Ex Vivo zakażanie żywej tkanki wirusami onkolitycznymi

Podsumowanie

Wirusy onkolityczne stanowią obiecującą metodę terapeutyczną w leczeniu nowotworów. Zdolność do oceny podatności na zakażenie żywych próbek tkanek pobranych od pacjentów przed rozpoczęciem leczenia jest unikalną zaletą tego podejścia terapeutycznego. Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania tkanek do zakażenia ex vivo wirusem onkolitycznym oraz późniejszą kwantyfikację wirusa.

Streszczenie

Wirusy onkolityczne (OV) to nowoczesne środki terapeutyczne, które selektywnie replikują się w komórkach nowotworowych i doprowadzają do ich zniszczenia¹Obecnie trwa kilka badań klinicznych oceniających skuteczność różnych platform onkolitycznych, w tym onkolitycznych wirusów (OV) HSV, Reowirusa oraz Vaccinia, w leczeniu nowotworów.^2-5Kluczową cechą wirusów onkolitycznych jest możliwość ich modyfikacji genetycznej w celu ekspresji reporterowych transgenów, co umożliwia wizualizację infekcji tkanek za pomocą mikroskopii lub obrazowania bioluminescencyjnego.^6,7Stanowi to wyjątkową zaletę, ponieważ możliwe jest zakażenie tkanek pobranych od pacjentów ex vivo przed rozpoczęciem terapii w celu ustalenia prawdopodobieństwa powodzenia onkolitycznej wiroterapii⁸W tym celu kluczowe jest odpowiednie pobranie próbek tkanki, aby zrekompensować jej heterogeniczność oraz ocenić żywotność tkanki, szczególnie przed infekcją.⁹Ważne jest również monitorowanie replikacji wirusa za pomocą transgenów reporterowych, jeśli są one ekspresowane przez platformę onkolityczną, a także poprzez bezpośrednie mianowanie tkanek po homogenizacji, aby odróżnić infekcję abortywną od produktywnej. Celem niniejszego protokołu jest rozwiązanie tych problemów i opisano w nim: 1. Pobieranie i przygotowanie tkanki nowotworowej do hodowli komórkowej; 2. Ocenę żywotności tkanki z użyciem barwnika metabolicznego alamar blue; 3. Ex vivo zakażenie hodowli tkanek wirusem vaccinia wykazującym ekspresję GFP lub lucyferazy świetlika 4. Detekcja ekspresji transgenu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub przy użyciu an In vivo System obrazowania (IVIS) 5. Ilościowe oznaczanie wirusa za pomocą metody płytek. Ta kompleksowa metoda oferuje szereg zalet, w tym łatwość obróbki tkanek, kompensację heterogeniczności tkanek, kontrolę żywotności tkanek oraz rozróżnienie między infekcją abortywną a rzetelny replikacja wirusów

