Skłonność do oligomeryzacji domeny transbłonowej określona za pomocą testu ToxR

Podsumowanie

Opisana jest skuteczna procedura oceny skłonności do oligomeryzacji jednoprzebiegowych domen transbłonowych (TMD). Białka chimeryczne składające się z TMD połączonego z ToxR ulegają ekspresji w szczepie reporterowym E. coli. Oligomeryzacja indukowana przez TMD powoduje dimeryzację ToxR, aktywację transkrypcji i produkcję białka reporterowego, -galaktozydazy.

Streszczenie

Zbyt uproszczony pogląd na domeny transbłonowe białek jako jedynie kotwice w dwuwarstwach fosfolipidowych już dawno został obalony. W wielu przypadkach białka obejmujące błonę rozwinęły wysoce wyrafinowane mechanizmy ^{działania.1-3} Jednym ze sposobów, w jaki białka błonowe mogą modulować swoje struktury i funkcje, jest bezpośredni i specyficzny kontakt helis hydrofobowych, tworzących strukturalne oligomery transbłonowe. ^4,5 Wiele ostatnich prac koncentruje się na rozmieszczeniu aminokwasów preferencyjnie występujących w środowisku błonowym w porównaniu z roztworem wodnym oraz na różnych siłach międzycząsteczkowych, które napędzają asocjację białek. ^6,7 Niemniej jednak badania nad rozpoznawaniem molekularnym w domenie transbłonowej białek nadal pozostają w tyle za badaniami nad regionami rozpuszczalnymi w wodzie. Pozostaje poważna przeszkoda: pomimo niezwykłej specyficzności i powinowactwa, jakie może osiągnąć oligomeryzacja transbłonowa8^, bezpośredni pomiar ich związku jest wyzwaniem. Tradycyjne metodologie stosowane do badania integralnej funkcji białek błonowych mogą być utrudnione ze względu na nieodłączną nierozpuszczalność badanych sekwencji. Wiedza biofizyczna uzyskana dzięki badaniu syntetycznych peptydów reprezentujących domeny transbłonowe może dostarczyć użytecznych informacji strukturalnych. Jednak biologiczne znaczenie detergentowych systemów micelarnych lub liposomowych stosowanych w tych badaniach do naśladowania błon komórkowych jest często kwestionowane; Czy w tych warunkach peptydy przyjmują strukturę podobną do natywnej i czy ich zachowanie funkcjonalne naprawdę odzwierciedla sposób działania w natywnej błonie? W celu zbadania interakcji sekwencji transbłonowych w naturalnych dwuwarstwach fosfolipidowych, laboratorium Langosch opracowało testy reporterowe transkrypcji ToxR. ⁹ Domena transbłonowa, będąca przedmiotem zainteresowania, jest wyrażona jako białko chimeryczne z białkiem wiążącym maltozę w celu lokalizacji do peryplazmy i ToxR, aby dostarczyć raport o poziomie oligomeryzacji (ryc. 1).

W ostatniej dekadzie kilka innych grup (np. Engelman, DeGrado, Shai) jeszcze bardziej zoptymalizowało i zastosowało ten test reporterowy ToxR. ^10-13 Różne testy ToxR stały się złotym standardem w testowaniu interakcji białko-białko w błonach komórkowych. Przedstawiamy tutaj typową operację eksperymentalną przeprowadzoną w naszym laboratorium, która przede wszystkim przebiega zgodnie z protokołami opracowanymi przez firmę Langosch. Ta ogólnie stosowana metoda jest przydatna do analizy samoasocjacji domeny transbłonowej u E. coli, gdzie produkcja β-galaktozydazy jest wykorzystywana do oceny skłonności do oligomeryzacji TMD. Po dimeryzacji indukowanej przez TMD, ToxR wiąże się z promotorem ctx, powodując regulację w górę genu LacZ dla β-galaktozydazy. Odczyt kolorymetryczny uzyskuje się przez dodanie ONPG do zlizowanych komórek. Hydrolityczne rozszczepienie ONPG przez β-galaktozydazę powoduje wytwarzanie absorbujących światło gatunków o-nitrofenolanu (ONP) (ryc. 2).

