Siedem kroków do uzyskania komórek gwiaździstych

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę izolacji komórek gwiaździstych wątroby z wątroby myszy. W celu oczyszczania komórek gwiaździstych, wątroby mysie poddawane są trawieniu in situ oraz in vitro przy użyciu pronazy i kolagenazy przed przeprowadzeniem wirowania w gradiencie gęstości. Technika ta pozwala na uzyskanie wysokiej czystości komórek gwiaździstych wątroby.

Streszczenie

Komórki gwiaździste wątroby są rezydującymi w wątrobie komórkami o morfologii przypominającej gwiazdę, zlokalizowanymi w przestrzeni Disse’a pomiędzy sinusoidalnymi komórkami śródbłonka wątroby a hepatocytami^1,2. Komórki gwiaździste pochodzą z prekursorów szpiku kostnego i magazynują do 80% całkowitej ilości witaminy A w organizmie^{1, 2}. Po aktywacji komórki gwiaździste różnicują się w myofibroblasty, które produkują macierz pozakomórkową, przyczyniając się tym samym do włóknienia wątroby³. Dzięki zdolności do kurczenia się, myofibroblastyczne komórki gwiaździste mogą regulować napięcie naczyniowe związane z nadciśnieniem wrotnym⁴. Niedawno wykazaliśmy, że komórki gwiaździste wątroby są potężnymi komórkami prezentującymi antygen i mogą aktywować zarówno komórki NKT, jak i konwencjonalne limfocyty T⁵.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę wydajnego przygotowania komórek gwiaździstych wątroby z wątroby mysiej. Ze względu na ich perysinusoidalną lokalizację, izolacja komórek gwiaździstych wątroby jest procesem wieloetapowym. Aby umożliwić izolację komórek gwiaździstych z przestrzeni Disse'a, wątroby mysie są perfundowane in situ enzymami trawiennymi: Pronazą E i Kolagenazą P. Po perfuzji tkanka wątroby poddawana jest dodatkowej obróbce enzymatycznej z użyciem Pronazy E i Kolagenazy P in vitro. Następnie metoda wykorzystuje obecność ogromnej liczby kropli lipidowych magazynujących witaminę A w komórkach gwiaździstych wątroby. Cecha ta pozwala na oddzielenie komórek gwiaździstych od innych typów komórek wątroby poprzez wirowanie w 8% gradiencie Nycodenzu. Opisany tutaj protokół pozwala na uzyskanie wysoce czystej i homogennej populacji komórek gwiaździstych. Czystość preparatów można ocenić poprzez barwienie na cząsteczkę markerową – kwaśne białko włókieniste gleju (GFAP), przed analizą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej. Ponadto mikroskopia świetlna ujawnia charakterystyczny wygląd gwieździstych komórek gwiaździstych wątroby, które zawierają dużą liczbę kropli lipidowych.

Podsumowując, przedstawiamy szczegółowy protokół wydajnej izolacji komórek gwiaździstych wątroby, obejmujący reprezentatywne obrazy ich morfologii oraz ekspresji GFAP, które pomagają zdefiniować tożsamość komórek gwiaździstych.

Protokół

Należy użyć myszy C57BL/6 w wieku około 20 tygodni lub starszych. Zaleca się stosowanie samców myszy o masie 25-30g. Uzysk sterowców można zwiększyć, podając myszom dietę wzbogaconą o witaminę A przez 2 miesiące przed izolacją tych komórek. Z wątroby jednej myszy C57BL/6 można oczyścić około 2x10⁵ komórek gwiaździstych wątroby, natomiast uzyski z myszy Balb/c są znacznie wyższe. Poniższy protokół jest dostosowany do 5 myszy. Opieka nad zwierzętami i eksperymenty były przeprowadzane zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee).