Protokół

1. Obróbka tkanek

1. Aby uzyskać najlepsze wyniki, protokół ten należy przeprowadzić przy użyciu świeżo wyizolowanej tkanki umieszczonej w medium DMEM zawierającym 10% FBS, 1% roztworu penicyliny/streptomycyny oraz 0,1% roztworu amfoterycyny B bezpośrednio po operacji, przed procesowaniem. Jeśli nie jest to możliwe, tkanki można pozostawić w tym medium na noc w temperaturze 4 stopni przed procesowaniem.
2. Przed procesowaniem próbki należy wysterylizować metalowe pęsety i jednorazowe ostrza, umieszczając je w 70% roztworze etanolu przez co najmniej 5 minut. Należy również przygotować płytkę 24-dołkową z 2 ml medium DMEM zawierającego 10% FBS, 1% roztworu penicyliny/streptomycyny oraz 0,1% amfoterycyny B.
3. Próbkę tkanki należy pobrać w laminarnym dygestorium do hodowli komórkowych za pomocą wysterylizowanych pęset i umieścić tkankę w pustej szalce Petriego o średnicy 15 cm, kładąc pokrywkę z boku, stroną sterylną do góry.
4. W dygestorium do hodowli komórkowych należy użyć wycinaka do biopsji o średnicy 2 mm, aby pobrać różne rdzenie z różnych obszarów tkanki, zgodnie z Rysunkiem 1. Rdzenie należy przenieść pęsetą na pokrywkę szalki Petriego o średnicy 15 cm, zachowując odpowiednie odstępy między nimi, aby można było je łatwo przeciąć wzdłuż osi poziomej.
5. Każdy rdzeń należy podzielić na 4 równe ćwiartki za pomocą wysterylizowanego ostrza żyletki, zgodnie z Rysunkiem 1.
6. Używając końcówki do pipety, należy umieścić każdą ćwiartkę danego rdzenia w osobnym dołku od A1 do A4, zgodnie z Rysunkiem 1, zawierających już 1,5 ml DMEM z 10% FBS, 1% roztworem penicyliny/streptomycyny i 0,1% roztworem amfoterycyny B. Czynność tę należy powtórzyć dla każdego rdzenia. Pozwoli to na reprezentatywne próbkowanie guza przy jednoczesnym zminimalizowaniu błędu w danym dołku/warunku. Aby uzyskać lepszą reprezentatywność, należy zwiększyć liczbę rdzeni.

2. Ocena żywotności tkanek

1. Po obróbce tkanek dodać 25μl Alamar blue do studzienek A1 i A2, zgodnie z rysunkiem 1, a następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂.
2. Po inkubacji z Alamar blue pobrać trzykrotnie 10 μl z każdej studzienki A1 i A2 i przenieść do 6 różnych studni płyty 96-dołkowej. Odczytać sygnał za pomocą fluorometrycznego czytnika płytek (pobudzenie 530, emisja 590) i zapisać uzyskane dane.
3. Po odczytaniu sygnału Alamar blue przenieść wszystkie fragmenty tkanki za pomocą końcówki pipety ze studzienki A1 do studzienki C1 zawierającej DMEM, 10% FBS + PS + AmphoB. Należy uważać, aby nie przenieść nadmiernej ilości medium ze studzienki A1.
4. Zainfekować odpowiednio studzienki A3 i A4 dawką 10⁶ PFU wirusa ospy prawdziwej (vaccinia virus) wykazującego ekspresję GFP oraz lucyferazy, rozcieńczonych w 25 μl medium. Studzienkę A2 można zainfekować wirusem wykazującym ekspresję dowolnego transgenu lub wirusem bez transgenu.
5. Po 72 godzinach dodać 25 μl Alamar blue do studni C1 i D1 i powtórzyć krok 2.2

3. Wizualizacja ekspresji transgenu GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

1. Usunąć wszystkie pożywki do hodowli komórkowej pokrywające fragmenty tkanki, aby uzyskać wysokiej jakości zdjęcia fluorescencyjne.
2. Używając mikroskopu sekcyjnego z możliwością obrazowania fluorescencyjnego, wykonać najpierw zdjęcie w kontraście fazowym z odpowiednią rozdzielczością.
3. Przełączyć urządzenie w tryb fluorescencji i wykonać zdjęcie przy użyciu odpowiedniego filtra w celu wizualizacji interesującego transgenu, w tym przypadku GFP.
4. Użyć filtra fluorescencyjnego dla innej długości fali, jak najdalej oddalonej od długości fali interesującego transgenu (np. RFP), aby wykonać zdjęcie fluorescencji tła.

4. Wizualizacja ekspresji lucyferazy przy użyciu systemu obrazowania In Vivo (IVIS)

1. Przed rozpoczęciem upewnij się, że system IVIS został zainicjowany.
2. Do studni A4 i B4 dodaj 5 μl podłoża lucyferyny 10 mg/ml, wymieszaj dokładnie i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Ustaw czas ekspozycji systemu IVIS na 5 sekund i wykonaj zdjęcie studni. Jeśli obraz jest nasycony, powtórz pomiar z krótszym czasem ekspozycji. W przypadku braku sygnału zwiększ czas ekspozycji.
4. Za pomocą oprogramowania do obrazowania IVIS można usunąć tło, wykorzystując sygnał ze studni B4, a następnie zaznaczyć obszar zainteresowania (ROI) w celu ilościowego oznaczenia sygnału luminescencyjnego.

