Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2724

⸱

16 czerwca 2011

 ,  , 
1Departments of Pathology, Immunology and Laboratory Medicine, College of Medicine, University of Florida

W tym artykule

Podsumowanie

Testy limfocytotoksyczności komórkowej (CML) mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi autoreaktywnych oraz mechanizmów śmierci komórek in vitro. Jednak dzięki zastosowaniu technik obrazowania konfokalnego żywych komórek z użyciem barwników fluorescencyjnych, typ i kinetyka śmierci komórkowej, a także wykorzystywane szlaki, mogą być badane w znacznie większych szczegółach.

Streszczenie

Cukrzyca typu 1 (T1D) jest autoimmunologiczną chorobą pośredniczoną przez limfocyty T. W przebiegu patogenezy u pacjentów postępuje insulinoopenia w wyniku utraty produkcji insuliny, co prawdopodobnie wynika z niszczenia komórek beta trzustki przez limfocyty T. Zrozumienie mechanizmów śmierci komórek beta podczas rozwoju T1D dostarczy wiedzy niezbędnej do opracowania skutecznej metody leczenia tej choroby. W testach limfocytotoksyczności komórkowej (CML) historycznie stosowano radionuklid chromu 51 (51Cr) do znakowania komórek docelowych. Następnie komórki docelowe są eksponowane na działanie komórek efektorowych, a uwalnianie 51Cr z komórek docelowych jest odczytywane jako wskaźnik śmierci komórek pośredniczonej przez limfocyty. Inhibitory śmierci komórkowej powodują zmniejszenie uwalniania 51Cr.

Jako komórki efektorowe wykorzystano aktywowaną autoreaktywną populację klonalną CD8+ cytotoksycznych limfocytów T (CTL) wyizolowaną od myszy transgenicznej dla obu łańcuchów (alfa i beta) receptora TCR AI4. Aktywne limfocyty T AI4 współhodowano z komórkami docelowymi NIT znakowanymi 51Cr przez 16 godzin, a następnie rejestrowano uwalnianie 51Cr w celu obliczenia specyficznej lizy

Mitochondria uczestniczą w wielu istotnych procesach fizjologicznych, takich jak produkcja energii, regulacja transdukcji sygnałowej oraz apoptoza. Badanie zmian funkcjonalnych mitochondriów w komórkach beta podczas rozwoju cukrzycy typu 1 (T1D) stanowi nowy obszar badań. Wykorzystując barwnik do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) oraz obrazowanie żywych komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej, monitorowaliśmy potencjał błony mitochondrialnej w czasie w linii komórkowej komórek beta NIT-1. Na potrzeby badań obrazowych efektorowe limfocyty T AI4 zostały znakowane fluorescencyjnym barwnikiem do jąder komórkowych Picogreen. Komórki NIT-1 oraz limfocyty T hodowano wspólnie w komorowych szkiełkach nakrywkowych, które następnie umieszczono na stole mikroskopu wyposażonego w komorę do hodowli żywych komórek, z kontrolą temperatury 37°C, stężeniem 5% CO2 oraz odpowiednim nawilżeniem. Podczas tych eksperymentów obrazy każdego skupiska komórek były pobierane co 3 minuty przez 400 minut.

W ciągu 400 minut obserwowano zanik potencjału błony mitochondrialnej w skupiskach komórek NIT-1, do których przytwierdziły się limfocyty T AI4. W równoległym eksperymencie kontrolnym, w którym komórki NIT-1 współhodowano z ludzkimi limfocytami Jurkat o niedopasowanym MHC, potencjał błony mitochondrialnej pozostał nienaruszony. Technikę tę można wykorzystać do obserwacji zmian potencjału błony mitochondrialnej w czasie rzeczywistym w komórkach poddanych działaniu limfocytów cytotoksycznych, cytokin lub innych odczynników cytotoksycznych.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

