Artykuł metodologiczny

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

18.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2736

⸱

27 maja 2011

 ,  ,  , 
1Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Streszczenie

Zakażenia wirusowe powodują zachorowalność i śmiertelność u biorców allogenicznych przeszczepów krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT). My oraz inni badacze z sukcesem generowaliśmy i wlewaliśmy limfocyty T specyficzne dla wirusa Epsteina-Barr (EBV), cytomegalowirusa (CMV) i adenowirusa (Adv), wykorzystując monocyty oraz limfoblastoidalne linie komórkowe transformowane przez EBV (EBV-LCL), zmodyfikowane genetycznie za pomocą wektora adenowirusowego jako komórki prezentujące antygen (APCs). Już 2x105/kg cytotoksycznych limfocytów T (CTL) specyficznych dla trzech wirusów proliferowały o kilka rzędów wielkości po infuzji i wydawały się zapobiegać oraz leczyć nawet ciężkie choroby wirusowe oporne na inne dostępne terapie. Szersze wdrożenie tego obiecującego podejścia jest ograniczone przez wysokie koszty produkcji, złożoność procesu wytwarzania oraz długi czas przygotowania (4-6 tygodni na generowanie EBV-LCL i 4-8 tygodni na produkcję CTL – łącznie 10-14 tygodni). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy nowy protokół produkcji CTL zgodny z zasadami GMP. Po pierwsze, zamiast adeno-wektorów do stymulacji limfocytów T, stosujemy komórki dendrytyczne (DCs) poddane nukleofekcji plazmidami DNA kodującymi LMP2, EBNA1 i BZLF1 (EBV), Hexon i Penton (Adv) oraz pp65 i IE1 (CMV) jako komórki prezentujące antygen. Te APCs reaktywują limfocyty T specyficzne dla wszystkich stymulujących antygenów. Po drugie, hodowla aktywowanych limfocytów T w obecności IL-4 (1,000U/ml) i IL-7 (10ng/ml) zwiększa i podtrzymuje repertuar oraz częstotliwość specyficznych limfocytów T w naszych liniach. Po trzecie, zastosowaliśmy nowe, przepuszczalne dla gazów urządzenie do hodowli (G-Rex), które sprzyja ekspansji i przeżywalności dużych liczb komórek po pojedynczej stymulacji, co eliminuje konieczność stosowania EBV-LCL i zmniejsza interwencje techników. Dzięki wprowadzeniu tych zmian możemy obecnie produkować wielospecyficzne CTL nakierowane na EBV, CMV i Adv przy koszcie za 106 komórek zredukowanym o >90%, w zaledwie 10 dni zamiast 10 tygodni, stosując podejście, które można rozszerzyć na dodatkowe ochronne antygeny wirusowe. Nasze zatwierdzone przez FDA podejście powinno mieć wartość w zastosowaniach profilaktycznych i terapeutycznych dla biorców allogenicznych HSCT z grupy wysokiego ryzyka.

Protokół

1. Nukleofekcja komórek DC

  1. Zebrać komórki DC pochodzące z monocytów, które zostały wzbogacone poprzez adhezję do plastiku, hodowane przez 5 dni w pożywce Cell Genix uzupełnionej o IL4(1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) i dodatkowo dojrzewane przez 24h przy użyciu cytokin dojrzewania DC: IL4(1000U/ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml oraz PGE2 (1μg/ml)1, poprzez delikatne resuspensowanie za pomocą pipety transferowej 3ml.
  2. Policzyć żywe komórki DC przy użyciu błękitu trypanu, a następnie przenieść je do trzech probówek 15ml, tak aby w każdej probówce znalazło się nie mniej niż 0,5x106 i nie więcej niż 2x106 komórek/probówkę.
  3. Wirować komórki DC przez 10min przy 200g. W tym czasie wstępnie ogrzać pożywkę Cell Genix uzupełnioną o cytokiny dojrzewania DC (pożywka dojrzewania DC) – 2ml/dołek w trzech dołkach płytki 12-dołkowej przeznaczonej do hodowli tkanek w inkubatorze 37°C/5% CO2.
  4. Po zakończeniu wirowania odessać nadosad i dodać odpowiednie plazmidy DNA do każdej z probówek w końcowym stężeniu 5μg DNA/probówkę. W tym przypadku dodać plazmid kodujący IE1-pp65 do probówki nr 1, Hexon-Penton do probówki nr 2 oraz EBNA1-LMP2-BZLF1 do probówki nr 3.
  5. Resuspender komórki DC i DNA w 100μl roztworu do nukleofekcji Amaxa, dobrze wymieszać i przenieść do kuwet do nukleofekcji.
  6. Umieścić kuwety w nukleofektorze 4D, wybrać program CB150 (Amaxa/Lonza) i nacisnąć start.
  7. Natychmiast po nukleofekcji dodać 500μl z 2ml wstępnie ogrzanej pożywki dojrzewania DC Cell Genix do kuwety, delikatnie wymieszać poprzez 2-3 krotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść nukleofektowane komórki DC na przygotowaną płytkę 12-dołkową zawierającą pozostałe 1,5 ml wstępnie ogrzanej pożywki dojrzewania DC. Przenieść do inkubatora 37°C/5% CO2 na kolejne 12-18h.

