Opisano wydajną procedurę oceny tendencji do oligomeryzacji pojedynczych domen transbłonowych (TMD). Białka chimeryczne, składające się z TMD połączonej z ToxR, są eksprymowane w szczepie reporterowym E. coli. Indukowana przez TMD oligomeryzacja powoduje dimeryzację ToxR, aktywację transkrypcji i produkcję białka reporterowego, -galaktozydazy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wyznaczanie skłonności do oligomeryzacji domeny transbłonowej za pomocą testu ToxR
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zbyt uproszczony pogląd na domeny transbłonowe białek, traktujące je jedynie jako kotwice w dwuwarstwach fosfolipidowych, został dawno obalony. W wielu przypadkach białka przechodzące przez błonę wyewoluowały wysoce zaawansowane mechanizmy działania.1-3 Jednym ze sposobów, w jaki białka błonowe mogą modulować swoje struktury i funkcje, jest bezpośredni i specyficzny kontakt hydrofobowych helis, tworzących ustrukturyzowane oligomery transbłonowe.4,5 Wiele ostatnich prac skupiło się na rozkładzie aminokwasów występujących preferencyjnie w środowisku błonowym w porównaniu z roztworem wodnym oraz na różnych siłach międzycząsteczkowych napędzających asocjację białek.6,7 Niemniej jednak badania nad rozpoznawaniem molekularnym w domenach transbłonowych białek wciąż pozostają w tyle za badaniami nad regionami rozpuszczalnymi w wodzie. Główną przeszkodą pozostaje fakt, że mimo niezwykłej specyficzności i powinowactwa, jakie może osiągnąć oligomeryzacja transbłonowa,8 bezpośredni pomiar ich asocjacji jest trudny. Tradycyjne metodologie stosowane w badaniu funkcji integralnych białek błonowych mogą być utrudnione przez immanentną nierozpuszczalność badanych sekwencji. Wglądy biofizyczne uzyskane z badania syntetycznych peptydów reprezentujących domeny transbłonowe mogą dostarczyć cennych informacji strukturalnych. Jednakże często kwestionuje się biologiczną istotność systemów miceli detergentowych lub liposomów stosowanych w tych badaniach w celu naśladowania błon komórkowych; czy peptydy przyjmują strukturę zbliżoną do natywnej w tych warunkach i czy ich zachowanie funkcjonalne naprawdę odzwierciedla sposób działania w błonie natywnej? Aby zbadać oddziaływania sekwencji transbłonowych w naturalnych dwuwarstwach fosfolipidowych, laboratorium Langoscha opracowało testy reporterowe transkrypcyjne ToxR.9 Badana domena transbłonowa jest ekspresowana jako białko chimeryczne z białkiem wiążącym maltozę w celu lokalizacji w periplazmie oraz z białkiem ToxR, aby zapewnić raport o poziomie oligomeryzacji (Rysunek 1).
W ciągu ostatniej dekady kilka innych grup (np. Engelman, DeGrado, Shai) dodatkowo zoptymalizowało i zastosowało ten test reporterowy ToxR.10-13 Różne warianty testów ToxR stały się złotym standardem w badaniu oddziaływań białko-białko w błonach komórkowych. Przedstawiamy tutaj typowy przebieg eksperymentu przeprowadzanego w naszym laboratorium, który opiera się głównie na protokołach opracowanych przez Langoscha. Ta powszechnie stosowana metoda jest użyteczna do analizy samoasocjacji domen transbłonowych w E. coli, gdzie produkcja β-galaktozydazy służy do oceny skłonności TMD do oligomeryzacji. W wyniku indukowanej przez TMD dimeryzacji, ToxR wiąże się z promotorem ctx, powodując upregulację genu LacZ kodującego β-galaktozydazę. Odczyt kolorymetryczny uzyskuje się poprzez dodanie ONPG do lizowanych komórek. Hydrolityczne rozszczepienie ONPG przez β-galaktozydazę prowadzi do powstania absorbującego światło o-nitrofenolanu (ONP) (Rycina 2).