1. Perfuzja in situ wątrób myszy za pomocą enzymów trawiennych

1. Podgrzać bufor SC1 oraz roztwory do perfuzji enzymatycznej w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
2. Zamocować kaniulę motylkową do rurki silikonowej pompy perystaltycznej.
3. Kalibrować pompę za pomocą PBS, aby uzyskać przepływ laminarny rzędu 6,5ml/min; jest to szybkość przepływu, która zostanie zastosowana podczas perfuzji wątroby in situ. Rurkę silikonową nasycić roztworem SC1.
4. Zanestezjować mysz poprzez podanie dosytnieliczbowe roztworu ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg), a następnie sprawdzić utratę odruchów, aby upewnić się, że zwierzę znajduje się w głębokiej narkozie.
5. Utrwalić mysz w pozycji grzbietowej na odpowiedniej podstawie.
6. Za pomocą nożyczek i pęsety wykonać nacięcie podłużne skóry brzucha i odsłonić otrzewną.
7. Ostrożnie otworzyć otrzewną i przesunąć jelita z jamy brzusznej na lewą stronę zwierzęcia, aby odsłonić żyłę wrotną.
8. Wprowadzić kaniulę zestawu infuzyjnego do żyły wrotnej. Na tym etapie zaleca się użycie stereomikroskopu.
9. Rozpocząć perfuzję wątroby 30ml roztworem SC1. Natychmiast po uruchomieniu przepływu otworzyć żyłę główną dolną. Prawidłowe przepłukanie wątroby objawia się utratą koloru tkanki wątrobowej.
10. Przeprowadzić perfuzję wątroby 30ml roztworem Pronazy E. Po skutecznym trawieniu płaty wątroby spuchną, a zraziki staną się wyraźnie widoczne przez torebkę.
11. Przeprowadzić perfuzję wątroby 30ml roztworem Kolagenazy P. Na tym etapie wątroba traci swój kształt i wygląda na beztoniczna oraz amorficzna.
12. Ostrożnie oddzielić wątrobę od przepony i sąsiednich narządów, a następnie umieścić ją w 70ml roztworze SC2 na lodzie.
13. Powtórzyć procedurę dla kolejnych myszy.

2. Trawienie in vitro wątrób myszy

Wszystkie kolejne kroki robocze należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, korzystając z dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.

1. Pokroić wątroby na kawałki o rozmiarach około 2x2x2mm³ za pomocą ostrych nożyczek.
2. Połączyć zawiesinę zawierającą 70ml SC2 oraz kawałki wątroby z 50ml roztworu Pronazy E-Kollagenazy P i dodać 1ml roztworu DNazy I.
3. Trawić wątroby przez 20min w temperaturze 37°C przy ciągłym mieszaniu.

3. Centryfugowanie w gradiencie gęstości

1. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sita komórkowe 70μm do 6 probówek Falcon 50ml i uzupełnij objętość do 50ml buforem SC2. Centryfuguj przez 10min przy 600g i 4°C.
2. Ostrożnie odessij 40ml supernatantu, następnie dodaj 150μl roztworu DNase I do każdej probówki i resuspendu komórki.
3. Połącz zawiesiny komórkowe w 4 probówkach Falcon 50ml i przemyj buforem GBSS-B, następnie centryfuguj przez 10min przy 600g i 4°C.
4. Ostrożnie odessij jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu, i dodaj 150μl roztworu DNase I do każdej probówki. Resuspendu osady komórkowe w 10ml GBSS-B na probówkę.
5. Połącz komórki w 2 probówkach Falcon 50ml i dodaj GBSS-B do uzyskania całkowitej objętości 36ml na probówkę. Dodaj 14ml roztworu Nycodenz do każdej probówki i dokładnie wymieszaj.
6. Przenieś 10ml zawiesiny komórkowej do jednej 12ml probówki do centryfugacji gradientowej, co da łącznie 10 probówek. Delikatnie przykryj zawiesinę komórkową warstwą 1,5ml GBSS-B na probówkę.
7. Centryfuguj gradienty przez 15min przy 1500g i 4°C bez hamowania. W wyniku tego hepatocyty utworzą osad na dnie probówki, natomiast komórki gwiaździste znajdą się w interfazie w postaci białego pierścienia.
8. Ostrożnie pobierz interfazę zawierającą komórki gwiaździste i przemyj je buforem GBSS-B; centryfuguj przez 10min przy 600g i 4°C.
9. Odessij supernatant i resuspendu komórki w 20ml DMEM uzupełnionego o 10% inaktywowanego ciepłem FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 2mM L-glutaminy, 1mM pirogronianu sodu oraz 10mM HEPES. Przenieś komórki do kolb hodowlanych w koncentracji 2x10⁴ komórek/cm². Inkubuj komórki w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
10. Wymień pożywkę, gdy tylko komórki gwiaździste wątroby przywrą do podłoża (około 2h po przygotowaniu), aby wypłukać martwe komórki i szczątki komórkowe.
11. Następnego dnia komórki gwiaździste powinny wykształcić charakterystyczną morfologię w kształcie gwiazdy z perinuklearnymi pęcherzykami lipidowymi magazynującymi witaminę A.
12. W kolejnych eksperymentach komórki gwiaździste wątroby można łatwo odczepić od niepowlekanych powierzchni plastikowych, stosując łagodne roztwory enzymatyczne, np. Accutase.

