W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę izolacji komórek gwiaździstych wątroby z wątroby myszy. W celu oczyszczania komórek gwiaździstych, wątroby mysie poddawane są trawieniu in situ oraz in vitro przy użyciu pronazy i kolagenazy przed przeprowadzeniem wirowania w gradiencie gęstości. Technika ta pozwala na uzyskanie wysokiej czystości komórek gwiaździstych wątroby.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Siedem kroków do uzyskania komórek gwiaździstych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki gwiaździste wątroby są rezydującymi w wątrobie komórkami o morfologii przypominającej gwiazdę, zlokalizowanymi w przestrzeni Disse’a pomiędzy sinusoidalnymi komórkami śródbłonka wątroby a hepatocytami1,2. Komórki gwiaździste pochodzą z prekursorów szpiku kostnego i magazynują do 80% całkowitej ilości witaminy A w organizmie1, 2. Po aktywacji komórki gwiaździste różnicują się w myofibroblasty, które produkują macierz pozakomórkową, przyczyniając się tym samym do włóknienia wątroby3. Dzięki zdolności do kurczenia się, myofibroblastyczne komórki gwiaździste mogą regulować napięcie naczyniowe związane z nadciśnieniem wrotnym4. Niedawno wykazaliśmy, że komórki gwiaździste wątroby są potężnymi komórkami prezentującymi antygen i mogą aktywować zarówno komórki NKT, jak i konwencjonalne limfocyty T5.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę wydajnego przygotowania komórek gwiaździstych wątroby z wątroby mysiej. Ze względu na ich perysinusoidalną lokalizację, izolacja komórek gwiaździstych wątroby jest procesem wieloetapowym. Aby umożliwić izolację komórek gwiaździstych z przestrzeni Disse'a, wątroby mysie są perfundowane in situ enzymami trawiennymi: Pronazą E i Kolagenazą P. Po perfuzji tkanka wątroby poddawana jest dodatkowej obróbce enzymatycznej z użyciem Pronazy E i Kolagenazy P in vitro. Następnie metoda wykorzystuje obecność ogromnej liczby kropli lipidowych magazynujących witaminę A w komórkach gwiaździstych wątroby. Cecha ta pozwala na oddzielenie komórek gwiaździstych od innych typów komórek wątroby poprzez wirowanie w 8% gradiencie Nycodenzu. Opisany tutaj protokół pozwala na uzyskanie wysoce czystej i homogennej populacji komórek gwiaździstych. Czystość preparatów można ocenić poprzez barwienie na cząsteczkę markerową – kwaśne białko włókieniste gleju (GFAP), przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej. Ponadto mikroskopia świetlna ujawnia charakterystyczny wygląd gwieździstych komórek gwiaździstych wątroby, które zawierają dużą liczbę kropli lipidowych.
Podsumowując, przedstawiamy szczegółowy protokół wydajnej izolacji komórek gwiaździstych wątroby, obejmujący reprezentatywne obrazy ich morfologii oraz ekspresji GFAP, które pomagają zdefiniować tożsamość komórek gwiaździstych.
Protokół
Należy używać myszy C57BL/6 w wieku około 20 tygodni lub starszych. Zaleca się stosowanie samców myszy o masie 25-30g. Wydajność izolacji komórek gwiaździstych można zwiększyć, podając myszom dietę wzbogaconą w witaminę A przez 2 miesiące przed izolacją tych komórek. Z wątroby jednej myszy C57BL/6 można oczyścić około 2x105 wątrobowych komórek gwiaździstych, natomiast wydajność uzyskiwana z myszy Balb/c jest znacznie wyższa. Poniższy protokół został dostosowany do 5 myszy. Opieka nad zwierzętami i eksperymenty były prowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC).
1. Perfuzja in situ wątrób myszy enzymami trawiennymi
- Podgrzać bufor SC1 oraz roztwory do perfuzji enzymatycznej w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
- Zamocować skrzydłowy zestaw do infuzji do silikonowej rurki pompy perystaltycznej.
