Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Podsumowanie

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Autofagia jest istotna dla wymiany komponentów komórkowych w wielu różnych warunkach. Pełni ona kluczową funkcję homeostatyczną, a także służy jako mechanizm kontroli jakości, który może celować w materiał komórkowy, w tym organelle, i selektywnie go degradować1-4. Na przykład uszkodzone lub nadmiarowe mitochondria (Ryc. 1), których nie usunięto w procesie autofagii, mogą stanowić zagrożenie dla homeostazy komórkowej i przeżycia komórki. U drożdży, Saccharomyces cerevisiae, niedobór składników odżywczych (np. głodzenie azotowe) lub uszkodzenia mogą promować selektywną wymianę mitochondriów poprzez autofagię w procesie zwanym mitofagią ^5-9.

Opisujemy prostą metodę mikroskopii fluorescencyjnej służącą do oceny autofagii. Dla przejrzystości ograniczamy nasz opis do wykazania, w jaki sposób podejście to może być wykorzystane do monitorowania mitofagii w komórkach drożdży. Analiza wykorzystuje fluorescencyjny reporter Rosella, który jest biosensorem o podwójnej emisji, składającym się z względnie stabilnego w zakresie pH czerwonego białka fluorescencyjnego połączonego z wrażliwym na pH zielonym białkiem fluorescencyjnym. Działanie tego reportera opiera się na różnicach pH między wakuolą (pH ~ 5,0-5,5) a mitochondriami (pH ~ 8,2) w żywych komórkach. W warunkach wzrostu komórki typu dzikiego wykazują zarówno czerwoną, jak i zieloną fluorescencję rozmieszczoną w sposób charakterystyczny dla mitochondriów. Emisja fluorescencji nie jest związana z wakuolą. Po poddaniu komórki głodzeniu azotowemu, czyli warunkowi indukującemu mitofagię, oprócz czerwonej i zielonej fluorescencji znakującej mitochondria, w komórkach obserwuje się akumulację fluorescencji czerwonej, ale nie zielonej, w kwaśnym świetle wakuoli, co reprezentuje dostarczanie mitochondriów do wakuoli. Zliczanie komórek z czerwonymi, ale nie zielonymi fluorescencyjnymi wakuolami może służyć jako miara aktywności mitofagicznej w komórkach^5,10-12.

Protokół

Wybór odpowiednich kontrolnych szczepów drożdży

Analiza opiera się na wizualnej ocenie akumulacji czerwonej fluorescencji w wakuoli drożdży. W związku z tym test jest subiektywny i zależy od wyboru odpowiednich szczepów kontrolnych oraz warunków hodowli. Kontrola typu dzikiego jest stosowana w celu określenia poziomów autofagii spodziewanych w warunkach normalnych. Jako kontrolę negatywną odpowiedni jest szczep z delecją jednego z kluczowych genów autofagii (np. ATG3); takie szczepy nie są w stanie dostarczyć materiału (np. mitochondriów, jądra komórkowego) do wakuoli

1. Transformacja komórek drożdży plazmidowym DNA

Komórki drożdży można łatwo uczynić kompetentnymi do transformacji poprzez traktowanie ich octanem litu (LiAcetate). Można zakupić gotowe zestawy komercyjne (np. EasyComp, Invitrogen), a dostępne są również opublikowane protokoły¹³.

W niniejszym protokole wykorzystujemy szczep typu dzikiego BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) oraz niektóre szczepy z kompleksowej biblioteki mutantów z delecjami (np. Δatg3) pochodzące od powyższego szczepu, z których każdy charakteryzuje się brakiem ekspresji innego genu nieessentialnego. Biblioteka szczepów z delecjami stanowi cenne narzędzie do badania autofagii z wykorzystaniem sond opartych na Rosella. Raportem zastosowanym w tym protokole jest mt-Rosella dla mitochondriów (Rys. 2A), kodowany przez pAS1NB:mt-Rosella¹².

Poniższe kroki opierają się na wykorzystaniu komórek uczynionych kompetentnymi przy użyciu zestawu do transformacji EasyComp i przechowywanych w zamrożeniu w temperaturze -80°C w celu wygodnego użytkowania.