4. Reprezentatywne wyniki:

Po przygotowaniu komórek gwiaździstych wątroby zgodnie z dostarczonym protokołem, czystość wyizolowanej populacji można sprawdzić, biorąc pod uwagę trzy główne cechy tego typu komórek, takie jak kształt przypominający gwiazdę, perinuklearne kropelki lipidowe oraz ekspresja gliałowego kwaśnego białka włóknistego (GFAP). Reprezentatywne zdjęcia charakterystycznego wyglądu komórek gwiaździstych wątroby 2h po izolacji, a także w 1. i 3. dniu hodowli in vitro przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne GFAP w komórkach gwiaździstych wątroby hodowanych przez 3 dni po izolacji. Komórki gwiaździste wątroby różnicują się w komórki miofibroblastyczne podczas hodowli in vitro. Charakterystycznym wyróżnikiem tych aktywowanych komórek gwiaździstych jest ekspresja alfa-aktyny mięśni gładkich (αSMA). Rysunek 3 przedstawia barwienie immunofluorescencyjne αSMA oraz miozyny IIA w aktywowanych komórkach gwiaździstych w 7. dniu hodowli in vitro.

Rysunek 1. Charakterystyczna morfologia gwiaździstych komórek wątroby. Komórki gwiaździste wyizolowano z wątrób mysich zgodnie z podanym protokołem. Obrazy przedstawiają komórki gwiaździste 2h po izolacji (a, b), a także w 1. dniu (c) i 3. dniu (d) hodowli in vitro. Gwiaździste komórki wątroby wykazują dużą liczbę pęcherzyków lipidowych w obszarach okołojądrowych i nabywają swoją charakterystyczną, astralną morfologię w ciągu pierwszych dni hodowli in vitro (Powiększenie 200x).

Rysunek 2. Komórki gwiaździste wątroby specyficznie wykazują ekspresję GFAP w wątrobie. Komórki gwiaździste zostały wyizolowane i poddane barwieniu immunofluorescencyjnemu na obecność GFAP (kolor czerwony) w 3. dniu hodowli in vitro. Jądra komórkowe przedstawiono w kolorze niebieskim (barwienie Hoechst).

Rycina 3. Komórki gwiaździste wątroby różnicują się w miofibroblasty. Komórki gwiaździste wątroby wyizolowane z myszy C57BL/6 hodowano przez 7 dni. Następnie przeniesiono je na szkiełka komorowe i barwiono na aSMA (kolor czerwony) oraz miozynę IIA (kolor zielony). Jądra komórkowe przeciwbarwiono Hoechstem (kolor niebieski).