- Zkalibrować pompę za pomocą PBS, aby uzyskać przepływ laminarny wynoszący 6,5ml/min, który będzie stosowany podczas perfuzji wątroby in situ. Przepłukać silikonową rurkę roztworem SC1 w celu równoważenia.
- Uśpić mysz poprzez podanie dootrzewnowe roztworu ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg), a następnie sprawdzić zanik odruchów, aby upewnić się, że zwierzę znajduje się w stanie głębokiej narkozy.
- Utrzymać mysz w pozycji grzbietnej na odpowiedniej podstawie.
- Za pomocą nożyczek i pęsety wykonać podłużne nacięcie skóry brzucha i odsłonić otrzewną.
- Ostrożnie otworzyć otrzewną i przesunąć jelita z jamy brzusznej na lewą stronę zwierzęcia, aby odsłonić żyłę wrotną.
- Wprowadzić kaniulę zestawu do infuzji do żyły wrotnej. Na tym etapie zaleca się użycie stereomikroskopu.
- Rozpocząć perfuzję wątroby 30ml roztworu SC1. Natychmiast po uruchomieniu przepływu otworzyć żyłę główną dolną. O skutecznym wypłukaniu wątroby świadczy utrata koloru tkanki wątrobowej.
- Przeprowadzić perfuzję wątroby 30ml roztworem pronazy E. Po skutecznym trawieniu płaty wątroby opuchną, a zraziki staną się wyraźnie widoczne przez torebkę.
- Przeprowadzić perfuzję wątroby 30ml roztworem kolagenazy P. Na tym etapie wątroba traci swój kształt i staje się atoniczna oraz amorficzna.
- Ostrożnie oddzielić wątrobę od przepony i otaczających organów, a następnie umieścić ją w 70ml roztworu SC2 na lodzie.
- Powtórzyć procedurę dla kolejnych myszy.
2. Trawienie in vitro wątrób myszy
Wszystkie kolejne etapy pracy należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Za pomocą ostrych nożyczek pokrój wątroby na kawałki o wymiarach około 2x2x2mm3.
- Połącz zawiesinę 70ml SC2 zawierającą kawałki wątroby z 50ml roztworu Pronazy E-Kolagenazy P i dodaj 1ml roztworu DNazy I.
- Traw wątroby przez 20min w temperaturze 37°C przy ciągłym mieszaniu.
3. Wirowanie w gradiencie gęstości
- Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitka komórkowe 70μm do 6 probówek Falcon 50ml i uzupełnij objętość do 50ml buforem SC2. Wiruj przez 10min przy 600g i 4°C.
- Ostrożnie odessij 40ml supernatantu, następnie dodaj 150μl roztworu DNazy I do każdej probówki i resuspenduj komórki.
- Połącz zawiesiny komórkowe w 4 probówkach Falcon 50ml i przemyj je GBSS-B, a następnie wiruj przez 10min przy 600g i 4°C.
- Ostrożnie odessij jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu, i dodaj 150μl roztworu DNazy I do każdej probówki. Resuspenduj osady komórkowe w 10ml GBSS-B na probówkę.
- Połącz komórki w 2 probówkach Falcon 50ml i dodaj GBSS-B do całkowitej objętości 36ml na probówkę. Dodaj 14ml roztworu Nycodenz do każdej probówki i dobrze wymieszaj.
- Przenieś 10ml zawiesiny komórkowej do jednej probówki do wirowania gradientowego 12ml, co da łącznie 10 probówek. Ostrożnie nałóż na wierzch zawiesiny komórkowej 1,5ml GBSS-B na probówkę.
- Wiruj gradienty przez 15min przy 1500g i 4°C bez hamowania. W rezultacie hepatocyty utworzą osad na dnie probówki, natomiast komórki gwiaździste znajdą się w interfazie w postaci białego pierścienia.
- Ostrożnie pobierz interfazę zawierającą komórki gwiaździste i przemyj je GBSS-B; wiruj przez 10min przy 600g i 4°C.
