Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.
Artykuł metodologiczny
Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila
Otwiera się w nowej karcie
W tym artykule
Podsumowanie
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Streszczenie
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Muszka owocówka Drosophila melanogaster wniosła nieoceniony wkład w badania nad neuronauką i jest szeroko wykorzystywana jako model chorób neurodegeneracyjnych ze względu na swój potężny aparat genetyczny1. Oko muchy w szczególności stało się organem pierwszego wyboru w badaniach nad neurodegeneracją, będąc najbardziej dostępną i nieistotną dla przeżycia częścią układu nerwowego Drosophila. Jednak głównym mankamentem nienaruszonych oczu jest trudność w obrazowaniu zdarzeń wewnątrzkomórkowych, takich jak dynamika autofagii2, które są kluczowe dla zrozumienia neurodegeneracji, co wynika z intensywnej autofluorescencji pigmentu.
Niedawno wykorzystaliśmy metodę wypreparowywania i hodowli pojedynczych ommatidiów3, która okazała się kluczowa dla zrozumienia dysfunkcji autofagii w modelu muchy z zanikiem Dentatorubro-Pallidoluysian (DRPLA)3, 4.
Przedstawiamy obecnie szczegółowy opis tej techniki (Ryc. 1), zaadaptowanej z badań elektrofizjologicznych5, która prawdopodobnie znacznie poszerzy możliwości wykorzystania modeli much w badaniach nad neurodegeneracją. Metodę tę można dostosować do obrazowania żywych zdarzeń subkomórkowych oraz monitorowania skuteczności podawania leków do komórek fotoreceptorowych (Ryc. 2). W połączeniu z technikami mozaikowymi6-8 możliwe jest równoległe badanie odpowiedzi genetycznie zróżnicowanych komórek (Ryc. 2).
Protokół
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Disekcja siatkówki Drosophila
- Napełnij jedną studzienkę szkiełka przedmiotowego z 3 studzienkami fosforanowym buforem solnym (PBS 1X), a następnie znieczul muchy za pomocą CO2. W tym eksperymencie można wykorzystać zarówno samce, jak i samice.
- Po znieczuleniu much chwyć pojedynczą muchę pęsetą i przełóż ją do małego naczynia z PBS.
- Pod mikroskopem stereoskopowym chwyć pęsetą trąbkę, a następnie oddziel głowę od tułowia, przecinając szyję drugą pęsetą.
- Trzymając głowę muchy za trąbkę, przekrój ją na pół wzdłuż linii środkowej lewa/prawa za pomocą mikronozycyc, aby odsłonić mózg.
- Użyj uciętej końcówki pipety, aby pobrać siatkówkę i przenieś ją do drugiej studzienki szkiełka przedmiotowego z 3 studzienkami, wypełnionej medium Schneidera.
- Najpierw oddziel większość kutykuli głowy, a następnie usuń mózg za pomocą pęsety. Siatkówkę należy pozostawić między laminą a rogówką.
- Następnie przenieś siatkówkę do kropli (50 μl) świeżego medium Schneidera umieszczonej bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym.
2. Disekcja ommatidiów
- W zależności od końcowego celu sekcji (obrazowanie natychmiastowe lub hodowla) oraz rodzaju optyki mikroskopu fluorescencyjnego (prosty lub odwrócony), ten etap może odbywać się na szkiełku przedmiotowym lub w płytce 24-dołkowej. W przypadku celu niniejszej sekcji, ommatidia zostaną wypreparowane bezpośrednio na szkiełku szklanym.
- Uchwycić pęsetą grzbietowy lub brzuszny koniec siatkówki. Za pomocą mikronozyciórek przeciąć siatkówkę na pół wzdłuż linii środkowej grzbietowo-brzusznej, aby odsłonić ommatidia znajdujące się w środku oka.
- Dalej trzymać siatkówkę w taki sposób, aby rogówka była skierowana w dół, a lamina w górę. Za pomocą cienkiej igły wolframowej oddzielić ommatidia od lamina i rogówki.
- Pojedyncze ommatidia oraz ich grupy zbiorą się na dnie dołka lub szkiełka. Przed przejściem do kolejnego etapu usunąć wszelkie większe zanieczyszczenia, które mogły się zebrać.