5. Ocena miana wirusa za pomocą metody plackowej

1. Przed oznaczeniem miana wirusa tkanki muszą zostać najpierw zhomogenizowane w celu uwolnienia cząsteczek wirusa. Można to zrobić kilka miesięcy później, jeśli zainfekowane próbki tkanek są przechowywane w temperaturze -80 °C.
2. Zważ próbkę przeznaczoną do homogenizacji za pomocą wagi analitycznej. W tym przypadku użyjemy próbki pobranej z dołka A2.
3. Umieść tkankę w 5 ml polistyrenowej probówce Falcon z okrągłym dnem i dodaj 1 ml PBS. Zhomogenizuj tkankę za pomocą homogenizatora tkankowego. W razie potrzeby przechowuj homogenizat w temperaturze -80 °C w celu późniejszego oznaczenia miana wirusa.
4. Aby oznaczyć miano wirusa ospy krowiej (vaccinia virus), wysiej najpierw 1 milion komórek U2OS na płytkę 6-dołkową i inkubuj przez noc w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO₂, tak aby następnego dnia osiągnęły one około 95% konfluencji.
5. Użyj pożywki bezsurowiczej do wykonania rozcieńczeń seryjnych wirusa, pamiętając o zmianie końcówek po każdym etapie rozcieńczania. Zazwyczaj wykonujemy rozcieńczenia 1:10, przenosząc 10 μl do 90 μl. Liczba wykonanych rozcieńczeń zależy od przewidywanej wydajności wirusa.
6. Po przygotowaniu rozcieńczeń usuń pożywkę z wysianych komórek U2OS, a następnie dodaj 50 μl rozcieńczonego roztworu wirusa (dla każdego rozcieńczenia), aby zainfekować komórki U2OS. Inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂.
7. W tym czasie podgrzej 2X stężone DMEM zawierające 20% FBS oraz 3% roztwór CMC w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
8. Po 1-godzinnej inkubacji usuń pożywkę z zainfekowanych komórek U2OS. Wymieszaj objętościowo 1:1 3% CMC z 2X DMEM, 20% FBS i użyj 2 ml tej mieszaniny, aby pokryć każdy dołek z zainfekowanymi komórkami U2OS.
9. Umieść komórki ponownie w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na kolejne 48 godzin.
10. Po 48 godzinach dodaj 2 ml utrwalacza z metanolu i kwasu octowego na warstwę CMC w każdym dołku i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut w komorze do hodowli komórek.
11. Wylej utrwaloną warstwę i wypłucz pozostałości z dołków za pomocą wody z kranu.
12. Przebarw utrwalone komórki U2OS, dodając 2 ml roztworu Coomassie Blue na dołek, i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy niskiej prędkości na wstrząsarce do płytek.
13. Usuń barwnik Coomassie z dołków i przemyj płytki wodą z kranu. Pozostaw do wyschnięcia bez przykrywki przez około godzinę.
14. Powstałe plaki wirusowe można łatwo zaobserwować na rysunku 2C. Na tym etapie płytki można przechowywać w nieskończoność.
15. Policz plaki w tym stopniu rozcieńczenia, w którym widocznych jest od 10 do 10 plaków.
16. Pomnóż liczbę policzonych plaków przez zastosowane rozcieńczenie, a otrzymany wynik pomnóż przez 2, aby uzyskać miano w PFU/ml. Na przykład, jeśli w dołku z rozcieńczeniem milionkrotnym policzono 25 plaków, miano początkowej, nierozcieńczonej próbki wynosi 25 pomnożone przez 1 milion pomnożone przez 2, czyli 50 milionów PFU/ml. Następnie podziel tę liczbę przez początkowo zmierzoną wagę próbki, aby podać miano w PFU/g.