- Odessij supernatant i resuspenduj komórki w 20ml DMEM uzupełnionego o 10% inaktywowanej termicznie FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 2mM L-glutaminy, 1mM pirogronianu sodu oraz 10mM HEPES. Przenieś komórki do kolb hodowlanych w stężeniu 2x104 komórek/cm2. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C i 5% CO2.
- Wymień medium, gdy tylko komórki gwiaździste wątroby przywrą do podłoża (około 2h po przygotowaniu), aby wypłukać martwe komórki i szczątki komórkowe.
- Następnego dnia komórki gwiaździste powinny rozwinąć charakterystyczną morfologię w kształcie gwiazdy z pęcherzykami lipidowymi magazynującymi witaminę A w obszarze okojądrowym.
- W kolejnych eksperymentach komórki gwiaździste wątroby można łatwo odłączyć od niepowlekanych powierzchni plastikowych, używając łagodnych roztworów enzymatycznych, np. Accutase.
4. Reprezentatywne wyniki:
Po przygotowaniu komórek gwiaździstych wątroby zgodnie z podanym protokołem, czystość wyizolowanej populacji można zweryfikować, biorąc pod uwagę trzy główne cechy tego typu komórek, takie jak kształt przypominający gwiazdę, perinuklearne krople lipidowe oraz ekspresja białka kwaśnego włókienka glejowego (GFAP). Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające charakterystyczny wygląd komórek gwiaździstych wątroby 2h po izolacji, a także w 1. i 3. dniu hodowli in vitro, przedstawiono na Ryc. 1. Ryc. 2 przedstawia reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne GFAP w komórkach gwiaździstych wątroby, które były hodowane przez 3 dni po izolacji. Komórki gwiaździste wątroby różnicują się w komórki miofibroblastyczne podczas hodowli in vitro. Charakterystyczną cechą tych aktywowanych komórek gwiaździstych jest ekspresja aktyny gładkokomórkowej alfa (αSMA). Ryc. 3 przedstawia barwienie immunofluorescencyjne αSMA oraz miozyny IIA w aktywowanych komórkach gwiaździstych w 7. dniu hodowli in vitro.
Rycina 1. Charakterystyczna morfologia komórek gwiaździstych wątroby. Komórki gwiaździste wyizolowano z wątrób myszy zgodnie z podanym protokołem. Obrazy przedstawiają komórki gwiaździste 2h po izolacji (a, b), a także w dniu 1 (c) i dniu 3 (d) hodowli in vitro. Komórki gwiaździste wątroby wykazują dużą ilość pęcherzyków lipidowych w obszarach okołojądrowych i nabierają swojej charakterystycznej morfologii gwiaździstej w ciągu pierwszych dni hodowli in vitro (powiększenie 200x).
Rysunek 2. Komórki gwiaździste wątroby specyficznie wykazują ekspresję GFAP w wątrobie. Komórki gwiaździste zostały wyizolowane i poddane barwieniu immunofluorescencyjnemu na GFAP (czerwony) w 3. dniu hodowli in vitro. Jądra komórkowe przedstawiono w kolorze niebieskim (barwienie Hoechst).
Rycina 3. Komórki gwiaździste wątroby różnicują się w myofibroblasty. Komórki gwiaździste wątroby wyizolowane od myszy C57BL/6 hodowano przez 7 dni. Następnie przeniesiono je na szkiełka komorowe i zabarwiono na aSMA (kolor czerwony) oraz miozynę IIA (kolor zielony). Jądra komórkowe skontrastowano barwieniem Hoechst (kolor niebieski).