2. Stymulacja limfocytów T

  1. Zebrać i policzyć nukleofektowane komórki DC, a następnie napromieniować dawką 30Gy. Przemyć raz 10ml pożywki CTL (45% RPMI, 45% Clicks EHAA, 10% FBS, 2mM Glutamax) i resuspender w stężeniu 3 x 105 komórek DC na ml pożywki CTL.
  2. Połączyć minimum 7,5x105 (2,5ml) i maksimum 15x105 (5ml) komórek DC zawierających każdy z plazmidów, a następnie przenieść połączone komórki DC do urządzenia G-Rex, które zostanie umieszczone w inkubatorze.
  3. Do przygotowania komórek responderów użyć wcześniej zamrożonych PBMC lub nieprzylegających komórek mononuklearnych pozostałych po selekcji DC (selekcja przez adhezję lub CD14). Rozmrozić komórki, przenieść do uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej i przemyć raz pożywką CTL. Resuspender komórki w pożywce CTL, policzyć je i doprowadzić do stężenia 2x106 komórek na ml. Odmierzyć 15x106 komórek (7,5ml) i uzupełnić o 30000U IL4 (stężenie końcowe 1000U/ml) oraz 300ng IL7 (stężenie końcowe 10ng/ml).
  4. Przenieść 7,5ml PBMC (15x106 komórek) do urządzenia G-Rex i uzupełnić bioreaktor pożywką CTL do całkowitej objętości 30ml.
  5. Inkubować urządzenie G-Rex przez 6-7 dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.

3. Ekspansja limfocytów T

  1. W dniu 6-7 odessać 10ml pożywki, następnie wymieszać komórki w pozostałych 20ml pożywki za pomocą pipety 10ml i policzyć żywe komórki przy użyciu błękitu trypanu. Jeśli liczba komórek wynosi <50x106, uzupełnić świeżą pożywką + cytokinami. Jeśli liczba komórek wynosi >50x106, odessać 10ml zawiesiny komórkowej, przenieść do nowego G-Rex, a następnie zasilić oba G-Rex świeżą pożywką CTL + cytokinami.
  2. Kulturować przez kolejne 4-6 dni. Po namnożeniu odpowiedniej liczby komórek przeprowadzić charakterystykę fenotypową i funkcjonalną CTL oraz kriokonserwować nadmiar komórek do późniejszego użycia.