Bufor SC1
EGTA	190mg
Glukoza	900mg
HEPES	10 ml roztworu stokowego 1M
KCl	400mg
Na2HPO4 x 2 H2O	151mg
NaCl	8g
NaH2PO4 x H2O	78mg
NaHCO3	350mg
Czerwony fenol	6mg
dH2O	dopełnić do 1l
Bufor SC2
CaCl2 x 2H2O	560mg
HEPES	10ml roztworu stokowego 1M
KCl	400mg
Na2HPO4 x 2 H2O	151mg
NaCl	8g
NaH2PO4 x H2O	78mg
NaHCO3	350mg
Czerwony fenol	6mg
dH2O	dopełnić do 1l
Bufor GBSS-A
KCl	370mg
CaCl2 x 2H2O	225mg
Glukoza	991mg
KH2PO4	30mg
MgCl2 x 6 H2O	210mg
MgSO4 x 7 H2O	70mg
Na2HPO4 x 2 H2O	75mg
NaHCO3	227mg
Czerwony fenol	6mg
dH2O	dopełnić do 1l
Bufor GBSS-B
CaCl2 x 2H2O	225mg
Glukoza	991mg
KCl	370mg
KH2PO4	30mg
MgCl2 x 6 H2O	210mg
MgSO4 x 7 H2O	70mg
Na2HPO4 x 2 H2O	75mg
NaCl	8g
NaHCO3	227mg
Czerwony fenol	6mg
dH2O	dopełnić do 1l
Roztwór perfuzyjny z Pronazą E
Pronaza E	100mg (4000 PU/mg min)
Bufor SC2	200ml
Roztwór perfuzyjny z Kolagenazą P
Kolagenaza P	85mg (1,78 U/mg lyo)
Bufor SC2	200ml
Roztwór Pronaza E-Kolagenaza P
Pronaza E	50mg (4000 PU/mg min)
Kolagenaza P	85mg (1,78 U/mg lyo)
Bufor SC2	50ml
Roztwór DNazy I
DNaza I	6mg (ok. 2000U/mg)
GBSS-B	3ml
Roztwór Nycodenz
Nycodenz	8g
GBSS-A	28ml

Tabela 1. Bufor i roztwory enzymów wymagane do izolacji komórek gwiaździstych wątroby. pH wszystkich buforów powinno zostać dostosowane do wartości 7,3-7,4. Ponadto zaleca się sterylną filtrację wszystkich buforów. Ważne jest, aby dostosować ilość użytego enzymu do podanej aktywności enzymatycznej.

Dyskusja

Komórki gwiaździste wątroby regulują kluczowe procesy fizjologiczne i patofizjologiczne w wątrobie. Ponadto komórki gwiaździste posiadają właściwości prezentacji antygenu, co czyni je istotnym elementem odpowiedzi immunologicznej wątroby. Chociaż komórki gwiaździste wątroby stanowią 10-15% całkowitej liczby komórek w wątrobie, ich izolacja jest trudna ze względu na lokalizację w okozatokowej przestrzeni Dissego.

Przedstawiamy prostą metodę izolacji komórek gwiaździstych wątroby z wątrób mys...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
70μSito do oddzielania komórek	BD Biosciences	352350
CaCl22 x 2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
Kolagenaza P	Grupa Roche	11249002001
DMEM	GIBCO, firmy Life Technologies	11960
DNaza I	Grupa Roche	10104159001
DPBS	Cellgro	21-031-cv
EGTA	Fluka	3777
Płodowa surowica bydlęca	GIBCO, by Life Technologies	16000
Glukoza	Sigma-Aldrich	G7528
Probówki do wirowania w gradiencie stężeń	Greiner Bio-One	163160
HEPES	GIBCO, by Life Technologies	15630
KCL	Sigma-Aldrich	P9541
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791
L-glutamina	GIBCO, by Life Technologies	25030
MgCl₂2 x 6 h2O	Fluka	63068
MgSO₄4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	M2773
Na2HPO4 x 2H2O	Fluka	71643
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaH2PO4 x H2O	Fluka	71507
NaHCO33	Fluka	71628
Nycodenz	Accudenz AG	AN7050/BLK
Penicylina/streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140
Pompa perystaltyczna	Cole-Parmer	HV-7523-70
Czerwień fenolowa	Sigma-Aldrich	P4633
Pronaza E	Calbiochem	7433-2
Rurka silikonowa	Masterflex (Cole Palmer)	HV-96440-14
pirowinian sodu	GIBCO, by Life Technologies	11360
Kolba do hodowli tkankowej (25 cm²)2)	BD Biosciences	353108
Zestaw do infuzji z motylkiem	Terumo Medical Corp.	1SV27EL