| Bufor SC1 | |
| EGTA | 190mg |
| Glukoza | 900mg |
| HEPES | 10 ml roztworu stokowego 1M |
| KCl | 400mg |
| Na2HPO4 x 2 H2O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH2PO4 x H2O | 78mg |
| NaHCO3 | 350mg |
| Czerwony fenol | 6mg |
| dH2O | dopełnić do 1l |
| Bufor SC2 | |
| CaCl2 x 2H2O | 560mg |
| HEPES | 10ml roztworu stokowego 1M |
| KCl | 400mg |
| Na2HPO4 x 2 H2O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH2PO4 x H2O | 78mg |
| NaHCO3 | 350mg |
| Czerwony fenol | 6mg |
| dH2O | dopełnić do 1l |
| Bufor GBSS-A | |
| KCl | 370mg |
| CaCl2 x 2H2O | 225mg |
| Glukoza | 991mg |
| KH2PO4 | 30mg |
| MgCl2 x 6 H2O | 210mg |
| MgSO4 x 7 H2O | 70mg |
| Na2HPO4 x 2 H2O | 75mg |
| NaHCO3 | 227mg |
| Czerwony fenol | 6mg |
| dH2O | dopełnić do 1l |
| Bufor GBSS-B | |
| CaCl2 x 2H2O | 225mg |
| Glukoza | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH2PO4 | 30mg |
| MgCl2 x 6 H2O | 210mg |
| MgSO4 x 7 H2O | 70mg |
| Na2HPO4 x 2 H2O | 75mg |
| NaCl | 8g |
| NaHCO3 | 227mg |
| Czerwony fenol | 6mg |
| dH2O | dopełnić do 1l |
| Roztwór perfuzyjny Pronase E | |
| Pronase E | 100mg (4000 PU/mg min) |
| Bufor SC2 | 200ml |
| Roztwór perfuzyjny Kolagenaza P | |
| Kolagenaza P | 85mg (1.78 U/mg lyo) |
| Bufor SC2 | 200ml |
| Roztwór Pronase E-Kolagenaza P | |
| Pronase E | 50mg (4000 PU/mg min) |
| Kolagenaza P | 85mg (1.78 U/mg lyo) |
| Bufor SC2 | 50ml |
| Roztwór DNaza I | |
| DNaza I | 6mg (ok. 2000U/mg) |
| GBSS-B | 3ml |
| Roztwór Nycodenz | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS-A | 28ml |
Tabela 1. Bufory i roztwory enzymów wymagane do izolacji komórek gwiaździstych wątroby. pH wszystkich buforów należy dostosować do wartości 7,3-7,4. Ponadto zaleca się sterylną filtrację wszystkich buforów. Ważne jest, aby dostosować ilość użytego enzymu do podanej aktywności enzymatycznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Komórki gwiaździste wątroby regulują kluczowe procesy fizjologiczne i patofizjologiczne w wątrobie. Ponadto komórki gwiaździste posiadają właściwości prezentacji antygenu, co czyni je istotnym elementem odpowiedzi immunologicznej wątroby. Chociaż komórki gwiaździste wątroby stanowią 10-15% całkowitej liczby komórek w wątrobie, ich izolacja jest trudna ze względu na lokalizację w okozatokowej przestrzeni Dissego.
Przedstawiamy prostą metodę izolacji komórek gwiaździstych wątroby z wątrób mys...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana z funduszy Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research oraz NIH RO1 AI083426-01 (F.W.). Patrick Maschmeyer i Melanie Flach otrzymali wsparcie w ramach stypendiów doktoranckich z Boehringer Ingelheim Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 70μSito do oddzielania komórek | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCl22 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Kolagenaza P | Grupa Roche | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, firmy Life Technologies | 11960 | |
| DNaza I | Grupa Roche | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Płodowa surowica bydlęca | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Probówki do wirowania w gradiencie stężeń | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-glutamina | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl₂2 x 6 h2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO₄4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO33 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicylina/streptomycyna | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Pompa perystaltyczna | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Czerwień fenolowa | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronaza E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Rurka silikonowa | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| pirowinian sodu | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Kolba do hodowli tkankowej (25 cm²)2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Zestaw do infuzji z motylkiem | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
Bibliografia
- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
- Minicis, S. D. e Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