4. Reprezentatywne wyniki:

Schemat naszego zatwierdzonego przez FDA procesu generowania CTL specyficznych dla wielu wirusów przedstawiono na Rysunku 1. W przeciwieństwie do konwencjonalnych protokołów CTL dla wielu wirusów, w których do stymulacji limfocytów T reaktywnych na wirusy wykorzystuje się adenowektory i EBV-LCL2, zastąpiliśmy materiał wirusowy zakaźny plazmidami DNA kodującymi wiele antygenów pochodzących z każdego z wirusów3. Aby stymulować CTL przeciwko trzem wirusom, zaprojektowaliśmy trzy plazmidy wielocistronowe kodujące Hexon i Penton adenowirusa, IE1 i pp65 CMV oraz EBNA1, LMP2 i BZLF1 EBV. Antygeny te wybrano w oparciu o obiecujące wyniki kliniczne uzyskane przez naszą oraz inne grupy, wykazujące, że limfocyty T skierowane przeciwko Adv-hexon i penton2,4-6, a także przeciwko CMV-1E1 i CMV-pp65, wykazują działanie ochronne in vivo7. W przypadku EBV, EBNA1 jest immunodominującym antygenem docelowym dla limfocytów T CD4+, eksprymowanym we wszystkich nowotworach związanych z EBV oraz w prawidłowych zainfekowanych EBV limfocytach B8,9, LMP2 jest immunogenny dla wielu typów HLA i eksprymowany w większości nowotworów wywołanych przez EBV10,11, natomiast BZLF1 koduje immunodominujący antygen wczesny cyklu litycznego, który stymuluje limfocyty T CD4+ i CD8+ u większości osób i jest prawdopodobnie istotny dla kontroli komórek replikujących wirusa12. W celu dalszej optymalizacji naszych metod wytwarzania nawiązaliśmy współpracę z Nature Technology, która opracowała zminimalizowane, wolne od antybiotyków (zgodne z wymogami FDA) plazmidy do stymulacji CTL13,14. Stosując tę strategię, konsekwentnie osiągamy wydajność nukleofekcji >35%, zachowując jednocześnie wysoką żywotność komórek (dane nie pokazano)3. Rysunek 2 pokazuje, że częstotliwość występowania limfocytów T specyficznych dla wirusów w odpowiedzi na zoptymalizowane plazmidy DNA, zmierzona za pomocą testu IFNγ ELIspot, była większa niż w odpowiedzi na konwencjonalne plazmidy ekspresyjne oparte na pShuttle ekspresujące te same antygeny (n=8 Adenowirus, n=4 CMV i n=2 EBV). Optymalny stosunek DC:PBMC był istotny dla silnej stymulacji limfocytów T, co pokazano na Rysunku 3, gdzie stosunek 1:50 spowodował suboptymalną aktywację w porównaniu ze stosunkiem S:R 1:20 (n=2 dawców). Produkcja wystarczającej liczby CTL o szerokiej swoistości antygenowej jest warunkiem wstępnym skuteczności klinicznej przeciwko wszystkim trzem wirusom. Osiąga się to poprzez hodowlę CTL w systemie G-Rex, który zapewnia lepszą ekspansję limfocytów T w porównaniu z konwencjonalnymi płytkami 24-dołkowymi (Rysunek 4A)15, podczas gdy dodanie IL4 i IL7 do kultur zwiększa repertuar i specyficzność, co pokazano na Rysunku 4B, gdzie oceniono częstotliwość limfocytów T reaktywnych przeciwko peptydowi NLV pochodzącemu z CMV-pp65, ograniczonemu do HLA-A2, w kulturach generowanych w obecności lub nieobecności IL4 i/lub IL716,17. Aby ocenić fenotyp i zdolność funkcjonalną rozszerzonych komórek, przeprowadzamy analizę cytometryczną, wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin/IFNγ ELIspot oraz testy uwalniania Cr51 na produkcie końcowym przeznaczonym do kriosprzechowywania/infuzji. Zazwyczaj generowane komórki są poliklonalne, z mieszaną populacją limfocytów T CD4+ i CD8+ ze swoistością antygenową wykrywalną w obu przedziałach limfocytów T. CTL są zdolne do zabijania komórek docelowych ekspresjonujących antygeny wirusowe, ale nie zabijają komórek docelowych ujemnych pod kątem wirusa i częściowo dopasowanych pod kątem HLA, co wskazuje, że nie powinny one indukować choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GvHD) in vivo (Rysunek 5).

Schemat procesu nukleofekcji; ekspansja CTL w bioreaktorze; zastosowanie plazmidowego DNA; wynik infuzji.
Rycina 1. Protokół generowania rCTL. Najpierw komórki DC poddawane są nukleofekcji plazmidami kodującymi antygen wirusowy, a następnie mieszane z autologicznymi PBMC w stosunku R:S wynoszącym 10 lub 20:1. Komórki są namnażane w systemie G-Rex przez 10-14 dni w obecności IL4 i IL7, po czym są zbierane, liczone, badane pod kątem funkcji, tożsamości i sterylności, a następnie krio konserwowane do zastosowań klinicznych.