1. 30 minut przed dodaniem do komórek drożdży doprowadzić Roztwór III (EasyComp Transformation Kit) do temperatury pokojowej.
2. Do sterylnej plastikowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml dodać 2-2,5 μl (~100 ng/μl) plazmidowego DNA kodującego reporter (pAS1NB:mt-Rosella).
3. Dodać 5 μl świeżo rozmrożonej zawiesiny kompetentnych komórek drożdży i wymieszać poprzez delikatne pipetowanie.
4. Dodać 50 μl Roztworu III (EasyComp Transformation Kit) i wymieszać w wstrząsarku vorteksowym. Inkubować reakcje transformacji przez 1 godzinę w temperaturze 28-30°C, intensywnie mieszając co 15 minut za pomocą vorteksu lub ręcznie, delikatnie uderzając palcem w probówkę.
5. Ostrożnie przenieść mieszaninę transformacyjną na jedną płytkę z agarem YMM uzupełnionym o histydynę, metioninę i uracyl, a następnie delikatnie rozprowadzić komórki po powierzchni agaru za pomocą sterylnego szklanego rozpylacza. Komórki drożdży są na tym etapie delikatne, a ostrożne obchodzenie się z nimi może zwiększyć wydajność transformantów.
6. Inkubować płytki wzrostowe od 2 do 4 dni w temperaturze 28-30°C lub do momentu pojawienia się kolonii o średnicy około 2-3 mm.

2. Potwierdzenie ekspresji Rosella w komórkach drożdży

Przed przystąpieniem do szczegółowych eksperymentów należy potwierdzić prawidłową lokalizację oraz wydajną ekspresję białka Rosella.

1. Za pomocą sterylnych wykałaczek wyselekcjonuj dla każdego szczepu 5 pojedynczych kolonii z płytki po transformacji i zawieś komórki w 50 μl sterylnej wody w oddzielnych sterylnych plastikowych probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml z zatrzaskową zakrętką.
2. Nanieś 10 μl każdej zawiesiny komórkowej na oddzielne, opisane szklane szkiełka przedmiotowe (76 x 26 mm) i przykryj zawiesinę komórkową kwadratowym szkiełkiem nakrywką (22 x 22 mm).
3. Natychmiast sprawdź emisję fluorescencji komórek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego (np. Olympus Fluoview FV500). Poszukaj silnej zielonej i czerwonej fluorescencji oraz znakowania typowego dla lokalizacji mitochondrialnej (Rys. 2B i 2C).
4. Pozostałą część każdej kolonii badanej w ten sposób pod kątem fluorescencji należy zaszczepić na nową płytkę wzrostową YMM.
5. Inkubuj płytki w temperaturze 28-30°C przez 2 dni, aż kolonie osiągną średnicę około 2-3 mm.

3. Wzrost komórek i indukcja autofagii

Autofagię można indukować przy użyciu szeregu różnych warunków eksperymentalnych, w tym poprzez wprowadzenie komórek w fazę stacjonarną, zmianę źródła węgla, podanie rapamycyny lub głodzenie azotowe. W naszej rutynowej praktyce stosujemy głodzenie azotowe jako metodę indukcji mitofagii.

1. Zaszczep pojedynczą kolonię w 10 ml pożywki wzrostowej zawierającej etanol oraz odpowiednie suplementy aukstroficzne.
2. Inkubować kultury drożdży w temperaturze 28-30°C przy wytrząsaniu orbitalnym (200 rpm) przez około 48 godzin. Komórki powinny znajdować się w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego.
3. Osadzić komórki z dwóch powtórnych próbek hodowli o objętości 1 ml w sterylnych plastikowych probówkach wirówkowych z zakrętką typu snap o pojemności 1,7 ml poprzez wirowanie przy 2,000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego.
4. Przemyć komórki trzykrotnie 1 ml sterylnej wody destylowanej poprzez resuspensję, a następnie wirowanie w celu usunięcia pozostałości pożywki.
5. Po trzecim przemyciu resuspender komórki w 100 ml pożywki wzrostowej lub pożywki z ograniczeniem azotu.
6. Ponownie zaszczep resuspenderowane komórki w 10 ml świeżej pożywki wzrostowej lub w 10 ml pożywki z ograniczeniem azotu. Inkubować przy wytrząsaniu orbitalnym przez 6-12 godzin, aby umożliwić indukcję mitofagii. Po okresie głodzenia przygotować komórki do obserwacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Uwaga: Znakowanie wakuoli CMAC-Arg

Podczas pierwszego etapu opracowywania testu przydatne jest potwierdzenie pod mikroskopem fluorescencyjnym dostarczenia Rosella do wakuoli. Choć wakuola drożdży jest dużym organellum, którego położenie często można łatwo określić na podstawie obrazów w świetle przechodzącym, w niektórych szczepach drożdży i w określonych warunkach wzrostu wakuola może być pofragmentowana i trudna do zlokalizowania.

