Opracowaliśmy bezkomórkowy test wiązania receptorowego w celu oszacowania wiązania czynnika stymulującego kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF) z receptorami. Umożliwia on ocenę konkurencyjnego hamowania wiązania biotynylowanego GM-CSF do rozpuszczalnego receptora alfa GM-CSF przez autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF z doskonałą powtarzalnością.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezkomórkowy system analizy szacujący zdolność neutralizacji przeciwciał przeciw GM-CSF z wykorzystaniem rekombinowanego rozpuszczalnego receptora GM-CSF
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
WSTĘP: Wcześniej wykazaliśmy, że zdolność neutralizacji, a nie stężenie autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF, korelowała z ciężkością choroby u pacjentów z autoimmunologiczną białkowicą pęcherzyków płucnych (PAP)1-3. Ponieważ zniesienie bioaktywności GM-CSF w płucach jest prawdopodobną przyczyną autoimmunologicznej PAP4,5, pomiar zdolności neutralizacji autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF wydaje się obiecującą metodą oceny ciężkości choroby u każdego pacjenta z PAP.
Do tej pory zdolność neutralizującą autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF oceniano poprzez analizę zahamowania wzrostu komórek szpiku kostnego człowieka lub komórek TF-1 stymulowanych GM-CSF6-8. W systemach bioanalizy uzyskanie wiarygodnych danych, jak i ich porównywanie między różnymi laboratoriami, jest jednak często problematyczne ze względu na trudności techniczne w utrzymaniu komórek w stałym stanie.
CEL: Naśladowanie wiązania GM-CSF z receptorem GM-CSF na powierzchni komórki za pomocą bezkomórkowego testu wiązania receptorowego.
METODY: Technologię transgenicznych jedwabników zastosowano w celu otrzymania dużej ilości rekombinowanego rozpuszczalnego receptora alfa GM-CSF (sGMRα) o wysokiej czystości9-13. Rekombinowany sGMRα znajdował się w hydrofilnych warstwach serycyny nici jedwabnych, nie będąc złączonym z białkami jedwabiu, dzięki czemu można go łatwo wyekstrahować z kokonów z dobrą czystością przy użyciu neutralnych roztworów wodnych14,15. Na szczęście struktury oligosacharydowe, które są kluczowe dla wiązania z GM-CSF, są bardziej podobne do struktur ludzkiego sGMRα niż te produkowane przez inne owady lub drożdże.
WYNIKI: Bezkomórkowy system analizy z wykorzystaniem sGMRα dostarczył danych o wysokiej plastyczności i niezawodności. Wiązanie GM-CSF do sGMRα było hamowane w sposób zależny od dawki przez poliklonalne autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF, w sposób podobny do analizy biologicznej z użyciem komórek TF-1, co wskazuje, że opracowany przez nas nowy bezkomórkowy system analizy z wykorzystaniem sGMRα jest bardziej użyteczny do pomiaru aktywności neutralizującej autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF niż system analizy biologicznej z użyciem komórek TF-1 lub ludzkich komórek szpiku kostnego.
WNIOSKI: Opracowaliśmy bezkomórkowy test ilościowo określający zdolność neutralizacji autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF.
Protokół
1. Produkcja i oczyszczanie sGMRα
- Przeprowadzić amplifikację cDNA sGMRα z biblioteki cDNA łożyska ludzkiego za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
- Do produktu PCR, za pomocą kolejnej reakcji PCR, dodać 50-nukleotydową sekwencję 5'-UTR końca polidryny bakulowirusa oraz 27-nukleotydową kodującą sekwencję His-tag RGS na końcu 3'.
- Wprowadzić zamplifikowany produkt PCR do plazmidu pMSG1.1MG.
- Wstrzyknąć konstrukt psGMR/M1.1MG wraz z wektorem pomocniczym pHA3PIG do jaj jedwabników szczepu pnd-w1.
- Hodować wyklute larwy G0 aż do stadium ćmy w temperaturze 25°C. Przesiewać embriony G1 uzyskane w wyniku kojarzenia rodzeństwa lub krzyżowania z pnd-w1 w celu wykrycia ekspresji MGFP w oczach, aby uzyskać transgeniczne jedwabniki niosące gen sGMRα.
- Ekstrahować rekombinowane sGMRα z kokonów transgenicznych jedwabników przy użyciu buforu fosforanowego zawierającego 500mM NaCl i mieszać w temperaturze 4°C przez 24h.
- Wirować próbkę przy 200 g przez 15min w celu usunięcia osadu.
- Nałożyć supernatant na kolumnę z powinowactwem do niklu.
- Przemyć kolumnę roztworem 10mM imidazolu, 50mM NaCl i 20mM fosforanu sodu (pH6.3), a następnie eluować liniowym gradientem imidazolu od 10mM do 250mM. Połączyć frakcje zawierające oczyszczone sGMRα i dializować przeciwko fosforanowanemu roztworowi soli fizjologicznej (pH7.4) (PBS).
2. Biotynylacja rekombinowanego GM-CSF
- Usunąć preparat sorbitolu poprzez dializę przeciwko PBS.
- Do roztworu na lodzie dodać 1ml zimnego roztworu nadwodorczanu sodu o stężeniu 20mM w temperaturze 4°C.
- Próbkę inkubować przez 30min na lodzie w ciemności.
- Do roztworu dodać glicerol do końcowego stężenia 15mM.
- Roztwór dializować przeciwko buforowi octanowemu o stężeniu 10mM (pH5.5).
- Do roztworu dodać hydrazyd biotyny do końcowego stężenia 5mM i stale mieszać roztwór przez 2h w temperaturze pokojowej.
- Nieprzereagowany materiał usunąć poprzez dializę przeciwko PBS, pH7.4.
3. Bezkomórkowy test wiązania receptora GM-CSF z ligandem
- Płytkę mikrotitracyjną pokryć 50μl monoklonalnego przeciwciała anty-polyHistidine i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
- Przemyć pięciokrotnie 50μl PBST.
- Dodać 10μl roztworu blokującego i inkubować przez 3h w temperaturze 4°C.
- Przemyć pięciokrotnie 50μl PBST.
- Dodać 50μl sGMRα w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
- Przemyć pięciokrotnie 50μl PBST.
- Dodać 25μl próbek zawierających autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF, a następnie 25μl biotinylowanego GM-CSF. Inkubować przez 1h w temperaturze 4°C w celu utworzenia kompleksu sGMRα-GM-CSF.
- Przemyć pięciokrotnie 50μl PBST.
- Dodać 50μl 0,4mM fosfatazy alkalicznej sprzężonej ze streptawidyną i inkubować przez 1h w temperaturze 4°C w celu wykrycia sGMRα związanego z biotinylowanym GM-CSF.
- Przemyć pięciokrotnie 500μl PBST.
- Do roztworu dodać 50μl substratu chemiluminescencyjnego i inkubować przez 1h w temperaturze pokojowej.
- Za pomocą czytnika płytek do chemiluminescencji zmierzyć aktywność chemiluminescencyjną.
4. Reprezentatywne wyniki:
Pierwszym etapem w szlaku transdukcji sygnału receptora GM-CSF jest wiązanie GM-CSF do podjednostki alfa receptora GM-CSF na powierzchni komórki. Ponieważ autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF specyficznie wiążą GM-CSF i blokują jego wiązanie z receptorem in vitro 16,17, wysunęliśmy hipotezę, że autoprzeciwciała hamują tę pierwszą reakcję poprzez bezpośrednie wiązanie się z GM-CSF. Zgodnie z wcześniejszym opisem (Ref. 9-15), zastosowaliśmy technologię transgenicznych jedwabników w celu uzyskania dużej ilości rekombinowanego sGMRα o wysokiej czystości.
Podczas nakładania rekombinowanego sGMRα pochodzenia z jedwabnika na żel SDS-PAGE w warunkach nieredukujących, sGMRα wykazał formy monomerowe (45 kDa) i dimerowe (90 kDa), podczas gdy w warunkach redukujących wykryto jedynie formę monomerową (Rycina 1B), co wskazuje, że rekombinowany sGMRα był mieszaniną monomerów i dimerów powiązanych mostkami disiarczkowymi18.