  1. Kultura komórek docelowych: Hodowlę mysich linii komórkowych beta, NIT-1 i NIT-4, prowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem1,2 w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS, 0,02% BSA, niezasadnicze aminokwasy, 15mM HEPES, 16,5mM glukozy oraz penicylinę/streptomycynę. Do znakowania 51Cr wysiać komórki na 96-dołkową płytkę hodowlaną z płaskim dnem w zagęszczeniu 5X104 komórek/dołek w 200 μl pożywki hodowlanej. Do eksperymentów mikroskopowych wysiać komórki na 8-dołkową szkiełka nakrywkę z komorami Lab-Tak II w zagęszczeniu 5x104 na komorę w 500 μl pożywki hodowlanej i inkubować przez 48 godzin przed zastosowaniem w badaniach cytotoksyczności.
  2. Kultura kontrolnej linii komórkowej limfocytów T: Jako kontrolę negatywną wykorzystać linię komórkową Jurkat (ATCC, ludzka linia komórkowa limfocytów CD3+). Hodować komórki Jurkat w pożywce RPMI1640 uzupełnionej o 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1,5 g/L wodorowęglanu sodu, 10 mM HEPES i 1,0 mM pirogronianu sodu.

2. Pozyskiwanie i aktywacja efektorowych autoreaktywnych limfocytów T CD8+

Myszy NOD.Cg-Rag1tm1MomTg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] oraz NOD.Cg-Rag1tm1MomTg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] zostały zakupione z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) i hodowane w naszym ośrodku dla myszy. Potomstwo hybrydowe F1 z krzyżówek NOD-AI4a z NOD-AI4b [NOD-AI4a/b] rozwija cukrzycę w wieku 3-5 tygodni. Wszystkie myszy były utrzymywane w warunkach wolnych od specyficznych patogenów (SPF) i uzyskały zatwierdzenie odpowiedniej instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt.

  1. Uśmierć myszy NOD-AI4a/b w wieku 3-4 tygodni za pomocą CO2.
  2. Pobierz śledziony od myszy. Uśmiercone myszy przygotuj za pomocą sprayu z etanolem i otwórz pod dygestorium chirurgicznym. Śledziony należy usunąć i natychmiast umieścić w lodowatym buforze HBSS.
  3. Wyizoluj komórki śledziony, używając szklanego homogenizatora 7 mL. Dwie do trzech śledzion razem umieść w 5 mL zimnego HBSS i zhomogenizuj za pomocą szklanego homogenizatora 7 mL. Homogenizat należy zebrać i odwirować z prędkością 1200rpm przez 5 minut w temperaturze 4°C przy użyciu wirówki Sorvall RT7+. Zbierz osady komórkowe.
  4. Usuń erytrocyty poprzez traktowanie roztworem hipotonicznym. Osady traktuj 5 mL roztworu hipotonicznego na jedną śledzionę w warunkach chłodzenia na lodzie przez 5 minut, a następnie zneutralizuj poprzez dodanie równiej objętości HBSS. Zbierz komórki poprzez wirowanie, jak opisano powyżej, i resuspenduj w 50 mL HBSS. Przepuść zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe i policz komórki za pomocą hemocytometru z barwieniem TrypanBlue.
  5. Aktywuj komórki. Resuspenduj komórki do stężenia 5x106/mL i aktywuj poprzez 3-dniową hodowlę z 0,1 μM mimotopu AI4 (sekwencja aminokwasowa YFIENYLEL) oraz 25 U/mL IL-2 w pożywce RPMI1640 uzupełnionej o 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1,5 g/L wodorowęglanu sodu, 10 mM HEPES i 1,0 mM pirogronianu sodu.