6. Reprezentatywne wyniki:

Aby dokładnie określić, czy chirurgicznie pobrana próbka tkanki prawidłowej lub nowotworowej jest podatna na zakażenie wirusem, należy w pierwszej kolejności upewnić się, że próbka tkanki jest żywotna. Rys. 1A pokazuje, że żywotność można ocenić za pomocą barwnika metabolicznego (Alamar blue) oraz że zarówno tkanka prawidłowa, jak i nowotworowa mogą pozostać metabolicznie aktywne przez okres co najmniej 72h. Sugeruje to, że tkanki hodowane ex vivo mogą wspierać replikację wirusa. Znaczącą zaletą wirusów onkolitycznych jest możliwość ich modyfikacji w celu ekspresji terapeutycznych lub obrazujących transgenów. Rys. 2D-E pokazuje, że w tkankach zainfekowanych ex vivo można wykryć GFP lub lucyferazę, co dodatkowo potwierdza, że tkanki te są żywotne oraz podatne na zakażenie. Chociaż zwiększona ekspresja transgenu jest zazwyczaj powiązana z replikacją wirusa, nie musi ona oznaczać produktywnego cyklu życiowego wirusa prowadzącego do samowzmocnienia i rozprzestrzeniania się, co uważa się za istotne dla aktywności terapeutycznej. Z tego powodu konieczne jest ustalenie, czy wyprodukowano więcej wirusa niż użyto do początkowego zakażenia tkanki. Rys. 2B pokazuje, że po ilościowym oznaczeniu wirusa za pomocą testu płytek, po 72 godzinach infekcji uzyskano więcej wirusa niż w tkance pobranej bezpośrednio po zakażeniu. Podsumowując, dane te wykazują, że chirurgicznie wycięta tkanka nowotworowa może pozostać żywotna w hodowli komórkowej przez okres co najmniej 72 godzin, w czasie którego możliwa jest replikacja wirusa.

Rysunek 1. Przegląd protokołu pobierania próbek i sekcjonowania tkanek. Próbkę tkanki opracowuje się poprzez pobranie kilku rdzeni o średnicy 2 mm, które następnie dzieli się na cztery ćwiartki i rozdziela losowo do dołków A1-A4. Kody kolorystyczne wskazują odczynniki użyte w każdym dołku. Szare pola wewnątrz dołków reprezentują każdą ćwiartkę z przedstawionych 6 poszczególnych rdzeni. Tkanka z dołka A1 zostaje przeniesiona do nowego dołka (C1) z pożywką po wstępnym odczycie alamar blue. Drugi odczyt wykonuje się po zakończeniu 72-godzinnej inkubacji z wirusami. Do dołków A4 i B4 dodaje się lucyferynę po 72-godzinnej inkubacji po infekcji.

Rysunek 2. Żywotność i podatność na zakażenie próbek tkanek pacjentów. A) Żywotność tkanki mierzona sygnałem alamar blue w 2. i 72. godzinie po pobraniu. Oś Y przedstawia sygnał alamar blue po korekcie o próbę ślepą. B) Miano wirusa ospy krowiej (vaccinia virus) zebranych próbek tkanek 2 i 72 godziny po zakażeniu w przeliczeniu na gram tkanki. C) Przykład blaszek wirusa vaccinia na komórkach U2OS po barwieniu Coomassie. D) Sygnał luminescencyjny uzyskany z tkanki pacjenta zakażonej VV-lucyferazą, obrazowany za pomocą systemu IVIS. E) Zdjęcia z mikroskopii fluorescencyjnej próbki tkanki pacjenta zainfekowanej VV-GFP.