Wykres słupkowy porównujący produkcję IFN-γ w eksperymentach z kontrolą plazmidową i optymalizacją.
Rysunek 2. Zoptymalizowane plazmidy DNA indukują silniejszą aktywację limfocytów T in vitro. Komórki DC poddano nukleofekcji zoptymalizowanymi plazmidami zgodnymi z FDA kodującymi Hexon i Penton (Adv), IE1 i pp65 (CMV) oraz EBNA1, LMP2 i BZLF1 (EBV) lub konwencjonalnymi plazmidami pShuttle kodującymi te same antygeny. Wykorzystano je do stymulacji limfocytów T, a swoistość przeanalizowano za pomocą testu IFNγ ELIspot 10 dni po stymulacji.

Wykres słupkowy porównujący odpowiedź immunologiczną; SFC/2x10^5 CTL przeciwko antygenom przy rozcieńczeniach 1:20, 1:50.
Rycina 3. Optymalne stosunki DC:komórki T dla aktywacji CTL. Komórki DC od 2 dawców poddano nukleofekcji za pomocą wszystkich trzech zoptymalizowanych plazmidów, a następnie wykorzystano do stymulacji autologicznych PBMCs w stosunku DC:PBMC 1:20 lub 1:50. Częstość reaktywowanych limfocytów T oceniono w 10. dniu za pomocą testu IFNγ ELIspot.

Schemat ekspansji hodowli komórkowych i wyniki cytometrii przepływowej, pokazujące efekty cytokin IL-4 i IL-7.
Rysunek 4. Ekspansja limfocytów T w urządzeniu G-Rex z wykorzystaniem cytokin wspomagających. Panel A przedstawia urządzenie G-Rex oraz wygląd CTL na membranie przepuszczalnej dla gazów, oceniony za pomocą mikroskopii. Przedstawiono również porównanie wydajności komórkowej uzyskanej na konwencjonalnych płytkach hodowlanych w porównaniu do G-Rex. Panel B przedstawia częstotliwość występowania CTL dodatnich pod kątem pentameru CMV uzyskanych w hodowlach eksponowanych na brak cytokin, samą IL-4, samą IL-7 oraz kombinację IL-4+IL-7.

Analiza cytometrii przepływowej, podzbiory komórek odpornościowych; różnicowanie CD4/CD8, wykresy odpowiedzi cytokinowej.
Rysunek 5. Fenotyp i funkcja namnożonych CTL. Panel A przedstawia reprezentatywny przykład fenotypu namnożonych wielowirusowych CTL, które są poliklonalne i zawierają mieszankę limfocytów T CD4+ (45% – pomocnicze) i CD8+ (42% – cytotoksyczne), z których większość (95%) wykazuje ekspresję markerów pamięci CD45RO+/CD62L+. Panel B wykazuje, że komórki te są specyficzne dla wszystkich antygenów stymulujących i są polifunkcyjne, co oceniono za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin w celu wykrycia produkcji IFNΓ i TNFα po stymulacji antygenowej. Panel C wykazuje, że namnożone CTL są funkcjonalne, co zmierzono testem z Cr51. Jako komórki docelowe wykorzystano autologiczne LCL, samodzielnie lub transdukowane wektorem null lub wektorem adenowirusowym wykazującym ekspresję CMV-pp65. Aloreaktywność oceniono, wykorzystując allogeniczne blasty PHA jako komórki docelowe.

Dyskusja

Zakażenia wirusowe odpowiadają za znaczną zachorowalność i śmiertelność u pacjentów z niedoborem odporności wynikającym z choroby lub jej leczenia. Na przykład po HSCT dobrze znane są zakażenia wywołane przez trwałe herpeswirusy, takie jak EBV i CMV, a także przez wirusy oddechowe, takie jak wirus RSV, podczas gdy znaczenie zakażeń wywołanych przez Adv, wirusa BK i ludzkiego herpeswirusa (HHV)-6 zostało docenione w ostatnim czasie. Chociaż środki farmakologiczne stanowią standardową terapię w przypadku niektórych zakażeń, wiążą się one ze znaczną toksycznością, prowadzą do powstawania wariantów opornych i często okazują się nieskuteczne. W przeciwieństwie do nich, specyficzne dla wirusa limfocyty T pochodzące od dawców komórek macierzystych okazały się bezpieczne i skuteczne w zapobieganiu oraz leczeniu zakażeń lub chorób wirusowych w kontekście przeszczepienia hematopoetycznych komórek macierzystych (HSCT)2,5,6,18-21. Jednak szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T jest ostatecznie ograniczone przez koszt, złożoność i czas wymagany do produkcji CTL.

Nasze nowatorskie i szybkie podejście do generowania wielowirusowych CTL, opisane w niniejszym manuskrypcie, powinno znacząco zwiększyć wykonalność terapii cytotoksycznymi limfocytami T w chorobach wirusowych, umożliwiając przekształcenie tej strategii w standard opieki nad pacjentami z niedoborem odporności. Wykorzystanie nukleofektowanych plazmidami komórek DC jako APC umożliwia prezentację antygenu zarówno na cząsteczkach MHC klasy I, jak i II, bez konkurencji ze strony wektorów wirusowych czy wielu antygenów wirusowych eksprymowanych w jednej komórce, ponieważ dla każdego plazmidu wykorzystywane są różne populacje DC3. Zastosowanie IL-4/7 zwiększa przeżywalność i proliferację limfocytów T, co w konsekwencji pomaga zwiększyć częstotliwość i repertuar odpowiadających limfocytów T specyficznych dla antygenu16,17. Wreszcie, hodowla w systemie G-Rex drastycznie redukuje apoptozę limfocytów T podczas inkubacji. Wymiana gazowa (napływ O2 i odpływ CO2) odbywa się przez przepuszczalną dla gazów membranę silikonową u podstawy kolby, co zapobiega hipoksji, jednocześnie pozwalając na większą głębokość pożywki nad komórkami, co zapewnia więcej składników odżywczych i rozcieńcza produkty przemiany materii. Platformę tę można rozszerzyć o dodatkowe wirusy w miarę identyfikacji antygenów ochronnych.

Oświadczenia

Juan F. Vera jest konsultantem w firmie Wilson Wolf Manufacturing. Pozostali autorzy nie zgłosili żadnych istotnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta jest wspierana przez program Production Assistance for Cellular Therapies (kontrakt NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (C.M.R.), grant Specialized Centers for Cell-based Therapy NIH-NHLBI 1 U54 HL081007 (C.M.R.), nagrodę ASBMT Young Investigator Award (U.G. i J.V.), nagrodę Leukemia and Lymphoma Society Special Fellow in Clinical Research Award (U.G.) oraz nagrodę Amy Strelzer Manasevit Scholar Award (A.M.L).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CellGenixCellGenix2005
IL4R&D Systems204-IL/CF
IL7PeproTech Inc200-15
Hyclone RPMI 1640Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30096.01
Ludzkie surowica ABValley Biomedical, Inc.HP1022
NukleofektorAmaxaAAF-1001B & AAF-1001X
Zestaw do nukleofekcjiAmaxaV4XP-3012
PlazmidyNTCn/a
GM-CSFR&D Systems215-GM/CF
IL1R&D Systems201-LB-025
IL6R&D Systems206-IL-CF
TNFαR&D Systems210-TA-010
PGE2Sigma-AldrichP6532-1MG
G-RexWilson Wolf ManufacturingAY11-00027

Bibliografia

  1. Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale. J Immunother. 31, 359-369 (2008).
  2. Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).
  3. Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host. Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).
  4. Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy. J Virol. 82, 546-554 (2008).
  5. Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation. Blood. 114, 4283-4292 (2009).
  6. Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).
  7. Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells. J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).
  8. Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses. J Virol. 75, 8649-8659 (2001).
  9. Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function. J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).
  10. Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma. J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).
  11. Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus. Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).
  12. Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response. J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).
  13. Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system. Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).
  14. Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids. Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).
  15. Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex. Journal of Immunotherapy. , Forthcoming (2009).
  16. Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).
  17. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).
  18. Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes. Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).
  19. Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation. Lancet. 345, 9-13 (1995).
  20. Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916-3922 (2002).
  21. Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Allogeniczne HSCTnukleofekcja kom rek dendrytycznychplazmidy z antygenami wirusowymihodowla z IL 4 i IL 7bioreaktor G Rexprotok ekspansji CTLwewn trzkom rkowe barwienie cytokintest uwalniania chromuwytwarzanie zgodnie z GMP

Powiązane artykuły