Wakuolę można łatwo oznakować przy użyciu barwnika wakuolarnego opartego na kumarynie, takiego jak CMAC-Arg (7-amino-4-chlorometylokumaryna, amid L-argininy). Działanie proteaz wakuolarnych na barwnik skutkuje jasnoniebieską fluorescencją wakuoli. Emisja niebieska jest łatwo odróżnialna od emisji czerwonej i zielonej Rosella¹¹. Oznakowanie CMAC-Arg nie musi być wykonywane rutynowo, ale jest zalecane osobom, które nie są zaznajomione z lokalizacją i wyglądem wakuoli w drożdżach.

4. Znakowanie wakuoli CMAC-Arg

1. Przed obrazowaniem dodać CMAC-Arg (stężenie końcowe 100 mM) do komórek w fazie wzrostu lub komórek z niedoborem azotu. Roztwór CMAC-Arg można przygotować wcześniej, jednak ze względu na jego światłoczułość należy chronić go przed ekspozycją na światło.
2. Inkubować w temperaturze 28-30°C przy wytrząsaniu orbitalnym (200 rpm) przez 30 minut.
3. Zbiór komórek przeprowadzić poprzez wirowanie z prędkością 2,000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
4. Odlać nadsącz.
5. Komórki przemyć trzykrotnie sterylną wodą destylowaną poprzez resuspensję i następujące po niej wirowanie, aby usunąć pozostałości pożywki oraz nadmiar barwnika CMAC-Arg.
6. Przygotować preparat komórek do obrazowania zgodnie z opisem poniżej.

5. Montowanie żywych komórek drożdży do konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CLSM)

1. Roztopić 2 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia w osobnych alikwotach 1 ml pożywki wzrostowej oraz pożywki z deficytem azotu, inkubując je w temperaturze 70°C. Roztopioną agarozę utrzymywać w temperaturze 70°C.
2. Delikatnie osadzić komórki w alikwotach 1 ml każdej z kultur komórkowych poprzez wirowanie przy 2,000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić nadsącz.
3. Przemyć komórki trzykrotnie 1 ml sterylnej wody destylowanej poprzez resuspensję i wirowanie, analogicznie do kroku 5.2.
4. Resuspendować przemyte komórki w 100 μl sterylnej wody destylowanej.
5. W celu zamontowania komórek nanieść 20 μl roztopionej agarozy na oznakowane szklane szkiełko przedmiotowe (76 x 26 mm).
6. Niezwłocznie nanieść 10 μl zawiesiny przemytych komórek na warstwę agarozy.
7. Przykryć warstwę agarozy szkiełkiem nakrywką (22 x 22 mm). Komórki rozprzestrzenią się po powierzchni agarozy pod szkiełkiem nakrywką.
8. Aby zapobiec odwodnieniu i przesunięciu się szkiełka nakrywką podczas obrazowania, ostrożnie uszczelnić krawędzie szkiełka cienką warstwą lakieru do paznokci.
9. Gdy lakier do paznokci całkowicie wyschnie (10 min), preparat jest gotowy do obserwacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Uwaga: lakier do paznokci może uszkodzić obiektywy mikroskopu.
10. Komórki zamontowane tą techniką można obserwować do 1 godziny po przygotowaniu preparatu.

6. Wizualizacja autofagii z wykorzystaniem CLSM

Poziom autofagii w populacji komórek jest rutynowo oceniany poprzez określenie liczby komórek wykazujących czerwoną fluorescencję wakuol przed i po indukcji autofagii. W idealnych warunkach postęp autofagii monitoruje się w wybranych punktach czasowych po indukcji autofagii (Rys. 3). Najlepiej przeprowadzić to, obserwując próbki przez okular mikroskopu. Ważne jest zastosowanie odpowiednich kontroli (np. mutanta Δatg3) oraz utrzymanie niezmiennych ustawień mikroskopu podczas obserwacji różnych próbek (np. stosowanie filtrów neutralnych lub wybór filtrów).

