Artykuł metodologiczny

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

18.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2736

⸱

27 maja 2011

 ,  ,  , 
1Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Streszczenie

Zakażenia wirusowe powodują zachorowalność i śmiertelność u biorców allogenicznych przeszczepów krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT). My oraz inni badacze z sukcesem generowaliśmy i wlewaliśmy limfocyty T specyficzne dla wirusa Epsteina-Barr (EBV), cytomegalowirusa (CMV) i adenowirusa (Adv), wykorzystując monocyty oraz limfoblastoidalne linie komórkowe transformowane przez EBV (EBV-LCL), zmodyfikowane genetycznie za pomocą wektora adenowirusowego jako komórki prezentujące antygen (APCs). Już 2x105/kg cytotoksycznych limfocytów T (CTL) specyficznych dla trzech wirusów proliferowały o kilka rzędów wielkości po infuzji i wydawały się zapobiegać oraz leczyć nawet ciężkie choroby wirusowe oporne na inne dostępne terapie. Szersze wdrożenie tego obiecującego podejścia jest ograniczone przez wysokie koszty produkcji, złożoność procesu wytwarzania oraz długi czas przygotowania (4-6 tygodni na generowanie EBV-LCL i 4-8 tygodni na produkcję CTL – łącznie 10-14 tygodni). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy nowy protokół produkcji CTL zgodny z zasadami GMP. Po pierwsze, zamiast adeno-wektorów do stymulacji limfocytów T, stosujemy komórki dendrytyczne (DCs) poddane nukleofekcji plazmidami DNA kodującymi LMP2, EBNA1 i BZLF1 (EBV), Hexon i Penton (Adv) oraz pp65 i IE1 (CMV) jako komórki prezentujące antygen. Te APCs reaktywują limfocyty T specyficzne dla wszystkich stymulujących antygenów. Po drugie, hodowla aktywowanych limfocytów T w obecności IL-4 (1,000U/ml) i IL-7 (10ng/ml) zwiększa i podtrzymuje repertuar oraz częstotliwość specyficznych limfocytów T w naszych liniach. Po trzecie, zastosowaliśmy nowe, przepuszczalne dla gazów urządzenie do hodowli (G-Rex), które sprzyja ekspansji i przeżywalności dużych liczb komórek po pojedynczej stymulacji, co eliminuje konieczność stosowania EBV-LCL i zmniejsza interwencje techników. Dzięki wprowadzeniu tych zmian możemy obecnie produkować wielospecyficzne CTL nakierowane na EBV, CMV i Adv przy koszcie za 106 komórek zredukowanym o >90%, w zaledwie 10 dni zamiast 10 tygodni, stosując podejście, które można rozszerzyć na dodatkowe ochronne antygeny wirusowe. Nasze zatwierdzone przez FDA podejście powinno mieć wartość w zastosowaniach profilaktycznych i terapeutycznych dla biorców allogenicznych HSCT z grupy wysokiego ryzyka.

Protokół

1. Nukleofekcja komórek dendrytycznych

  1. Zebrać komórki DC pochodzące z monocytów, które zostały wzbogacone poprzez adhezję do plastiku, hodowane przez 5 dni w pożywce Cell Genix uzupełnionej o IL4(1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) i dodatkowo dojrzewane przez 24 h przy użyciu cytokin dojrzewania DC: IL4(1000U/ml), GMCSF (800IU/ml), IL6 100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml oraz PGE2 (1μg/ml)1, delikatnie resuspendując je za pomocą pipety transferowej 3ml.
  2. Policzyć żywe komórki DC przy użyciu błękitu trypanu i przenieść je do trzech probówek 15ml, tak aby w każdej z nich znajdowało się nie mniej niż 0,5x106 i nie więcej niż 2x106 komórek/probówkę.
  3. Wirować komórki DC przez 10 min przy 200g. W tym czasie wstępnie ogrzać pożywkę Cell Genix uzupełnioną o cytokiny dojrzewania DC (pożywka do dojrzewania DC) – 2ml/dołek w trzech dołkach 12-dołkowej płytki hodowlanej w inkubatorze 37°C/5% CO2.
  4. Po zakończeniu wirowania odessać nadsącz i dodać odpowiednie plazmidy DNA do każdej z probówek w końcowym stężeniu 5μg DNA/probówkę. W tym przypadku do probówki nr 1 dodać plazmid kodujący IE1-pp65, do probówki nr 2 Hexon-Penton, a do probówki nr 3 EBNA1-LMP2-BZLF1.
  5. Resuspendować komórki DC i DNA w 100μl roztworu do nukleofekcji Amaxa, dokładnie wymieszać i przenieść do kuwet do nukleofekcji.
  6. Umieścić kuwety w nukleofektorze 4D, wybrać program CB150 (Amaxa/Lonza) i nacisnąć start.
  7. Natychmiast po nukleofekcji dodać 500μl z 2ml wstępnie ogrzanej pożywki do dojrzewania DC Cell Genix do kuwety, delikatnie wymieszać, pipetując ciecz w górę i w dół 2-3 razy, a następnie przenieść nukleofektowane komórki DC do przygotowanej płytki 12-dołkowej zawierającej pozostałe 1,5 ml wstępnie ogrzanej pożywki do dojrzewania DC. Przenieść do inkubatora 37°C/5% CO2 na kolejne 12-18 h.