Protokół
1. Uwagi dotyczące klonowania
- Komercyjnie przygotowane oligonukleotydy reprezentujące interesującą domenę TMD, flankowane miejscami restrykcyjnymi NheI oraz BamHI i 5'-fosforylowane, mogą zostać ligowane do pTox7 (zmodyfikowanego w naszym laboratorium poprzez wstawienie jednej pary zasad bezpośrednio po miejscu restrykcyjnym BamHI14) (Rysunek 3) po sekwencyjnym trawieniu BamHI i NheI. Poniżej przedstawiono przykład oligonukleotydu:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3'
3' gTMDSEQUENCEcctag5'
Sekwencja TMD powinna składać się z 12-24 reszt (krótsze sekwencje zostaną prawdopodobnie wydłużone przez zakodowane w wektorze reszty hydrofobowe). W celu zbadania interfejsu należy stworzyć cztery warianty projektu TMD, w których sekwencyjne insercje reszt i towarzyszące im delecje reszt spowodują rotację TMD względem ToxR.15,16 Na koniec należy zróżnicować stężenie arabinozy w zakresie od 0,01 do 0,01% (w/v), aby zidentyfikować stężenie, przy którym obserwuje się maksymalne różnice w sygnałach β-galaktosydazy pomiędzy różnymi sekwencjami TMD; zaleca się testowanie różnych poziomów ekspresji w celu ustalenia warunków, w których najlepiej można rozróżnić różne powinowactwa. Oprócz arabinozy i antybiotyków można zastosować 0,4 mM IPTG, aby zwiększyć różnice w powinowactwach pomiędzy różnymi TMD. Pomiar ToxR powinien zostać przeprowadzony co najmniej w czterech powtórzeniach. Cała procedura powinna zostać powtórzona co najmniej trzykrotnie z użyciem różnych transformacji plazmidowych.
2. Hodowla kultur bakteryjnych
- Powoli rozmrozić kompetentne komórki FHK12 (20 μl) na lodzie i przenieść je do probówki do hodowli o pojemności 15 ml. Dodać plazmidowe DNA (20 ng) i inkubować komórki na lodzie przez 30 min.
- Przeprowadzić szok termiczny poprzez inkubację przez 90 s w temperaturze 42 °C, a następnie inkubację na lodzie przez 2 min.
- Dodać pożywkę SOC (80 μl) i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu (30 rpm) przez jedną godzinę.
- Zaszczepić 5 ml pożywki LB z chloramfenikolem (30 μg/ml) i arabinozą (0,025% w/v), dodając 50 μl mieszaniny transformacyjnej do probówek do hodowli o pojemności 15 ml w trzech powtórzeniach. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu (30 rpm) przez 20 h. (Alternatywnie można użyć 5 μl hodowli do zaszczepienia 10 μl pożywki w płytce 96-dołkowej. Metoda ta jest przydatna przy pracy z dużą liczbą próbek, choć błędy będą nieco wyższe. Aby uniknąć parowania, które mogłoby prowadzić do błędów, należy wypełnić zewnętrzne dołki pożywką, nie wykorzystując ich do próbek. Na koniec miejsce styku pokrywki z płytką należy dwukrotnie owinąć parafilmem).
3. Pomiar aktywności β-galaktozydazy
- Podgrzej czytnik płytek do 28 °C.
- Przenieś bufor Z do zbiornika za pomocą końcówki do pipety o dużej objętości, upewniając się, że pobierana jest tylko górna (wodna) warstwa. Przenieś 100 μl świeżo przygotowanego buforu Z/chloroformu dołków płytki 96-dołkowej. Przenieś 5 μl każdą kulturę dołków płytki w czterech powtórzeniach. Pomiń kulturę w czterech dołkach, które będą służyć jako próba ślepa.
- Zmierz OD595 płytki w celu określenia gęstości komórek.
- Dodaj 50 μl buforu Z-buffer/SDS do wszystkich studni płytki. Wstrząsać płytkę w czytniku płytek przez 10 min w celu lizy komórek. Upewnić się, że po lizie zawiesiny komórkowe są klarowne; w razie potrzeby powtórzyć etap wstrząsania. Niepełna liza sugeruje, że bufor Z-buffer/chloroform nie został przygotowany na świeżo.
- Dodaj 50 μl do wszystkich dołków dodać świeżo przygotowany bufor Z/ONPG, ponownie umieścić płytkę w czytniku i zmierzyć OD405 co 30 s przez 20 min.
- Obliczyć aktywność β-galaktazydazy, korzystając z poniższego równania (pamiętając o odjęciu wartości tła). Stosunek OD405Wartość /min należy obliczyć, wykorzystując wszystkie punkty danych w OD.405 zakres od 0,0 do 1,0 przy użyciu dopasowania modelu liniowego.
Jednostki Millera mogą się czasami różnić w zależności od dnia pomiaru. Dlatego w każdym teście należy zmierzyć konstrukt referencyjny, taki jak GpA. Jego wartości mogą zostać wykorzystane do normalizacji wartości ToxR.
4. Kontrola ekspresji białka
- Przeprowadź analizę Western blot, aby zweryfikować jednolitość ekspresji białek pomiędzy konstruktami. Połącz 50 μl z trzech kultur i odwiruj (200 rpm, 4 min) w mikrocentry fudze. Usuń nadsącz za pomocą pipety i resuspenduj pozostały osad w buforze do ładowania próbek 2 x.
- Nałóż 7,5 μl na standardowy żel 8% i przeprowadź elektroforezę przy napięciu 125 V przez 1 godzinę i 5 minut. Po transferze inkubuj z przeciwciałem anty-MBP sprzężonym z HRP i przeprowadź wizualizację; białko chimeryczne jest widoczne przy około 70 kDa, a czasami obserwuje się produkty degradacji w okolicach 48 kDa. Endogenne MBP jest również widoczne przy 45 kDa (patrz Rysunek 5).
5. Kontrola prawidłowej insercji w błonę
Do oceny prawidłowej insercji błonowej chimerycznego konstruktu TMD wykorzystuje się linię komórkową z niedoborem białka wiążącego maltozę. Podczas hodowli na podłożu minimalnym, w którym jedynym źródłem węgla jest maltoza, zdolność do wzrostu wykazują jedynie komórki wykazujące ekspresję produktu integralnego z błoną, w którym białko wiążące maltozę jest prawidłowo zlokalizowane w periplazmie.
- Przeprowadzić transformację komórek PD28 (zgodnie z opisem dla komórek FHK12) i zaszczepić 2 ml pożywki LB. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu (30 rpm).
- Odwirować komórki przy 350 rpm przez 10 min w temperaturze 4 °C i przemyć poprzez resuspensję w PBS (2 ml), delikatnie pipetując szeroką końcówką lub stosując delikatne mieszanie wortexie. Ponownie odwirować komórki (jak powyżej), przemyć PBS po raz drugi, odwirować i ostatecznie resuspendować w PBS (1 ml).
- Wykorzystać 25 μl resuspendowanych komórek do zaszczepienia 5 ml pożywki minimalnej w trzech powtórzeniach i inkubować w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu (30 rpm). Pomiary OD595 wykonywać między 15. a 25. godziną, w przybliżeniu co 2 godziny, przenosząc 20 μl każdej próbki do płytki 96-dołkowej i odczytując wartości za pomocą czytnika płytek.
6. Reprezentatywne wyniki:
Przykład zastosowania testu reporterowego transkrypcyjnego ToxR do analizy skłonności do oligomeryzacji domen transbłonowych przedstawiono na Rysunku 4. Wcześniej badaliśmy oligomeryzację domen transbłonowych wieloprzeponowego białka integralnego błony – białka latentnego błonowego-1 (LMP-1) za pomocą różnych technik, w tym ToxR.14 Wykazano, że domena transbłonowa pięć (TM5) wykazuje silną skłonność do oligomeryzacji; potwierdzają to wysokie jednostki Millera, porównywalne z kontrolą pozytywną, GpA, która jest dobrze znaną sekwencją dimeryzującą. Szkodliwa mutacja w TM5, D150A, zmniejsza zdolność sekwencji do oligomeryzacji. LMP-1 TM1 nie oligomeryzuje w stopniu znaczącym i wykazuje bardzo niski sygnał w jednostkach Millera, znajdujący się tuż powyżej sygnału dla pustych, nieprzetransformowanych komórek FHK12.
Rysunek 1. Schemat przedstawiający assay reporterowy ToxR. Oligomeryzacja indukowana przez domenę transbłonową (TMD) prowadzi do dimeryzacji ToxR i aktywacji LacZ transkrypcja. Produkt genu LacZ, aktywność β-galaktosydazy można określić ilościowo jako miarę tendencji domeny transbłonowej (TMD) do oligomeryzacji.
Rycina 2. Hydrolityczne rozszczepienie ONPG przez β-galaktosydazę prowadzi do powstania związku absorbującego światło o-nitrofenolan (ONP).
Rysunek 3. Mapa plazmidu pToxR7.
Rysunek 4. Reprezentatywny test reporterowy transkrypcji ToxR analizujący skłonność do oligomeryzacji domen transbłonowych latentnego białka błonowego 1. Domena transbłonowa 5 (TM5) wykazuje silną oligomeryzację, podczas gdy domena transbłonowa 1 (TM1) wykazuje jedynie słabą interakcję. Mutacja D150A w TM5 znacznie zmniejsza jej zdolność do oligomeryzacji. GpA został dołączony jako sekwencja kontrolna dodatnia dla silnej dimeryzacji. Próba blank reprezentuje nieprzetransformowane komórki FHK12.
Rysunek 5. Western blot w badaniu ekspresji białek.
Rycina 6. Test komplementacji PD28 w celu kontroli prawidłowej insercji do periplazmy. Kontrola negatywna stanowi konstrukt pozbawiony białka wiążącego maltozę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analiza reporterowa transkrypcji ToxR jest prostym sposobem identyfikacji sekwencji transbłonowych o potencjale do oligomeryzacji. Ponieważ oddziaływania te zachodzą w obrębie wewnętrznej błony bakteryjnej, analiza ta pozwala uniknąć problemów związanych z wiarygodnością badania systemów w środowiskach mimetycznych do błony. Biorąc pod uwagę, że klonowanie wielu TMD do jednego plazmidu można łatwo przeprowadzić równolegle, a cały test może być wykonany w formacie płytki 96-dołkowej, analiza ta może być wykorzystana do wy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy National Institutes of Health (1R21CA138373) oraz Stand Up to Cancer (SU2C) za wsparcie finansowe niniejszej pracy. H.Y. jest wdzięczny za przyznanie nagrody Elion Award 2009 przez American Association of Cancer Research, nagrody Kimmel Scholar Award z Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research (SKF-08-101) oraz National Science Foundation Faculty Early Career Award (NSF0954819).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| enzym restrykcyjny BamHI | Invitrogen | 15201023 | Stwierdzono, że enzymy firmy Invitrogen są bardziej wydajne niż produkty alternatywnych dostawców |
| enzym restrykcyjny NheI | Invitrogen | 15444011 | Stwierdzono, że enzymy firmy Invitrogen są bardziej wydajne niż produkty alternatywnych dostawców |
| probówki do hodowli o pojemności 15 ml | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| Media społecznościowe | TEKnova, Inc. | S0225 | Dopełnić do odpowiedniej objętości i wysterylizować w autoklawie. |
| podłoże LB | Sigma-Aldrich | L7275 | Dopełnić do odpowiedniej objętości i wysterylizować w autoklawie. |
| Chloramfenikol | Sigma-Aldrich | CO378 | Roztwór zapasowy o stężeniu 30 mg/ml w etanolu przechowywany w zamrażarce |
| Arabinoza | Fluka | 10839 | Roztwór zapasowy o stężeniu 2,5% (m/v) w wodzie, przechowywany w zamrażarce |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6858-06 | |
| MgSO44.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-nitrofenyl β-D-galaktopiranozyd (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| bufor Z | 16,1 g Na2HPO4 5,5 g NaH2PO4 0,75 g KCl 0,246 g MgSO₄4 Dopełnić do 1 l, pH 7,0 | ||
| bufor Z/chloroform | 200 ml β-merkapto–etanol, 2 ml chloroformu, uzupełnić buforem Z do objętości 20 ml. Mieszać w wirówce (vortex) przez 1 min, odwirować przez 1 min przy 800 obr./min. Przygotowywać świeżą porcję dla każdej płytki. | ||
| Bufor Z/SDS | 160 mg SDS rozpuszczonych w 10 ml buforu Z | ||
| Bufor Z/ONPG | 40 mg ONPG w 10 ml buforu Z. Przygotować świeżą porcję dla każdej płytki | ||
| β-merkapto–etanol | Calbiochem | 444203 | |
| Przeciwciało monoklonalne anty-MBP (sprzężone z HRP) | New England Biolabs | E8038S | |
| Pożywka minimalna z maltozą | 1 x sole M9, 0,4% maltozy, 1 mg/ml tiaminy, 2 mM MgSO44 | ||
| płytka 96-dołkowa o płaskim dnie | Sarstedt Ltd | 83.1835.300 | |
| Czytnik płytek | Beckman Coulter Inc. | Detektor wielomodalny DTX880 | |
| Kąpiel wodna | VWR international | 89032-204 | |
| Inkubator wytrząsowy | Forma Scientific |
Bibliografia
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T. Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).
- von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).
- Van Horn, W. D. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324, 1726-1729 (2009).
- Hattori, M. Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis. Embo J. 28, 3602-3612 (2009).
- Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. Amino acid distributions in integral membrane protein structures. Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).
- Deber, C. M., Goto, N. K. Folding proteins into membranes. Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).
- Gerber, D., Shai, Y. In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).
- Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p, Fritz, H. J. Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).
- Russ, W. P., Engelman, D. M. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).
- Berger, B. W. Consensus motif for integrin transmembrane helix association. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).
- Oates, J., King, G., Dixon, A. M. Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions. Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).
- Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins. J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).
- Sammond, D. W. Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1. , Forthcoming (2010).
- Li, R. Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes. J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).
- Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper. J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).
- Finger, C., Escher, C., Schneider, D. The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions. Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