Protokół

1. Uwagi dotyczące klonowania

1. Komercyjnie przygotowane oligonukleotydy reprezentujące TMD będące przedmiotem zainteresowania, otoczone miejscami restrykcyjnymi NheI i BamHI oraz fosforylowane 5', mogą być ligowane do pTox7 (zmodyfikowane w naszym laboratorium przez wprowadzenie jednej pary zasad bezpośrednio po miejscu restrykcyjnym BamHI¹⁴) (Figura 3) trawione sekwencyjnie za pomocą BamHI i NheI. Przykładowy oligonukleotyd pokazano poniżej:
   5'ctagcTMDSEQUENCEg3'
   3' gTMDSEQUENCEcctag5'

Sekwencja TMD powinna składać się z 12-24 reszt (krótsze sekwencje prawdopodobnie zostaną wydłużone przez hydrofobowe reszty zakodowane wektorem). W celu zbadania granicy faz należy stworzyć cztery warianty projektu TMD, w których sekwencyjne insercje pozostałości i towarzyszące im delecje pozostałości powodują rotację TMD względem ToxR. ^15,16 Wreszcie, stężenie arabinozy powinno być zróżnicowane między 0,001 a 0,01% (w/v) w celu określenia stężenia, w którym obserwuje się maksymalne różnice w sygnałach β-galaktozydazy między różnymi sekwencjami TMD; Testowanie różnych poziomów ekspresji jest zalecane w celu określenia warunków, w których najlepiej można rozróżnić różne powinowactwa. Oprócz arabinozy i antybiotyków, 0,4 mM IPTG może być stosowany w celu zwiększenia różnic powinowactwa między różnymi TMD. Pomiar ToxR powinien być wykonany co najmniej czterokrotnie. Całą procedurę należy powtórzyć co najmniej trzy razy z różnymi przemianami plazmidowymi.

2. Wzrost kultur bakteryjnych

1. Delikatnie rozmrozić kompetentne komórki FHK12 (200 μl) na lodzie i przenieść do probówki hodowlanej o pojemności 15 ml. Dodać plazmidowe DNA (200 ng) i inkubować komórki na lodzie przez 30 minut.
2. Komórki poddane szokowi cieplnemu przez inkubację przez 90 s w temperaturze 42 °C, a następnie inkubację na lodzie przez 2 min.
3. Dodać pożywkę SOC (800 μl) i inkubować próbki w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (300 obr./min) przez jedną godzinę.
4. Zaszczepić 5 ml pożywki LB chloramfenikolem (30 μg/ml) i arabinozą (0,0025% w/v) 50 μl mieszaniny transformacyjnej w 15 ml probówkach hodowlanych w trzech egzemplarzach. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (300 obr./min) przez 20 godzin. (Alternatywnie można użyć 5 μl kultury do zaszczepienia 100 μl pożywki na 96-dołkowej płytce. Ta metoda jest przydatna, gdy mamy do czynienia z dużą liczbą próbek, chociaż błędy będą nieco wyższe. Aby uniknąć parowania, które prowadziłoby do błędu, należy napełnić skrajne studzienki pożywką, ale nie używać ich do pobierania próbek. Na koniec dwukrotnie owiń złącze między pokrywką a płytką za pomocą parafilmu).

3. Pomiar aktywności β-galaktozydazy

1. Rozgrzej czytnik płytek do 28 °C.
2. Przenieś bufor Z do zbiornika z dużą końcówką pipety, upewniając się, że zajmuje tylko górną (wodną) warstwę. Przenieść 100 μl świeżo przygotowanego buforu Z/chloroformu do studzienek na płytce 96-dołkowej. Przenieś 5 μl każdej kultury do studzienek płytki w poczwórnym powiększeniu. Pomiń kulturę z czterech studzienek, które posłużą jako ślepa bułka.
3. Zmierz średnicę zewnętrzną₅₉₅ płytki, aby określić gęstość komórek.
4. Dodać 50 μl buforu Z/SDS do wszystkich studzienek płytki. Potrząsać płytką w czytniku płytek przez 10 minut, aby zlizać komórki. Upewnij się, że zawiesiny komórek są klarowne po lizie i w razie potrzeby powtórz etap wstrząsania. Niepełna liza sugeruje, że bufor Z/chloroform nie był świeżo przygotowany.
5. Dodać 50 μl świeżo przygotowanego buforu Z/ONPG do wszystkich studzienek i włożyć płytkę z powrotem do czytnika płytek i mierzyć OD₄₀₅ co 30 s przez 20 minut.
6. Oblicz aktywność β-galaktozydazy, korzystając z następującego równania (pamiętając o odjęciu ślepej próby). Stosunek OD₄₀₅/min należy obliczyć przy użyciu wszystkich punktów danych w zakresie OD₄₀₅ od 0,0 do 1,0 przy użyciu dopasowania modelu liniowego.
   