2. Stymulacja limfocytów T

  1. Zebrać i policzyć nukleofektowane komórki DC, a następnie naświetlić je dawką 30Gy. Przemyć raz 10ml medium CTL (45% RPMI, 45% Clicks EHAA, 10% FBS, 2mM Glutamax) i resuspendować w stężeniu 3 x 105 komórek DC na ml medium CTL.
  2. Połączyć minimum 7,5x105 (2,5ml) i maksimum 15x105 (5ml) komórek DC zawierających każdy z plazmidów, a następnie przenieść połączone komórki DC do urządzenia G-Rex, które następnie należy umieścić w inkubatorze.
  3. Do przygotowania komórek responderów należy użyć wcześniej zamrożonych PBMC lub nieprzylegających komórek mononuklearnych pozostałych po selekcji DC (selekcja przez adhezję lub CD14). Rozmrozić komórki, przenieść do podgrzanego medium hodowlanego i przemyć raz medium CTL. Resuspendować komórki w medium CTL, policzyć je i doprowadzić do stężenia 2x106 komórek na ml. Odmierzyć 15x106 komórek (7,5ml) i uzupełnić o 30000U IL4 (stężenie końcowe 1000U/ml) oraz 300ng IL7 (stężenie końcowe 10ng/ml).
  4. Przenieść 7,5ml PBMC (15x106 komórek) do urządzenia G-Rex i uzupełnić bioreaktor medium CTL do całkowitej objętości 30ml.
  5. Inkubować urządzenie G-Rex przez 6-7 dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.

3. Ekspansja limfocytów T

  1. W 6-7 dniu odessać 10 ml pożywki, a następnie wymieszać komórki w pozostałych 20 ml pożywki za pomocą pipety 10 ml i policzyć żywe komórki z użyciem błękitu trypanu. Jeśli liczba komórek wynosi <50x106, uzupełnić świeżą pożywką z cytokinami. Jeśli liczba komórek wynosi >50x106, odjąć 10 ml zawiesiny komórkowej, przenieść ją do nowego naczynia G-Rex, a następnie zasilić oba naczynia G-Rex świeżą pożywką do CTL z cytokinami.
  2. Kulturować przez kolejne 4-6 dni. Po namnożeniu wystarczającej liczby komórek przeprowadzić charakterystykę fenotypową i funkcjonalną CTL oraz kriokonserwować nadmiar komórek do późniejszego wykorzystania.

4. Reprezentatywne wyniki:

Schemat naszego zatwierdzonego przez FDA procesu generowania specyficznych dla wielu wirusów limfocytów CTL przedstawiono na Rysunku 1. W przeciwieństwie do konwencjonalnych protokołów CTL przeciwko wielu wirusom, które wykorzystują adenowektory i EBV-LCL do stymulacji reaktywnych na wirusy limfocytów T2, zastąpiliśmy zakaźny materiał wirusowy plazmidami DNA kodującymi wiele antygenów pochodzących z każdego z wirusów3. Aby stymulować CTL przeciwko trzem wirusom, zaprojektowaliśmy trzy plazmidy multicistroniczne kodujące Hexon i Penton adenowirusa, IE1 i pp65 CMV oraz EBNA1, LMP2 i BZLF1 EBV. Antygeny te wybrano na podstawie obiecujących wyników klinicznych uzyskanych przez naszą oraz inne grupy, wykazujących, że limfocyty T skierowane przeciwko Adv-hexon i penton2,4-6 oraz przeciwko CMV-1E1 i CMV-pp65 wykazują działanie ochronne in vivo7. W przypadku EBV, EBNA1 jest immunodominującym antygenem docelowym dla limfocytów T CD4+ ekspresjowanym we wszystkich nowotworach związanych z EBV oraz w normalnych zakażonych EBV limfocytach B8,9, LMP2 jest immunogenny dla wielu typów HLA i ekspresywny w większości nowotworów wywołanych przez EBV10,11, natomiast BZLF1 koduje immunodominujący antygen wczesnej fazy litycznego cyklu replikacyjnego, który stymuluje limfocyty T CD4+ i CD8+ u większości osób i prawdopodobnie jest istotny dla kontroli komórek replikujących wirusa12. Aby dodatkowo zoptymalizować nasze metody wytwarzania, nawiązaliśmy współpracę z Nature Technology, która opracowała zminimalizowane, wolne od antybiotyków (zgodne z wymogami FDA) plazmidy do stymulacji CTL13,14. Stosując tę strategię, konsekwentnie osiągamy wydajność nukleofekcji na poziomie >35% przy zachowaniu wysokiej żywotności komórek (dane nie pokazano)3. Rysunek 2 pokazuje, że częstotliwość występowania limfocytów T specyficznych dla wirusów w odpowiedzi na zoptymalizowane plazmidy DNA, zmierzona za pomocą IFNγ ELIspot, była większa niż w odpowiedzi na konwencjonalne plazmidy ekspresyjne oparte na pShuttle ekspresujące te same antygeny (n=8 Adenowirus, n=4 CMV i n=2 EBV). Optymalny stosunek DC:PBMC był istotny dla silnej stymulacji limfocytów T, co pokazano na Rysunku 3, gdzie stosunek 1:50 spowodował suboptymalną aktywację w porównaniu ze stosunkiem S:R 1:20 (n=2 dawców). Produkcja wystarczającej liczby CTL o szerokiej swoistości antygenowej jest warunkiem koniecznym dla skuteczności klinicznej przeciwko wszystkim trzem wirusom. Jest to osiągane poprzez hodowlę CTL w systemie G-Rex, który zapewnia lepszą ekspansję limfocytów T w porównaniu z konwencjonalnymi płytkami 24-dołkowymi (Rysunek 4A)15, podczas gdy dodatek IL4 i IL7 do hodowli zwiększa repertuar i swoistość, co pokazano na Rysunku 4B, gdzie oceniono częstotliwość występowania limfocytów T reaktywnych przeciwko peptydowi NLV ograniczonemu przez HLA-A2 pochodzącemu z CMV-pp65 w hodowlach generowanych w obecności lub braku IL4 i/lub IL716,17. Aby ocenić fenotyp i zdolność funkcjonalną ekspandowanych komórek, przeprowadzamy analizę cytometryczną, wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin/IFNγ ELIspot oraz testy uwalniania Cr51 na produkcie końcowym przeznaczonym do krioterapii/infuzji. Zazwyczaj wygenerowane komórki są poliklonalne, z mieszaną populacją limfocytów T CD4+ i CD8+ ze swoistością antygenową wykrywalną w obu przedziałach limfocytów T. CTL są zdolne do zabijania komórek docelowych ekspresujących antygen wirusowy, ale nie zabijają komórek docelowych ujemnych pod kątem wirusa i częściowo dopasowanych pod względem HLA, co wskazuje, że nie powinny one indukować choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GvHD) in vivo (Rysunek 5).

Proces ekspansji CTL z wykorzystaniem nukleofekcji, bioreaktora, dodatku IL4+IL7 i infuzji; schemat.
Rysunek 1. Protokół generowania rCTL. W pierwszej kolejności komórki DC poddawane są nukleofekcji plazmidami kodującymi antygen wirusowy, a następnie mieszane z autologicznymi PBMC w stosunku R:S wynoszącym 10 lub 20:1. Komórki są namnażane w systemie G-Rex przez 10-14 dni w obecności IL4 i IL7, a następnie zbierane, przeliczane i testowane pod kątem funkcji, tożsamości oraz sterylności, po czym są kriokonserwowane do użytku klinicznego.

Wykres słupkowy porównujący wpływ plazmidów na poziomy IFN-γ w badaniu z zakresu immunologii eksperymentalnej.
Rysunek 2. Zoptymalizowane plazmidy DNA indukują silniejszą aktywację limfocytów T in vitro. Komórki DC poddano nukleofekcji zoptymalizowanymi, zgodnymi z FDA plazmidami kodującymi Hexon i Penton (Adv), IE1 i pp65 (CMV) oraz EBNA1, LMP2 i BZLF1 (EBV) lub konwencjonalnymi plazmidami pShuttle kodującymi te same antygeny. Wykorzystano je do stymulacji limfocytów T, a specyficzność przeanalizowano metodą IFNγ ELIspot 10 dni po stymulacji.

Wykresy słupkowe testu ELISPOT dla porównania odpowiedzi antygenowej; dwa stopnie rozcieńczenia, 1:20 i 1:50.
Rycina 3. Optymalne stosunki DC:komórki T dla aktywacji CTL. Komórki DC od dwóch dawców poddano nukleofekcji wszystkimi trzema zoptymalizowanymi plazmidami, a następnie wykorzystano je do stymulacji autologicznych PBMCs w stosunku DC:PBMC 1:20 lub 1:50. Częstotliwość reaktywowanych limfocytów T oceniono w 10. dniu za pomocą testu IFNγ ELIspot.

Schemat ekspansji hodowli komórkowych z wynikami cytometrii przepływowej; porównanie G-Rex i analizy cytokin.
Rycina 4. Ekspansja limfocytów T w urządzeniu G-Rex z zastosowaniem cytokin wspomagających. Panel A przedstawia urządzenie G-Rex oraz wygląd CTL na membranie przepuszczalnej dla gazów, oceniony za pomocą mikroskopii. Pokazano również porównanie wydajności komórkowej uzyskanej na konwencjonalnych płytkach do hodowli tkanek w stosunku do G-Rex. Panel B przedstawia częstość występowania CTL dodatnich pod kątem pentameru CMV w kulturach eksponowanych na brak cytokin, samą IL4, samą IL7 oraz IL4+IL7.

Analiza cytometrii przepływowej i odpowiedzi immunologicznej; wykresy kropkowe A, profile cytokin B, wykres lizy C.
Rycina 5. Fenotyp i funkcja namnożonych CTL. Panel A przedstawia reprezentatywny przykład fenotypu namnożonych wielowirusowych CTL, które są poliklonalne i stanowią mieszaninę limfocytów T CD4+ (45% – pomocnicze) oraz CD8+ (42% – cytotoksyczne), z których większość (95%) wykazuje ekspresję markerów pamięci CD45RO+/CD62L+. Panel B wykazuje, że komórki te są swoiste dla wszystkich antygenów stymulujących i są polifunkcyjne, co oceniono za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin w celu wykrycia produkcji IFNΓ i TNFα po stymulacji antygenem. Panel C pokazuje, że namnożone CTL są funkcjonalne, co zmierzono za pomocą testu z Cr51. Jako cele wykorzystano autologiczne LCL, samodzielnie lub transdukowane wektorem null bądź wektorem adenowirusowym ekspresującym CMV-pp65. Aloreaktywność oceniono, wykorzystując allogeniczne blasty PHA jako cele.

Dyskusja

Zakażenia wirusowe odpowiadają za znaczną zachorowalność i śmiertelność u pacjentów z niedoborem odporności wynikającym z choroby lub jej leczenia. Na przykład po HSCT dobrze znane są zakażenia wywołane przez trwałe herpeswirusy, takie jak EBV i CMV, a także przez wirusy oddechowe, takie jak wirus RSV, podczas gdy znaczenie zakażeń wywołanych przez Adv, wirusa BK i ludzkiego herpeswirusa (HHV)-6 zostało docenione w ostatnim czasie. Chociaż środki farmakologiczne stanowią standardową terapię w przypadku niektórych zakażeń, wiążą się one ze znaczną toksycznością, prowadzą do powstawania wariantów opornych i często okazują się nieskuteczne. W przeciwieństwie do nich, specyficzne dla wirusa limfocyty T pochodzące od dawców komórek macierzystych okazały się bezpieczne i skuteczne w zapobieganiu oraz leczeniu zakażeń lub chorób wirusowych w kontekście przeszczepienia hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT)2,5,6,18-21. Jednak szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T jest ostatecznie ograniczone przez koszt, złożoność i czas wymagany do produkcji CTL.