Wykorzystując system wolny od komórek (Ryc. 2A), oceniliśmy hamowanie wiązania GM-CSF do sGMRα przez autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF (Ryc. 2B i Ryc. 2C). Metody te zostały opisane w publikacji nr 19 przez Urano i współpracowników. Hamowanie wzrostu było ściśle skorelowane z hamowaniem wiązania (r=0,98, p=0,002) przy różnych stężeniach autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF (Ryc. 3A)19. Analogicznie, hamowanie wiązania było znacząco skorelowane z hamowaniem wzrostu. Hamowanie wiązania przez autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF następowało w sposób zależny od dawki (Ryc. 3B)19. Te dwa parametry dla frakcji IgG surowicy od różnych pacjentów były ze sobą skorelowane (r=0,589 p=0,06, Ryc. 3C). Ani hamowanie wiązania, ani hamowanie wzrostu nie korelowały z wartościami Kd, zatem oba parametry nie były zależne od powinowactwa wiązania19. W konsekwencji oceniono powtarzalność danych dotyczących wiązania i hamowania wzrostu uzyskanych w trzech niezależnych eksperymentach na trzech różnych próbkach. Współczynnik zmienności wykazał, że system wolny od komórek był dokładniejszy niż test biologiczny (tabela 1).
Rysunek 1. Schemat procedury produkcji sGMRα przy użyciu transgenicznych jedwabników. A) Struktury wektorów transformacyjnych9-11B) SDS-PAGE i barwienie błękitem Coomassie oczyszczonego sGMRα w warunkach redukujących i nieredukujących. sGMRα, rozpuszczalny receptor GM-CSF alfa; MGFP, monster green fluorescent protein; BmNPVpol5'-UTR, sekwencja 5'-nieprzetłumaczalnego regionu Bombyx mori polyhedryna wirusa poliedrozy jądrowej; SV40 polyA, sekwencja sygnałowa polyA SV40; P3xP3, promotor 3xP3; Pser1, ser1 promotor; fibL polyA, sekwencja sygnałowa polyA łańcucha L fibroiny; hr3, Bombyx mori enkancer hr3 wirusa poliedrozy jądrowej.
Rysunek 2. Schemat systemu testów bezkomórkowych. A) Test konkurencyjnego wiązania z użyciem sGMRα produkowanego przez jedwabnika. B) Wpływ przeciwciał neutralizujących i nienaturalizujących na hamowanie wiązania w systemie bezkomórkowym. C) Różnica w hamowaniu wiązania pomiędzy różnymi stężeniami przeciwciał neutralizujących i nienaturalizujących. GM-CSF, czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów; sGMRα, rozpuszczalny receptor alfa GM-CSF; His, znacznik RGS-His; AP, fosfataza alkaliczna.
Rycina 3. Hamowanie wiązania GM-CSF do sGMRα przez przeciwciała poliklonalne przeciwko GM-CSF lub frakcje IgG z surowicy pacjentów z autoimmunologicznym PAP. A) Zależność między hamowaniem wiązania a hamowaniem wzrostu przez autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF. B) Hamowanie wiązania przy różnych stężeniach autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF. C) Zależność między IC50 dla procentowego hamowania wiązania oraz procentowego hamowania wzrostu przez frakcje IgG surowicy19IC50, 50% stężenie hamujące; GM-CSF, czynnik stymulujący colony granulocytów i makrofagów.
| Próbka | A | B | C |
| Międzyseryjnie | |||
| liczba oznaczeń | 3 | 3 | 3 |
| Wartość średnia (% inhibicji wiązania) | 61.6 | 63.8 | 69.7 |
| Wartość średnia (% zahamowania wzrostu) | 21.0 | 73.4 | 82.8 |
| Współczynnik zmienności (%) (% inhibicji wiązania) | 6.0 | 5.6 | 8.3 |
| Współczynnik zmienności (%) (% zahamowania wzrostu) | 64.4 | 18.3 | 10.4 |
Oba testy przeprowadzono przy użyciu 5 ng/ml GM-CSF oraz stężenia równym stężeniu autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF.