3. Obróbka, barwienie i obrazowanie
- Aby przeanalizować autofagię, rozcieńczyć Lysotracker w proporcji 1:1000 w kropli roztworu Schneidera (najpierw rozcieńczyć 1:10 w roztworze Schneidera, a następnie dodać 0,5 μl do kropli na szkiełku), wymieszać i odczekać 10 sekund.
- Usunąć nadmiar cieczy ze szkiełka, uważając, aby nie usunąć ommatidiów. Najlepiej wykonać to za pomocą cienkiej końcówki do nakładania żelu.
- Dodać kroplę Vectashield, aby przykryć ommatidia, nałożyć szkiełko nakrywkowe i uszczelnić lakierem do paznokci.
4. Reprezentatywne wyniki:
Prawidłowe wykonanie protokołu powinno pozostawić liczbę pojedynczych ommatidiów oraz małych grup ommatidiów połączonych fragmentami lamina, lecz wyraźnie oddzielonych od strony rogówki. Można je obrazować, jak pokazano w tym przykładzie, aby zwizualizować Atg8:GFP oraz Lysotracker, co pozwala na ukazanie autofagosomów, lizosomów i autofagolizosomów (Ryc. 3). Metodę tę można wykorzystać do obrazowania żywych komórek, jednak w tym przypadku należy zauważyć, że autofluorescencja pożywki Schneidera utrudni odróżnienie sygnałów fluorescencyjnych o niskim natężeniu. Dodatkowym problemem jest fakt, że granulki pigmentu pozostające przy fotoreceptorach wykazują intensywną fluorescencję, zwłaszcza w kanale czerwonym. Może być wymagane wykonanie zdjęcia w świetle przechodzącym, aby odróżnić je od rzeczywistych organelli.
Rysunek 1. Schemat procedury sekcji w celu uzyskania pojedynczych ommatidiów lub małych grup ommatidiów z siatkówki muchy.
Rycina 2. Możliwe modyfikacje opisanego tutaj prostego protokołu obejmują genetykę much oraz proces starzenia przed etapem sekcji i barwienia, a także hodowlę do 24 godzin i podawanie leków po etapie sekcji.
Rycina 3. Skan konfokalny autofagosomów i lizosomów w pojedynczym ommatidium wypreparowanym z muchy w; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP::Atg8/+, wykazującej ekspresję mutanta Atrophiny z poliglutaminą i utrzymywanej przez 12 dni w temperaturze 29°C. Panel w świetle przechodzącym (prawy górny róg) przedstawia niemal nienaruszoną strukturę ommatidium, a ramka wskazuje obszar skanowania. Kolor czerwony oznacza lizosomy, zielony autofagosomy; autofagolizosomy, powstające w wyniku fuzji obu organelli, mają kolor żółty. Groty strzałek wskazują dwa trwające procesy fuzji autofagosomów z lizosomami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Przedstawiona tutaj dyssekcja pojedynczego ommatidium umożliwia gromadzenie głębszych informacji biologiczno-komórkowych na temat procesów takich jak neurodegeneracja, modelowanych w oku Drosophila. Neurony fotoreceptorowe są łatwiej dostępne niż inne neurony, a ich cytoplazma jest szczególnie obszerna, co czyni je odpowiednimi do badania dynamiki pęcherzyków w tych samych komórkach, które są skutecznie wykorzystywane w wielu modelach do ilościowego określania neurodegeneracji in vivo. Kluczowym aspekte...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dziękujemy Bernardowi Charrouxowi za dyskusje. Praca ta była finansowana przez KCL Biomedical School.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przenośny dozownik CO2 | Flystuff | 59-150 | Dostępne również wkłady zamienne |
| Pinceta DUMONT nr 5 | Agar Scientific | T5034 | |
| Szkiełko przedmiotowe z 3 wgłębieniami | EMS | 71561-01 | |
| Mikronożyczki | VWR international | HAMMHSB516-09 | |
| Medium Schneider’a | VWR international | 733-1663 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| Szkiełka Superfrost | VWR international | 631-0108 | |
| Vectashield z Dapi | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Kryszalki | VWR international | 631-1336 |
Bibliografia
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Nisoli, I. Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy. Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).
- Charroux, B., Fanto, M. The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration. Autophagy. 6, 667-669 (2010).
- Hardie, R. C. Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors. J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).
- Napoletano, F. Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat. The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).
- Ravikumar, B. Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nature. 36, 585-595 (2004).
- Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie