Bezkomórkowy system analizy szacujący zdolność neutralizacji przeciwciał przeciw GM-CSF z wykorzystaniem rekombinowanego rozpuszczalnego receptora GM-CSF

Podsumowanie

Opracowaliśmy bezkomórkowy test wiązania receptorowego w celu oszacowania wiązania czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF) z receptorami. Umożliwia on ocenę konkurencyjnego hamowania wiązania biotynylowanego GM-CSF do rozpuszczalnego receptora alfa GM-CSF przez autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF z doskonałą powtarzalnością.

Streszczenie

WSTĘP: Wcześniej wykazaliśmy, że zdolność neutralizacji, a nie stężenie autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF, korelowała z ciężkością choroby u pacjentów z autoimmunologiczną białkowicą pęcherzyków płucnych (PAP)^1-3. Ponieważ zniesienie bioaktywności GM-CSF w płucach jest prawdopodobną przyczyną autoimmunologicznej PAP^4,5, pomiar zdolności neutralizacji autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF wydaje się obiecującą metodą oceny ciężkości choroby u każdego pacjenta z PAP.

Do tej pory zdolność neutralizującą autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF oceniano poprzez analizę zahamowania wzrostu komórek szpiku kostnego człowieka lub komórek TF-1 stymulowanych GM-CSF^6-8. W systemach bioanalizy uzyskanie wiarygodnych danych, jak i ich porównywanie między różnymi laboratoriami, jest jednak często problematyczne ze względu na trudności techniczne w utrzymaniu komórek w stałym stanie.

CEL: Naśladowanie wiązania GM-CSF z receptorem GM-CSF na powierzchni komórki za pomocą bezkomórkowego testu wiązania receptorowego.

METODY: Technologię transgenicznych jedwabników zastosowano w celu otrzymania dużej ilości rekombinowanego rozpuszczalnego receptora alfa GM-CSF (sGMRα) o wysokiej czystości^9-13. Rekombinowany sGMRα znajdował się w hydrofilnych warstwach serycyny nici jedwabnych, nie będąc złączonym z białkami jedwabiu, dzięki czemu można go łatwo wyekstrahować z kokonów z dobrą czystością przy użyciu neutralnych roztworów wodnych^14,15. Na szczęście struktury oligosacharydowe, które są kluczowe dla wiązania z GM-CSF, są bardziej podobne do struktur ludzkiego sGMRα niż te produkowane przez inne owady lub drożdże.

WYNIKI: Bezkomórkowy system analizy z wykorzystaniem sGMRα dostarczył danych o wysokiej plastyczności i niezawodności. Wiązanie GM-CSF do sGMRα było hamowane w sposób zależny od dawki przez poliklonalne autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF, w sposób podobny do analizy biologicznej z użyciem komórek TF-1, co wskazuje, że opracowany przez nas nowy bezkomórkowy system analizy z wykorzystaniem sGMRα jest bardziej użyteczny do pomiaru aktywności neutralizującej autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF niż system analizy biologicznej z użyciem komórek TF-1 lub ludzkich komórek szpiku kostnego.

WNIOSKI: Opracowaliśmy bezkomórkowy test ilościowo określający zdolność neutralizacji autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF.

Protokół

1. Produkcja i oczyszczanie sGMRα

1. Przeprowadzić amplifikację cDNA sGMRα z biblioteki cDNA łożyska ludzkiego za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
2. Za pomocą kolejnej reakcji PCR do amplikonu PCR dodać 50-nukleotydową sekwencję 5'-UTR końca poliedryny bakulowirusa oraz 27-nukleotydową kodującą sekwencję znacznika His na końcu 3'.
3. Wprowadzić amplifikowany produkt PCR do plazmidu pMSG1.1MG.
4. Wstrzyknąć konstrukt psGMR/M1.1MG wraz z wektorem pomocniczym pHA3PIG do jaj jedwabników szczepu pnd-w1.
5. Hodować wyklute larwy G0 do stadium ćmy w temperaturze 25°C. Przesiewowo wyselekcjonować embriony G1, uzyskane w wyniku kojarzenia rodzeństwa lub krzyżowania z pnd-w1, pod kątem ekspresji MGFP w oczach, aby otrzymać transgeniczne jedwabniki niosące gen sGMRα.
6. Wyekstrahować rekombinowane sGMRα z kokonów transgenicznych jedwabników przy użyciu buforu fosforanowego zawierającego 500mM NaCl i mieszać w temperaturze 4°C przez 24h.
7. Wirować próbkę z prędkością 20000 g przez 15min w celu usunięcia osadu.
8. Nałożyć nadsącz na kolumnę z powinowactwem do niklu.
9. Przemyć kolumnę roztworem 10mM imidazolu, 500mM NaCl i 20mM fosforanu sodu (pH6.3), a następnie eluować liniowym gradientem imidazolu od 10mM do 250mM. Połączyć frakcje zawierające oczyszczone sGMRα i poddać dializie przeciwko soli fosforanowo-buforowanej (pH7.4) (PBS).

2. Biotynylacja rekombinowanego GM-CSF

1. Usunąć sorbitol z preparatu poprzez dializę przeciwko PBS.
2. Do roztworu znajdującego się na lodzie dodać 1ml zimnego roztworu nadjodynianu sodu 20mM w temperaturze 4°C.
3. Inkubować próbkę przez 30min na lodzie w ciemności.
4. Dodać do roztworu glicerol do końcowego stężenia 15mM.
5. Przeprowadzić dializę roztworu przeciwko buforowi octan sodu 100mM (pH5.5).
6. Dodać do roztworu hydrazyd biotyny do końcowego stężenia 5mM i mieszać roztwór w sposób ciągły przez 2h w temperaturze pokojowej.
7. Usunąć nieprzereagowany materiał poprzez dializę przeciwko PBS, pH7.4.

3. Bezkomórkowy test wiązania ligandu z receptorem GM-CSF

1. Płytkę mikrotitracyjną pokryć 50μl monoklonalnego przeciwciała anty-polyHistidine i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
2. Przemyć pięciokrotnie 500μl PBST.
3. Dodać 100μl roztworu blokującego i inkubować przez 3h w temperaturze 4°C.
4. Przemyć pięciokrotnie 500μl PBST.
5. Dodać 50μl sGMRα w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
6. Przemyć pięciokrotnie 500μl PBST.
7. Dodać 25μl próbek zawierających autoprzeciwciała przeciw GM-CSF, a następnie 25μl biotinylowanego GM-CSF. Inkubować przez 1h w temperaturze 4°C w celu utworzenia kompleksu sGMRα-GM-CSF.
8. Przemyć pięciokrotnie 500μl PBST.
9. Dodać 50μl 0.4mM fosfatazy alkalicznej sprzężonej ze streptawidyną i inkubować przez 1h w temperaturze 4°C w celu detekcji sGMRα związanego z biotinylowanym GM-CSF.
10. Przemyć pięciokrotnie 500μl PBST.
11. Do roztworu dodać 50μl substratu chemiluminescencyjnego i inkubować przez 1h w temperaturze pokojowej.
12. Za pomocą czytnika płytek do chemiluminescencji zmierzyć aktywność chemiluminescencyjną.

4. Reprezentatywne wyniki:

Pierwszym etapem szlaku transdukcji sygnału receptora GM-CSF jest wiązanie GM-CSF z receptorami GM-CSF alfa na powierzchni komórki. Ponieważ autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF specyficznie wiążą GM-CSF i blokują jego wiązanie z receptorem in vitro ^16,17, postawiliśmy hipotezę, że autoprzeciwciała te hamują tę pierwszą reakcję poprzez bezpośrednie wiązanie się z GM-CSF. Jak opisano wcześniej (Ref. 9-15), zastosowaliśmy technologię transgenicznych jedwabników w celu uzyskania dużej ilości rekombinowanego sGMRα o wysokiej czystości.

Podczas aplikacji rekombinowanego sGMRα pochodzącego z jedwabnika na żel SDS-PAGE w warunkach nieredukujących, sGMRα wykazywał formy monomerowe (45 kDa) i dimeryczne (90 kDa), podczas gdy w warunkach redukujących wykryto jedynie formę monomerową (Rycina 1B), co wskazuje, że rekombinowany sGMRα był mieszaniną monomerów i dimerów połączonych mostkami dwusiarczkowymi¹⁸.

Wykorzystując układ bezkomórkowy (Rys. 2A), oceniliśmy hamowanie wiązania GM-CSF do sGMRα przez autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF (Rys. 2B i Rys. 2C). Metody te zostały opisane w publikacji nr 19 przez Urano i wsp. Hamowanie wzrostu ściśle korelowało z hamowaniem wiązania (r=0.988, p=0.002) przy różnych stężeniach autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF (Rys. 3A)¹⁹. Podobnie, hamowanie wiązania istotnie korelowało z hamowaniem wzrostu. Hamowanie wiązania przez autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF wzrastało w sposób zależny od dawki (Rys. 3B)¹⁹. Te dwa parametry dla frakcji IgG z surowicy różnych pacjentów były ze sobą skorelowane (r=0.589 p=0.006, Rys. 3C). Ani hamowanie wiązania, ani hamowanie wzrostu nie korelowały z wartościami Kd, a zatem oba parametry nie były zależne od powinowactwa wiązania¹⁹. W konsekwencji oceniono powtarzalność danych między hamowaniem wiązania a hamowaniem wzrostu uzyskanych w trzech niezależnych eksperymentach na trzech różnych próbkach. Współczynnik zmienności wykazał, że układ bezkomórkowy był wydajniejszy niż bioassay (tabela 1).