   Jednostki Millera różnią się czasami, gdy są rejestrowane w różnych dniach. W związku z tym konstrukt referencyjny, taki jak GpA, powinien być mierzony w każdym teście. Jego wartości można wykorzystać do normalizacji wartości ToxR.

4. Kontrola ekspresji białka

1. Wykonaj Western blot, aby zweryfikować równomierną ekspresję białka między konstruktami. Połączyć 50 μl trzech kultur i odwirować (2000 obr./min, 4 min) w mikrowirówce. Usunąć supernatant przez pipetowanie i ponownie zawiesić pozostały osad w buforze 2 x próbka.
2. Załadować 7,5 μl na standardowy 8% żel i przeprowadzić elektroforezę przy napięciu 125 V przez 1 godzinę 5 min. Po przeniesieniu inkubować z przeciwciałem sprzężonym z HRP anty-MBP i wizualizować; białko chimeryczne obserwuje się przy około 70 kDa, a niektóre produkty degradacji czasami obserwuje się około 48 kDa. Endogenny MBP obserwuje się również przy 45 kDa (patrz rysunek 5).

5. Kontrola prawidłowego wprowadzania membrany

Linia komórkowa z niedoborem białka wiążącego maltozę jest używana do oceny prawidłowego wstawiania błony chimerycznego konstruktu TMD. Przy hodowli na minimalnej pożywce z maltozą jako jedynym źródłem węgla, tylko komórki wyrażające produkt ekspresji integralnej błony z białkiem wiążącym maltozę prawidłowo zlokalizowanym w peryplazmie są w stanie rosnąć.

1. Przekształć komórki PD28 (zgodnie z opisem dla komórek FHK12) i zaszczepić 2 ml pożywki LB. Hodować komórki w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (300 obr./min) przez noc.
2. Granulować komórki przez odwirowanie z prędkością 3500 obr./min, 10 min, 4 °C i przemyć przez ponowne zawieszenie w PBS (2 ml) przez delikatne pipetowanie dużą końcówką lub delikatne wirowanie. Komórki rozpylić w granulki (jak wyżej), przemyć PBS po raz drugi, zawiesić i na koniec ponownie zawiesić w PBS (1 ml).
3. Użyć 25 μl zawieszonych komórek, aby zaszczepić 5 ml minimalnej ilości pożywki w trzech powtórzeniach i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (300 obr./min). Wykonaj odczyty OD₅₉₅ między 15-25 godzinami, mniej więcej co 2 godziny, przenosząc 200 μl każdej próbki do 96-dołkowej płytki i odczytując za pomocą czytnika płytek.

6. Reprezentatywne wyniki:

Przykład użycia testu reporterowego transkrypcji ToxR do analizy skłonności do oligomeryzacji domen transbłonowych pokazany na rysunku 4. Wcześniej badaliśmy oligomeryzację domen transbłonowych z wieloprzęsłowego białka błonowo-integralnego utajonego białka błonowego-1 (LMP-1) za pomocą różnych technik, w tym ToxR. ¹⁴ Wykazano, że piąta domena transbłonowa (TM5) wykazuje silną skłonność do oligomeryzacji; Świadczą o tym wysokie jednostki Millera, porównywalne z kontrolą pozytywną, GpA, dobrze ugruntowaną sekwencją dimeryzacyjną. Szkodliwa mutacja w TM5, D150A, zmniejsza zdolność sekwencji do oligomeryzacji. LMP-1 TM1 nie oligomeryzuje znacząco i wykazuje bardzo niski sygnał jednostki Millera, tuż powyżej sygnału dla pustych, nieprzekształconych komórek FHK12.

Rysunek 1. Rysunek przedstawiający test reporterowy ToxR. Oligomeryzacja sterowana domeną transbłonową (TMD) powoduje dimeryzację ToxR i aktywację transkrypcji LacZ. Produkt genu LacZ, β-galaktozydazy, można określić ilościowo jako miarę skłonności TMD do oligomeryzacji.