3. Test uwalniania 51Cr w celu badania CML

  1. Znakowanie komórek docelowych: dodać 51Cr do komórek docelowych w ilości 1 μCi/dołek i inkubować przez 3 godziny, a następnie przemyć 3 razy pożywką hodowlaną.
  2. Zawiesić komórki efektorowe w pożywce RPMI 1640, zgodnie z opisem w kroku 2.5, tak aby końcowa objętość dodana do każdej dołki wynosiła 200 μl.
  3. Po ostatnim przemyciu znakowanych komórek docelowych dodać aktywowane komórki efektorowe do kultur komórek docelowych w wybranych stosunkach efektorowych do docelowych (E:T). Zazwyczaj stosujemy stosunki E:T wynoszące 0,4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 oraz 50:1.
  4. Do 6 dołek z komórkami docelowymi dodać świeżą zmodyfikowaną pożywkę RPMI 1640 (patrz krok 2.5), która posłuży jako kontrola lizy spontanicznej.
  5. Wykonywać kokulturę komórek efektorowych i docelowych przez 16 godzin.
  6. Zebrać nadsącz do probówek Lime Glass 6x50 mm.
  7. Zlizować komórki, dodając 100 μl 2% SDS i delikatnie pipetując kilka razy.
  8. Zebrać lizat komórkowy do kolejnego zestawu probówek Lime Glass 6x50 mm.
  9. Przemyć dołki raz czystą wodą H2O i dodać płuczkę do probówek z lizatem komórkowym.
  10. Zmierzyć aktywność nadsączów i lizatów komórkowych za pomocą licznika gamma.
  11. Obliczyć specyficzną lizę według następującego wzoru:
    Wzór równowagi statycznej; równanie % specyficznej lizy; zastosowanie edukacyjne w badaniach nad lizą komórek.

4. Barwienie komórek do obrazowania żywych komórek

Wśród najczęściej stosowanych barwników do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej TMRM wykazuje najniższą toksyczność mitochondrialną.3 W związku z tym wybraliśmy TMRM do niniejszych badań obrazowania żywych komórek.

  1. Przygotować roztwór zapasowy TMRM o stężeniu 40 mM w DMSO i przechowywać w temperaturze -20°C. Przygotować świeży roztwór roboczy o stężeniu [25 nM] w pożywce DMEM bez czerwieni fenolowej ze wszystkimi suplementami do hodowli komórek NIT-1 1.
  2. Barwić docelowe komórki NIT-1 za pomocą TMRM 25 nM przez 30 min w temperaturze 37°C.
  3. Wymienić pożywkę na świeżą pożywkę zawierającą 5 nM TMRM, aby utrzymać równowagę rozkładu barwnika4.
  4. Policzyć aktywowane efektorowe limfocyty T AI4 za pomocą hematocytometru.
  5. Barwić aktywowane efektorowe limfocyty T AI4 za pomocą Picogreen w stężeniu 1 μl/mL przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć trzykrotnie pożywką hodowlaną bez czerwieni fenolowej.

5. Ocena śmierci komórek beta pośredniczonej przez limfocyty T przy użyciu obrazowania żywych komórek

  1. Zamocuj szkiełko nakrywowe z komorą zawierające zabarwione komórki NIT na stoliku konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 510. Usuń wypustkę za pomocą narzędzia Dremel i wysterylizuj szkiełko z komorą gazowo tlenkiem etylenu. Stolik jest wyposażony w komorę do obrazowania żywych komórek z kontrolą temperatury 37°C, 5% CO2 oraz wilgotnością.
  2. Dodaj aktywowane i zabarwione limfocyty T do odpowiednich komór w różnych stosunkach E:T.
  3. Dodaj taką samą liczbę zabarwionych komórek Jurkat do komór kontrolnych.

6. Pozyskiwanie obrazów żywych komórek

Mikroskop jest wyposażony w zautomatyzowany stolik, który umożliwił nam automatyczne, powtarzalne pozyskiwanie obrazów z różnych lokalizacji w obrębie tych samych lub różnych komór w czasie trwania eksperymentu.

  1. Używając obiektywu olejowego 63x, wykonaj zdjęcia w odstępach 3 minut, uzyskując łącznie 300 klatek dla każdej lokalizacji.
  2. Wykryj barwienie TMRM, stosując długość fali wzbudzenia 543 nm oraz zestaw filtrów dla emisji 565-619 nm.
  3. Wykryj barwienie Picogreen, stosując wzbudzenie 488 nm oraz zestaw filtrów dla emisji 500-630 nm. Wideo zostało utworzone przy użyciu oprogramowania Zeiss LSM.

