallac
null