Rysunek 2. Hydrolityczne rozszczepienie ONPG przez β-galaktozydazę powoduje wytwarzanie absorbującego światło gatunku o-nitrofenolanu (ONP).

Rysunek 3. Mapa plazmidowa pToxR7.

Rysunek 4. Reprezentatywny transkrypcyjny test reporterowy ToxR analizujący skłonność do oligomeryzacji utajonych domen transbłonowych białka błonowego-1. Domena transbłonowa 5 (TM5) silnie oligomeryzuje, podczas gdy domena transbłonowa 1 (TM1) wykazuje tylko słabe oddziaływanie. Mutacja D150A w TM5 znacznie zmniejsza jego zdolność do oligomeryzacji. GpA jest uwzględniany jako pozytywna sekwencja kontrolna dla silnej dimeryzacji. Puste miejsce reprezentuje nieprzekształcone komórki FHK12.

Rysunek 5. Western blot do ekspresji białka.

Rysunek 6. Test komplementacji PD28 w celu kontroli prawidłowego wstawiania błony do peryplazmy. Kontrola ujemna reprezentuje konstrukt z niedoborem białka wiążącego maltozę.

Dyskusja

Test reportera transkrypcyjnego ToxR jest łatwym sposobem identyfikacji sekwencji transbłonowych z potencjałem oligomeryzacji. Ponieważ interakcje zachodzą w wewnętrznej błonie bakteryjnej, test ten omija problemy związane z trafnością badania systemów w środowiskach błonowo-mimetycznych. Biorąc pod uwagę, że klonowanie wielu TMD do jednego plazmidu można łatwo przeprowadzić równolegle, a cały test można przeprowadzić w formacie płytki 96-dołkowej, test ten można wykorzystać do wysokoprzepustowej analizy dużej liczby se...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Enzym restrykcyjny BamHI	Invitrogen	15201023	Enzymy Invitrogen okazały się bardziej skuteczne niż alternatywni dostawcy
Enzym restrykcyjny NheI	Invitrogen	15444011	enzymy Invitrogen okazały się bardziej wydajne niż alternatywni dostawcy
15 ml probówek hodowlanych	Fisher Scientific	14-956-1J
SOC media	TEKnova, Inc.	S0225	Uzupełniony do odpowiedniej objętości i wysterylizowany w autoklawie.
Pożywka LB	Sigma-Aldrich	L7275	Uzupełnione do odpowiedniej objętości i wysterylizowane w autoklawie.
Chloramfenikol	Sigma-Aldrich	CO378	Roztwór podstawowy 30 mg/ml w etanolu przechowywany w zamrażarce
Arabinoza	Fluka	10839	Roztwór podstawowy 2,5% (w/v) w wodzie przechowywanej w zamrażarce
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9390
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
KCl	Mallinckrodt Baker Inc.	6858-06
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	63138
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma-Aldrich	L6026
2-nitrofenyl β-D-galaktopiranozyd (ONPG)	Sigma-Aldrich	73660
Bufor			Z16,1 g Na2HPO4 5,5g NaH2PO4 0,75g KCl 0,246g MgSO4 Uzupełnić do 1 l, pH 7,0
Z-bufor/chloroform			200 ml β-mercapt– tanol, 2 ml chloroformu, uzupełnić do 20 ml buforem Z. Wirować przez 1 min, wirować przez 1 minutę przy 800 obr./min. Zrób świeże na każdy talerz.
Bufor Z/SDS			160 mg SDS rozpuszczony w 10 ml buforu
Z bufor Z/ONPG			40 mg ONPG w 10 ml buforu Z. Zrób świeże na każdy talerz
β-mercapt– tanol	Calbiochem	444203
Przeciwciało monoklonalne anty-MBP (sprzężone z HRP)	New England Biolabs	E8038S
Minimalne podłoże z maltozą			1 x sole M9, 0,4% maltozy, 1 mg / ml tiaminy, 2 mM MgSO4
96-dołkowa płaska płytka denna	Sarstedt Ltd	83.1835.300
Czytnik płytek	Beckman Coulter Inc.		wielomodowy DTX880
Łaźnia wodna	VWR international	89032-204
Inkubator wstrząsowy	Forma Scientific