Nasze nowatorskie i szybkie podejście do generowania wielowirusowych CTL, opisane w niniejszym manuskrypcie, powinno znacząco zwiększyć wykonalność terapii cytotoksycznymi limfocytami T w chorobach wirusowych, umożliwiając przekształcenie tej strategii w standard opieki nad pacjentami z niedoborem odporności. Wykorzystanie nukleofektowanych plazmidami komórek DC jako APC umożliwia prezentację antygenu zarówno na cząsteczkach MHC klasy I, jak i II, bez konkurencji ze strony wektorów wirusowych czy wielu antygenów wirusowych eksprymowanych w jednej komórce, ponieważ dla każdego plazmidu wykorzystywane są różne populacje DC3. Zastosowanie IL-4/7 zwiększa przeżywalność i proliferację limfocytów T, co w konsekwencji pomaga zwiększyć częstotliwość i repertuar odpowiadających limfocytów T specyficznych dla antygenu16,17. Wreszcie, hodowla w systemie G-Rex drastycznie redukuje apoptozę limfocytów T podczas inkubacji. Wymiana gazowa (napływ O2 i odpływ CO2) odbywa się przez przepuszczalną dla gazów membranę silikonową u podstawy kolby, co zapobiega hipoksji, jednocześnie pozwalając na większą głębokość pożywki nad komórkami, co zapewnia więcej składników odżywczych i rozcieńcza produkty przemiany materii. Platformę tę można rozszerzyć o dodatkowe wirusy w miarę identyfikacji antygenów ochronnych.

Oświadczenia

Juan F. Vera jest konsultantem w firmie Wilson Wolf Manufacturing. Pozostali autorzy nie zgłosili żadnych istotnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta jest wspierana przez program Production Assistance for Cellular Therapies (kontrakt NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (C.M.R.), grant Specialized Centers for Cell-based Therapy NIH-NHLBI 1 U54 HL081007 (C.M.R.), nagrodę ASBMT Young Investigator Award (U.G. i J.V.), nagrodę Leukemia and Lymphoma Society Special Fellow in Clinical Research Award (U.G.) oraz nagrodę Amy Strelzer Manasevit Scholar Award (A.M.L).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CellGenixCellGenix2005
IL4R&D Systems204-IL/CF
IL7PeproTech Inc200-15
Hyclone RPMI 1640Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30096.01
Ludzkie surowica ABValley Biomedical, Inc.HP1022
NukleofektorAmaxaAAF-1001B & AAF-1001X
Zestaw do nukleofekcjiAmaxaV4XP-3012
PlazmidyNTCn/a
GM-CSFR&D Systems215-GM/CF
IL1R&D Systems201-LB-025
IL6R&D Systems206-IL-CF
TNFαR&D Systems210-TA-010
PGE2Sigma-AldrichP6532-1MG
G-RexWilson Wolf ManufacturingAY11-00027

Bibliografia

  1. Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale. J Immunother. 31, 359-369 (2008).
  2. Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).
  3. Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host. Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).
  4. Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy. J Virol. 82, 546-554 (2008).
  5. Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation. Blood. 114, 4283-4292 (2009).
  6. Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).
  7. Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells. J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).
  8. Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses. J Virol. 75, 8649-8659 (2001).
  9. Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function. J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).
  10. Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma. J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).
  11. Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus. Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).
  12. Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response. J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).
  13. Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system. Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).
  14. Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids. Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).
  15. Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex. Journal of Immunotherapy. , Forthcoming (2009).
  16. Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).
  17. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).
  18. Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes. Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).
  19. Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation. Lancet. 345, 9-13 (1995).
  20. Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916-3922 (2002).
  21. Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Allogeniczne HSCTnukleofekcja kom rek dendrytycznychplazmidy z antygenami wirusowymihodowla z IL 4 i IL 7bioreaktor G Rexprotok ekspansji CTLwewn trzkom rkowe barwienie cytokintest uwalniania chromuwytwarzanie zgodnie z GMP

Powiązane artykuły