Dyskusja

Jednym z krytycznych kroków w tym protokole jest pozyskanie świeżej próbki tkanki. Jeśli próbka zostanie poddana hodowli komórkowej po długim oczekiwaniu na sali operacyjnej w niewłaściwym medium (np. PBS), może to obniżyć żywotność tkanki i uniemożliwić infekcję. Warto zauważyć, że tkanka prawidłowa jest z natury bardziej podatna na te efekty niż tkanki nowotworowe. Kolejnym istotnym punktem jest liczba rdzeni wykorzystanych do pobrania próbki tkanki oraz jednolitość ich rozmiaru. Niespójność rozmiarów doprowadzi do zmienności między próbkami pacjentów, ponieważ czynniki takie jak hipoksja tkankowa i powierzchnia podatna na infekcję będą wahać się w zależności od wielkości rdzeni i ich ćwiertek. Choć można to częściowo rozwiązać za pomocą tnąrek do tkanek, zaletą zaprezentowanej tutaj metody jest to, że jest ona stosunkowo prosta, mniej podatna na kontaminację i szeroko stosowalna dla różnych typów tkanek, w tym tkanek miękkich lub lepkich, które nie nadają się łatwo do krojenia tnąrką. Co istotne, liczbę rdzeni można zwiększyć, aby uzyskać lepszą reprezentatywność tkanki. Ponadto rdzenie można podzielić na większą liczbę części (np. 5-8), aby umożliwić równoległe przeprowadzenie innych potencjalnych analiz, takich jak ekstrakcja DNA, RNA lub białek. Jednak liczba części, na które można podzielić rdzenie w celu uzyskania powtarzalnych rozmiarów, będzie zależeć od rzeczywistej wielkości rdzeni, którą można modyfikować, stosując trepany o różnych średnicach. Opcjonalnie, jednym ze sposobów pomagających w uzyskaniu powtarzalnych rozmiarów fragmentów tkanki jest wyrównanie długości rdzeni za pomocą linijki przed ich dalszym podziałem na mniejsze części. Protokół można naturalnie modyfikować w celu dostosowania go do innych wirusów; ustalono, że tkanki mogą zachować żywotność i wspierać replikację przez okres do 6 dni. Protokół ten można dodatkowo rozszerzyć o pomiary innych wirusowo ekspresowanych transgenów, w tym cytokin. Po infekcji tkanki mogą zostać również zatopione w parafinie w celu dalszego krojenia i barwienia metodami immunohistochemicznymi, co pozwala na dokładniejszą analizę histologii tkanki i jej związku z infekcją wirusową^10-12.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM z wysoką zawartością glukozy	Hyclone	SH30243.01
Płodowe serum bydlęce	NorthBio Inc.	NBSF-701
Roztwór amfotrycyny B	Sigma-Aldrich	A2942	Stosować w stężeniu 0,1%
Penicylina-streptomycyna	Sigma-Aldrich	P4333	Stosować w stężeniu 1%
Alamar Blue	Invitrogen	DAL1025
Sól potasowa D-lucyferyny	Produkty do obrazowania molekularnego	Sól potasowa D-lucyferyny 1 g	Resuspender w PBS do stężenia 10 mg/ml i przefiltrować przez filtr 0,22 μm μfiltr m
proszek MEM	GIBCO, by Life Technologies	#41500018	Przygotować połowę sugerowanej objętości w celu otrzymania 2X MEM, a następnie przefiltrować przez filtr 0,22 μm. μfiltr m przed użyciem
Karboksymetyloceluloza (CMC)	Sigma-Aldrich	C9481	Przygotować 3% roztwór w wodzie dejonizowanej i poddać autoklawowaniu. Należy pamiętać, że resuspensja proszku może zająć trochę czasu.
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma-Aldrich	B7920
bioczynnik do biopsji 2 mm	Miltex Inc.	MX-33-31
Żyletki dwustronne do przygotowań	Opieka Medyczna Personna	74-0002
Mikroskop fluorescencyjny do sekcji	Leica Microsystems	model M205 FA
In vivo system obrazowania (IVIS)	Caliper Life Sciences	IVIS® seria 200
Rozrywanie tkanek	Produkty Biospec	model 985370-395