Komórki drożdży są stosunkowo małe, co wymaga zastosowania wysokiej jakości mikroskopu fluorescencyjnego (np. Olympus Fluoview FV500) wyposażonego w filtry wzbudzenia/emisji odpowiednie do oddzielnej wizualizacji GFP i/lub pHluoriny (emisja fluorescencji zielonej) (filtr FITC) oraz DsRed.T3 (emisja fluorescencji czerwonej) (filtr TRITC).

1. Używając obiektywu wodnego 60x, obserwuj nienaszyczone komórki typu dzikiego, stosując naprzemiennie filtry FITC i TRITC. Komórki typu dzikiego powinny wykazywać typowy rozkład mitochondriów na peryferiach komórki, wykazując zarówno fluorescencję czerwoną, jak i zieloną. Należy zauważyć, że rozkład mitochondriów zależy od ustawienia przysłony (pinhole) mikroskopu konfokalnego. Zazwyczaj stosujemy niższą wartość przysłony 125 μm, co pozwala na obserwację mitochondriów jako serii kropek zlokalizowanych na peryferiach komórki (Ryc. 2C), dzięki czemu wakuola nie zostaje przesłonięta¹². Jeśli zastosowana zostanie wysoka wartość przysłony (200 μm), pozwala to na obserwację typowej włóknistej sieci mitochondrialnej rozproszonej w całej komórce (oraz zmian, jakim ona ulega)¹¹. Żadne inne struktury w komórce nie powinny być znakowane fluorescencyjnie.
2. Sekwencyjnie obserwuj komórki w każdym z punktów czasowych po przeniesieniu do pożywki głodzeniowej. Wizualizuj je naprzemiennie za pomocą zielonego i czerwonego filtra emisyjnego. W punkcie czasowym 6 h głodzenia w wakuoli powinna być widoczna fluorescencja czerwona, ale brak odpowiadającej jej emisji zielonej. Lokalizację wakuolarną można potwierdzić osobno za pomocą CMAC-Arg (Ryc. 2C). Przeanalizuj ok. 200 komórek i policz te, które wykazują jedynie fluorescencję czerwoną w wakuoli (tj. wewnątrzkomórkowe pochłanianie mitochondriów przez wakuolę).
3. Policz akumulację wakuolarną dla wszystkich punktów czasowych, obserwując >200 komórek, a następnie wykreśl procent komórek wykazujących akumulację wakuolarną.
4. Zbadaj komórki kontrolne z ujemną autofagią ekspresujące mt-Rosella przed głodzeniem oraz po 6 h głodzenia.

7. Reprezentatywne wyniki:

W niniejszym doświadczeniu przedstawiamy typowe wyniki uzyskane przy użyciu mt-Rosella, wyrażone w komórkach typu dzikiego oraz komórkach mutantów Δatg3. W warunkach hodowli z etanolem jako źródłem węgla, zarówno komórki typu dzikiego, jak i mutanty Δatg3 wykazują rozkład fluorescencji (czerwonej i zielonej) w komórce typowy dla mitochondriów w komórkach drożdży. Emisja fluorescencji czerwonej i zielonej nie jest wykrywana w wakuoli (Rys. 2B i 2C). Po poddaniu komórek głodzeniu azotowemu przez 6 h i dłużej, w komórkach typu dzikiego, oprócz fluorescencji czerwonej i zielonej odpowiadającej mitochondriom, obserwuje się również gromadzenie fluorescencji czerwonej, ale nie zielonej, w świetle wakuoli (Rys. 2B; Rys. 3). Jednak w komórkach mutantów Δatg3 ani fluorescencja czerwona, ani zielona nie gromadzi się w świetle wakuoli (Rys. 2C; Rys. 3).

Rycina 1. Góra, schemat organelli i przedziałów w komórce drożdży. Na dole przedstawiono widok komórki drożdży z centrum w wakuoli, wskazujący na autofagiczną degradację różnych organelli i przedziałów. Do różnic między poszczególnymi typami autofagii specyficznych dla organelli (np. mitofagia, nukleofagia) należą specyficzność (wybór ładunku) pochłoniętej zawartości, różne potrzeby wewnątrzkomórkowe i sygnały zewnątrzkomórkowe (np. głodzenie, uszkodzenia), specyficzne sygnały, geny ATG oraz zależność od czasu.