7. Konwersja wideo do publikacji

  1. Za pomocą oprogramowania Zeiss LSM utwórz nieskompresowany plik filmowy w formacie AVI.
  2. Aby przekonwertować wideo do formatu publikacyjnego, zaimportuj je do pakietu oprogramowania FIJI (http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji), będącego dystrybucją ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/), wykorzystując wtyczkę Bioformats z LOCI (http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats).
  3. Dostosuj ustawienia jasności i kontrastu, aby zrównoważyć sygnały zielone i czerwone, a częstotliwość klatek ustaw na 2 frames/second w menu opcji animacji.
  4. Przytnij wideo do wymiarów 512 x 512 pixels i wyeksportuj jako nieskompresowany plik AVI.
  5. Otwórz ten plik AVI w oprogramowaniu Quicktime 7 (Apple computer, Cupertino, CA), a następnie skompresuj i wyeksportuj w otwartym formacie plików wideo H264/MPEG-4 przy przepływności 1200 kbs/second.

8. Reprezentatywne wyniki:

  1. Reprezentatywny wynik testu CML z użyciem 51Cr. Rycina 1 przedstawia reprezentatywny wynik testu CML, w którym procent swoistej lizy (oś Y) wzrasta wraz ze wzrostem stosunku Efektory:Cel (oś X). Komórkami docelowymi są pierwotne wysepki wyizolowane z immunodeficyjnych myszy NOD.Rag1-/- i znakowane 51Cr. Splenocyty z transgenicznych myszy NOD.AI4α/β są izolowane i aktywowane zgodnie z opisem w kroku 2 powyżej. Komórki docelowe i efektory były współhodowane przez 16 godzin. Procent swoistej lizy oblicza się zgodnie z opisem w kroku 3.11 powyżej.
  2. Przedstawiono dwa reprezentatywne wyniki (dodatni i ujemny) rozproszenia potencjału błony mitochondrialnej komórek beta opośredniczonego przez limfocyty T. Komórki są barwione, a reakcje rejestrowane zgodnie z opisem w krokach 4, 5 i 6 powyżej; pliki wideo są tworzone zgodnie z krokiem 7. Wideo 1: Linia komórek beta myszy NIT-1 została zabarwiona barwnikiem potencjału błony mitochondrialnej TMRM (czerwony). Aktywowane, autoreaktywne limfocyty T CD8+ AI4 (zabarwione na zielono Picogreen) były współhodowane z tymi komórkami NIT-1 w stosunku E:T 50:1. Potencjał błony mitochondrialnej NIT-1 ulegał stopniowemu rozproszeniu w ciągu 400 minut, lecz tylko w skupiskach oddziałujących z limfocytami T AI4. Wideo 2: W ramach eksperymentu kontrolnego komórki NIT-1 zabarwiono TMRM i współhodowano z komórkami Jurkat zabarwionymi Picogreen w stosunku E:T 50:1. Komórki Jurkat to ludzka linia limfocytów T niedopasowana pod względem MHC. Komórki NIT-1 zachowały potencjał błony mitochondrialnej przez cały 400-minutowy okres wspólnej inkubacji. Komórki Jurkat nie wchodziły w interakcje ze skupiskami NIT-1, a w konsekwencji nie indukowały ich śmierci.

Wykres słupkowy stosunku efektorów do celu względem procentowej specyficznej lizy, przedstawiający aktywność komórek odpornościowych.
Rysunek 1. Reprezentatywny wynik testu CML z wykorzystaniem pierwotnych wysepek wyizolowanych z immunodeficientnych myszy NOD.Rag1-/- jako komórek docelowych oraz splenocytów z transgenicznych myszy NOD.AI4α/β. Komórki docelowe i efektory były współhodowane przez 16 godzin. Procent specyficznej lizy wzrasta wraz ze wzrostem stosunku efektorów do celu.