Rysunek 1. Schemat procedury produkcji sGMRα przy użyciu transgenicznych jedwabników. A) Struktury wektorów transformacyjnych^9-11. B) SDS-PAGE i barwienie Coomassie Brilliant Blue oczyszczonego sGMRα w warunkach redukujących i nieredukujących. sGMRα, rozpuszczalny receptor alfa GM-CSF; MGFP, monster green fluorescent protein; BmNPVpol5'-UTR, sekwencja 5'-nieprzetłumaczonego regionu poliedryny wirusa poliedrozy jądrowej Bombyx mori; SV40 polyA, sekwencja sygnału polyA SV40; P_3xP3, promotor 3xP3; P_ser1, promotor ser1; fibL polyA, sekwencja sygnału polyA łańcucha L fibroiny; hr3, enhancer hr3 wirusa poliedrozy jądrowej Bombyx mori.

Rysunek 2. Schemat bezkomórkowego systemu testowego. A) Konkurencyjny test wiązania z użyciem sGMRα produkowanego przez jedwabnika. B) Wpływ przeciwciał neutralizujących i nienaturalizujących na hamowanie wiązania w systemie bezkomórkowym. C) Różnica w hamowaniu wiązania pomiędzy różnymi stężeniami przeciwciał neutralizujących i nienaturalizujących. GM-CSF, czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów; sGMRα, rozpuszczalny receptor alfa GM-CSF; His, znacznik RGS-His; AP, fosfataza alkaliczna.

Rycina 3. Hamowanie wiązania GM-CSF do sGMRα pod wpływem poliklonalnych przeciwciał przeciwko GM-CSF lub frakcji IgG surowicy pacjentów z autoimmunologicznym PAP. A) Zależność między hamowaniem wiązania a hamowaniem wzrostu przez autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF. B) Hamowanie wiązania przy różnych stężeniach autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF. C) Zależność między IC₅₀ dla procentowego hamowania wiązania a procentowym hamowaniem wzrostu przez frakcje IgG surowicy¹⁹. IC₅₀, stężenie hamujące 50%; GM-CSF, czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów.

Próbka	A	B	C
Międzyanaliza
Liczba oznaczeń	3	3	3
Wartość średnia (% inhibicji wiązania)	61.6	63.8	69.7
Wartość średnia (% inhibicji wzrostu)	21.0	73.4	82.8
Współczynnik zmienności (%) (% inhibicji wiązania)	6.0	5.6	8.3
Współczynnik zmienności (%) (% inhibicji wzrostu)	64.4	18.3	10.4

Oba testy przeprowadzono przy stężeniu 5 ng/ml GM-CSF oraz stężeniu równym stężeniu autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF.

Tabela 1. Porównanie współczynników zmienności między procentem wiązania a hamowaniem wzrostu uzyskanymi w trzech niezależnych eksperymentach.

Dyskusja

Test bezkomórkowy pozwolił oszacować zdolność neutralizacyjną autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF z doskonałą powtarzalnością i szybkością. Za pomocą tego testu oceniono hamowanie wiązania przez autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF lub frakcje IgG z surowicy pacjenta. Dane wykazały korelację pomiędzy hamowaniem wiązania w teście bezkomórkowym a hamowaniem wzrostu w bioanalizie z użyciem komórek TF-1. Bioanaliza ta jest szeroko stosowana, lecz wiąże się z trudnościami w porównywaniu danych pochodzących z różnych ośrodków i różn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
biblioteka cDNA łożyska ludzkiego	Takara
kolumna powinowactwa do niklu	GE Healthcare	17-5247-01
hydrazyd biotyny (EZ-Link Biotin Hydrazide)	PIERCE	21339
rhGM-CSF (leukine)	Genzyme Corporation
Nunc Immobilizer Amino	Nalge Nunc International	436007
monoklonalne przeciwciało anty-polyHistidine produkowane w myszy	Sigma-Aldrich	H1029	0.2ml
roztwór blokujący (StabilCoat)	Surmodics	SC01-1000	1000ml
koniugat ZyMAX Streptavidin-AP	Invitrogen	43-8322
CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II	Applied Biosystems	T2214
czytnik płytek do chemiluminescencji	BERTHOLD TECHNOLOGIES	TriStar LB 941