Rycina 2. (A) Schematyczna reprezentacja mt-Rosella. Sekwencja sygnałowa mitochondrium (w tym przypadku syntazy cytrynianowej) służy do kierowania biosensora Rosella do macierzy mitochondrialnej. Wskazano maksima wzbudzenia i emisji dla czerwonego białka fluorescencyjnego (DsRed.T3) oraz zielonego białka fluorescencyjnego (pHluorin). Przy wysokim pH (pH mitochondrialne ~8,2) biosensor fluoreskuje zarówno na czerwono, jak i na zielono, natomiast przy niskim pH (pH wakuolarne ~5,5) fluoreskuje tylko na czerwono. (B) Schematyczna reprezentacja oczekiwanych wyników w komórkach typu dzikiego i mutantach Δatg3 ekspresujących mt-Rosella. (C) Rzeczywiste wyniki uzyskane za pomocą CLSM dla komórek typu dzikiego w warunkach wzrostu i głodzenia azotowego. Od lewej do prawej: DIC (mikroskopia kontrastowo-fazowa), emisja fluorescencji RFP (DsRed.T3), emisja fluorescencji GFP (pHluorin), fluorescencja CMAC-Arg i obraz z nałożeniem (merge). (D) Rzeczywiste wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej dla komórek mutantów Datg3 w warunkach wzrostu i głodzenia azotowego. Od lewej do prawej: DIC (mikroskopia kontrastowo-fazowa), emisja fluorescencji RFP (DsRed.T3), emisja fluorescencji GFP (pHluorin), fluorescencja CMAC-Arg i obraz z nałożeniem (merge).

Rycina 3. Procent komórek typu dzikiego oraz mutantów Δatg3, wykazujących ekspresję mt-Rosella i hodowanych w warunkach głodowania azotowego, które wykazują czerwoną fluorescencję w wakuoli w czasie 48 godzin. Procent komórek wykazujących akumulację czerwonej fluorescencji w wakuoli zapisano w 0, 6, 12, 24 i 48 godzinach po rozpoczęciu głodowania azotowego.

Dyskusja

Na reprezentatywnych obrazach przedstawionych na Ryc. 2B i 2C wyraźnie widać, że zastosowanie organellowo-specyficznych reporterów fluorescencyjnych oraz mikroskopii fluorescencyjnej dostarcza dowodów na lokalizację/rozmieszczenie mitochondriów zarówno w komórkach rosnących, jak i w komórkach z głodem azotowym, a także pozwala na wizualizację mitofagii.

Należy podkreślić, że metoda ta nie ogranicza się jedynie do śledzenia mitofagii. Autofagia innych komponentów komórkowych lub organelli (np. rybosomów, kropel lipidowych, peroksysomów, retikulum endoplazmatycznego i jądra komórkowego) może być monitorowana przy użyciu odpowiedniego znakowania. Szczegóły dotyczące konstrukcji biosensora Rosella, warunków hodowli komórkowej oraz typowe wyniki dla obrotu jądra komórkowego (nukleofagii) zostały opisane w literaturze^11,12, co ilustruje szersze zastosowanie tej metody.

Stosowanie organellowo-specyficznych fluorescencyjnych reporterów do monitorowania autofagii wymaga uwzględnienia kilku kwestii dotyczących projektowania konstruktów. Należą do nich: (1) wybór i fuzja z odpowiednim sygnałem kierującym w celu uzyskania specyficznego targetowania do organelli; (2) wybór odpowiedniego białka (lub białek) fluorescencyjnych; (3) silna emisja fluorescencji; (4) prawidłowa lokalizacja i/lub rozkład organelli w komórce. Po pomyślnym wyrażeniu organellowo-specyficznego reportera w wybranym szczepie drożdży gospodarza, istotna staje się druga grupa rozważań: (1) warunki wzrostu drożdży; (2) przygotowanie próbek komórkowych; (3) parametry obrazowania, ponieważ ważne jest, aby parametry wybrane dla CLSM (np. intensywność lasera, szybkość i tryb skanowania, wartość pinhole, wartość zoomu, użyte obiektywy lub czas ekspozycji dla kamery CCD) były utrzymane przez cały eksperyment, co zapewni możliwość porównania próbek kontrolnych (rosnących komórek) i próbek głodzonych; (3) indukcja autofagii i pomyślne dostarczenie reportera do wakuoli.

Podsumowując, ta metoda mikroskopii fluorescencyjnej jest prosta, stosunkowo szybka i może znaleźć zastosowanie w wysokoprzepustowym przesiewaniu nowych leków wzmacniających lub hamujących autofagię, a także genów regulujących lub modulujących ten proces.