Tabela 1. Porównanie współczynników zmienności dla procentowego wiązania i hamowania wzrostu uzyskanych w trzech niezależnych eksperymentach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Test bezkomórkowy pozwolił oszacować zdolność neutralizacyjną autoprzeciwciał przeciwko GM-CSF z doskonałą powtarzalnością i szybkością. Za pomocą tego testu oceniono hamowanie wiązania przez autoprzeciwciała przeciwko GM-CSF lub frakcje IgG z surowicy pacjenta. Dane wykazały korelację pomiędzy hamowaniem wiązania w teście bezkomórkowym a hamowaniem wzrostu w bioanalizie z użyciem komórek TF-1. Bioanaliza ta jest szeroko stosowana, lecz wiąże się z trudnościami w porównywaniu danych pochodzących z różnych ośrodków i różn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy bardzo wdzięczni K. Nakagaki, dr. H. Ishii, dr. K. Suzuki, A. Yamagacie oraz K. Oofusie za ich cenny wkład.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| biblioteka cDNA łożyska ludzkiego | Takara | ||
| kolumna powinowactwa do niklu | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| hydrazyd biotyny (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| monoklonalne przeciwciało anty-polyHistidine produkowane w myszy | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| roztwór blokujący (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| koniugat ZyMAX Streptavidin-AP | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| czytnik płytek do chemiluminescencji | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
Bibliografia
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and lung immunity in pulmonary alveolar proteinosis. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1142-1149 (2005).
- Inoue, Y. Characteristics of a large cohort of patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis in Japan. Am J Respir Crit Care Med. 177, 752-762 (2008).
- Uchida, K. High-affinity autoantibodies specifically eliminate granulocyte-macrophage colony-stimulating factor activity in the lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis. Blood. 103, 1089-1098 (2004).
- Sakagami, T. Human GM-CSF autoantibodies and reproduction of pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 361, 2679-2681 (2009).
- Raines, M. Identification and molecular cloning of a soluble human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 8203-8207 (1991).
- Williams, W., VonFeldt, J., Rosenbaum, H., Ugen, K., Weiner, D. Molecular cloning of a soluble form of the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor alpha chain from a myelomonocytic cell line. Expression, biologic activity, and preliminary analysis of transcript distribution. Arthritis Rheum. 37, 1468-1478 (1994).
- Prevost, J. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J Immunol. 169, 5679-5688 (2002).
- Iizuka, M. Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons. FEBS J. 276, 5806-5820 (2009).
- Iizuka, M., Tomita, M., Shimizu, K., Kikuchi, Y., Yoshizato, K. Translational enhancement of recombinant protein synthesis in transgenic silkworms by a 5'-untranslated region of polyhedrin gene of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus. J Biosci Bioeng. 105, 595-603 (2008).
- Zou, W., Ueda, M., Yamanaka, H., Tanaka, A. Construction of a combinatorial protein library displayed on yeast cell surface using DNA random priming method. J Biosci Bioeng. 92, 393-396 (2001).
- Tamura, T. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
- Tomita, M. Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol. 21, 52-56 (2003).
- Ogawa, S., Tomita, M., Shimizu, K., Yoshizato, K. Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin. J Biotechnol. 128, 531-544 (2007).
- Tomita, M. A germline transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon. Transgenic Res. 16, 449-465 (2007).
- Kitamura, T. Idiopathic pulmonary alveolar proteinosis as an autoimmune disease with neutralizing antibody against granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 190, 875-880 (1999).
- Tanaka, N. Lungs of patients with idiopathic pulmonary alveolar proteinosis express a factor which neutralizes granulocyte-macrophage colony stimulating factor. FEBS Lett. 442, 246-250 (1999).
- Brown, C., Pihl, C., Murray, E. Oligomerization of the soluble granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor: identification of the functional ligand-binding species. Cytokine. 9, 219-225 (1997).
- Urano, S. A cell-free assay to estimate the neutralizing capacity of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor autoantibodies. J Immunol Methods. 360, 141-148 (2010).
- Hayashida, K. Molecular cloning of a second subunit of the receptor for human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): reconstitution of a high-affinity GM-CSF receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9655-9659 (1990).
- Hansen, G. The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell. 134, 496-507 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
