Artykuł metodologiczny

Siedem kroków do uzyskania komórek gwiaździstych

DOI:

10.3791/2710

⸱

10 maja 2011

 ,  , 
1Immune Disease Institute, Program in Cellular and Molecular Medicine at Children's Hospital, Department of Pathology, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę izolacji komórek gwiaździstych wątroby z wątroby myszy. W celu oczyszczenia komórek gwiaździstych, wątroby mysie są trawione in situ oraz in vitro przy użyciu pronazy i kolagenazy przed przeprowadzeniem wirowania w gradiencie gęstości. Technika ta pozwala na uzyskanie wysoce czystych komórek gwiaździstych wątroby.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki gwiaździste wątroby są komórkami rezydującymi w wątrobie o morfologii przypominającej gwiazdę, zlokalizowanymi w przestrzeni Dissego pomiędzy śródbłonkowymi komórkami sinusoidalnymi wątroby a hepatocytami1,2. Komórki gwiaździste pochodzą z prekursorów szpiku kostnego i magazynują do 80% całkowitej ilości witaminy A w organizmie1, 2. Po aktywacji komórki gwiaździste różnicują się w miofibroblasty, które produkują macierz pozakomórkową, przyczyniając się tym samym do włóknienia wątroby3. Ze względu na zdolność do kurczenia się, miofibroblastyczne komórki gwiaździste mogą regulować napięcie naczyniowe związane z nadciśnieniem wrotnym4. Niedawno wykazaliśmy, że komórki gwiaździste wątroby są silnymi komórkami prezentującymi antygen i mogą aktywować komórki NKT, a także konwencjonalne limfocyty T5.

Przedstawiamy metodę efektywnego przygotowania komórek gwiaździstych wątroby z wątroby mysiej. Ze względu na ich lokalizację okołonaczyniową, izolacja komórek gwiaździstych wątroby jest procesem wieloetapowym. Aby umożliwić izolację komórek gwiaździstych z przestrzeni Dissego, wątroby myszy poddaje się perfuzji in situ enzymami trawiennymi: pronazą E i kolagenazą P. Po perfuzji tkanka wątroby zostaje poddana dodatkowej obróbce enzymatycznej pronazą E i kolagenazą P in vitro. Następnie metoda wykorzystuje obecność ogromnej ilości kropli lipidowych magazynujących witaminę A w komórkach gwiaździstych wątroby. Cecha ta pozwala na oddzielenie komórek gwiaździstych od innych typów komórek wątrobowych poprzez wirowanie w gradiencie 8% Nycodenz. Opisany tutaj protokół pozwala na uzyskanie wysokiej czystości i homogennej populacji komórek gwiaździstych. Czystość preparatów można ocenić poprzez barwienie na cząsteczkę markerową białko kwaśne włókienka glejowa (GFAP), przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej. Ponadto mikroskopia świetlna ujawnia charakterystyczny wygląd gwiazdkowatych komórek gwiaździstych wątroby, które zawierają duże ilości kropli lipidowych.

Podsumowując, przedstawiamy szczegółowy protokół wydajnej izolacji komórek gwiaździstych wątroby, zawierający reprezentatywne obrazy ich morfologii oraz ekspresji GFAP, które pomagają w definiowaniu charakterystyki komórek gwiaździstych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Należy używać myszy C57BL/6 w wieku ok. 20 tygodni lub starszych. Zaleca się stosowanie samców myszy o masie 25-30g. Wydajność izolacji komórek gwiaździstych można zwiększyć, podając myszom dietę wzbogaconą w witaminę A przez 2 miesiące przed izolacją komórek. Z wątroby jednej myszy C57BL/6 można oczyścić około 2x105 wątrobowych komórek gwiaździstych, podczas gdy wydajność w przypadku myszy Balb/c jest znacznie wyższa. Poniższy protokół został dostosowany do 5 myszy. Opieka nad zwierzętami oraz eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki gwiaździste wątroby regulują kluczowe procesy fizjologiczne i patofizjologiczne w wątrobie. Ponadto komórki gwiaździste posiadają właściwości prezentujące antygen, co czyni je istotnym elementem odpowiedzi immunologicznej wątroby. Chociaż komórki gwiaździste wątroby stanowią 10-15% całkowitej liczby komórek w wątrobie, ich izolacja jest trudna ze względu na lokalizację w okozatokowej przestrzeni Dissego.

Przedstawiamy prostą metodę izolacji komórek gwiaździstych wątroby z wątrób mys.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była finansowana przez Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research oraz NIH RO1 AI083426-01 (F.W.). Patrick Maschmeyer i Melanie Flach otrzymali wsparcie w ramach stypendiów doktoranckich fundacji Boehringer Ingelheim Foundation.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sito do komórek 70μmBD Biosciences352350
CaCL2 x 2H2OSigma-AldrichC3306
Kolagenaza PRoche Group11249002001
DMEMGIBCO, by Life Technologies11960
DNaza IRoche Group10104159001
DPBSCellgro21-031-cv
EGTAFluka3777
Płodowa surowica bydlęcaGIBCO, by Life Technologies16000
GlukozaSigma-AldrichG7528
Probówki do wirowania gradientowegoGreiner Bio-One163160
HEPESGIBCO, by Life Technologies15630
KCLSigma-AldrichP9541
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
L-glutaminaGIBCO, by Life Technologies25030
MgCl2 x 6H2OFluka63068
MgSO4 x 7H2OSigma-AldrichM2773
Na2HPO4 x 2H2OFluka71643
NaClSigma-AldrichS3014
NaH2PO4 x H2OFluka71507
NaHCO3Fluka71628
NycodenzAccudenz AGAN7050/BLK
Penicylina/streptomycynaGIBCO, by Life Technologies15140
Pompa perystaltycznaCole-ParmerHV-7523-70
Czerwony fenolSigma-AldrichP4633
Pronaza ECalbiochem7433-2
Wężyk silikonowyMasterflex (Cole PalmerHV-96440-14
Pirowinian soduGIBCO, by Life Technologies11360
Kolba do hodowli tkankowych (25cm2)BD Biosciences353108
Kaniula motylkowaTerumo Medical Corp.1SV27EL

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
  2. Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki gwia dziste w trobyizolacja w troby myszywirowanie w gradiencie g sto ciseparacja w gradiencie Nycodenztrawienie pronaz Etraktowanie kolagenaz Pekspresja markeru GFAPmikroskopia fluorescencyjnaanaliza cytometrycznaprotok perfuzji w troby

Powiązane artykuły