Wideo 1. Linia komórkowa beta mysia NIT-1 została zabarwiona barwnikiem potencjału błony mitochondrialnej TMRM (czerwony). Aktywowane autoreaktywne limfocyty T CD8+ AI4 (zabarwione na zielono za pomocą Picogreen) współhodowano z komórkami NIT-1 w stosunku E:T wynoszącym 50:1. Potencjał błony mitochondrialnej komórek NIT-1 zanikał stopniowo w ciągu 400 minut, ale tylko w skupiskach oddziałujących z zielonymi limfocytami T AI4. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Wideo 2. Komórki NIT-1 barwiono w ten sam sposób, jak opisano w Wideo 1, a następnie hodowano w ko kulturze z linią komórkową ludzkich limfocytów T Jurkat barwioną PicoGreen. Komórki NIT-1 były w stanie utrzymać potencjał błony mitochondrialnej przez cały czas trwania eksperymentu wynoszący 400 minut. Komórki Jurkat nie wchodziły w interakcje z skupiskami NIT-1, w związku z czym nie indukowały ich śmierci. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Śmierć komórek beta pośredniczona przez cytotoksyczne limfocyty T jest głównym mechanizmem patofizjologicznym T1D 5. Testy CML z wykorzystaniem uwalniania 51Cr pozwalają na badanie stopnia odpowiedzi efektorowej w relacji efektor-cel 6. Jednak szczegółowy proces i szlaki śmierci komórek beta pośredniczonej przez limfocyty T nie są jeszcze w pełni zrozumiałe. Ponieważ mitochondria są kluczowe dla funkcji i śmierci komórek beta7, skupiliśmy się na zmianach mitochondrialnych podcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Florydy.

Podziękowania

Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health DK074656 oraz AI56374 (CEM), a także z Juvenile Diabetes Research Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cr-51PerkinElmer, Inc.NEZ030500IMC
PBSCellgro21-040-60
Tetrametyloestru rodaminy (TMRM)InvitrogenT668
PicogreenInvitrogenP7581
Mimotop AI4mimotopes.comsekwencja aminokwasowa: YFIENYLEL
IL-2R&D Systems485-MI
DMEMInvitrogen11885
FBSHycloneSH30071.03
Albumin surowicy bydlęcejSigma-AldrichA8412
HEPESCellgro25-060-Cl
Niezbędne aminokwasy MEMGIBCO, by Life Technologies11140
Penicylina/StreptomycynaGemini Bio Products400-109
DMEM bez czerwieni fenolowejSigma-AldrichD5303
Inkubator CO2Thermo Fisher Scientific, Inc.HeraCell 150iUtrzymywany w warunkach sterylnych do hodowli komórkowej
Komora bezpieczeństwa biologicznegoThermo Fisher Scientific, Inc.Forma 1440
Jednorazowe probówki do hodowli, 6x50 mm Lime GlassFisher Scientific14-958-A
Licznik gammaPerkinElmer, Inc.Wizard 1470 Automatic Gamma Counter
Mikroskop konfokalnyCarl Zeiss, Inc.LSM 510 Meta ConfocalZ zmotoryzowanym stolikiem i komorą do żywych komórek
Pipeta (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl)Eppendorf
Probówki (bursztynowe)Fisher Scientific50819772
WirówkaSorvall, Thermo Scientific75004377
HemocytometrFisher Scientific267110
Mikroskop pionowyCarl Zeiss, Inc.Axioskop40
Myszy NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJJackson Laboratory004347
Myszy NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJJackson Laboratory004348
Myszy F1 NOD-AI4α/ βN/DN/DHodowane w zapleczu dla zwierząt UF

Bibliografia

  1. Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
  2. Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
  3. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
  4. Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
  5. Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
  6. Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
  7. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
  8. Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
  9. Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
  10. Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

limfocytotoksyczno kom rkowatest uwalniania chromupotencja b ony mitochondrialnejobrazowanie ywych kom rekcukrzyca typu 1limfocyty T CD8linia kom rek betamikroskopia konfokalna
Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.