Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Muszka owocówka Drosophila melanogaster wniosła nieoceniony wkład w badania nad neuronauką i jest szeroko wykorzystywana jako model chorób neurodegeneracyjnych ze względu na swój potężny aparat genetyczny1. Oko muchy w szczególności stało się organem pierwszego wyboru w badaniach nad neurodegeneracją, będąc najbardziej dostępną i nieistotną dla przeżycia częścią układu nerwowego Drosophila. Jednak głównym mankamentem nienaruszonych oczu jest trudność w obrazowaniu zdarzeń wewnątrzkomórkowych, takich jak dynamika autofagii2, które są kluczowe dla zrozumienia neurodegeneracji, co wynika z intensywnej autofluorescencji pigmentu.
Niedawno wykorzystaliśmy metodę wypreparowywania i hodowli pojedynczych ommatidiów3, która okazała się kluczowa dla zrozumienia dysfunkcji autofagii w modelu muchy z zanikiem Dentatorubro-Pallidoluysian (DRPLA)3, 4.
Przedstawiamy obecnie szczegółowy opis tej techniki (Ryc. 1), zaadaptowanej z badań elektrofizjologicznych5, która prawdopodobnie znacznie poszerzy możliwości wykorzystania modeli much w badaniach nad neurodegeneracją. Metodę tę można dostosować do obrazowania żywych zdarzeń subkomórkowych oraz monitorowania skuteczności podawania leków do komórek fotoreceptorowych (Ryc. 2). W połączeniu z technikami mozaikowymi6-8 możliwe jest równoległe badanie odpowiedzi genetycznie zróżnicowanych komórek (Ryc. 2).
Protokół
1. Disekcja siatkówki Drosophila
- Napełnić jeden otwór szkiełka przedmiotowego z 3 otworami fosforanem soli buforowych (PBS 1X), a następnie znieczulić muchy za pomocą CO2. W tym eksperymencie można wykorzystać zarówno samce, jak i samice.
- Po znieczuleniu much, chwycić pojedynczą muchę pęsetą i umieścić ją w małym naczyniu z PBS.
- Pod mikroskopem stereoskopowym chwycić pęsetą trąbkę, a następnie oddzielić głowę od ciała, przecinając szyję drugą pęsetą.
- Trzymając głowę muchy za trąbkę, przeciąć ją na pół wzdłuż linii środkowej lewo-prawo za pomocą mikronozyciór, aby odsłonić mózg.
- Używając ściętej końcówki pipety, pobrać siatkówkę i przenieść ją do drugiego otworu szkiełka przedmiotowego z 3 otworami, wypełnionego pożywką Schneidera.
- W pierwszej kolejności usunąć pęsetą większość kutykuli głowy, a następnie wyciągnąć mózg. Należy zachować siatkówkę uciśniętą między laminą a rogówką.
- Następnie przenieść siatkówkę do kropli (50 μl) świeżej pożywki Schneidera umieszczonej bezpośrednio na szkiełku przedmiotowym.
2. Disekcja ommatidiów
- W zależności od końcowego celu preparacji (natychmiastowe obrazowanie lub hodowla) oraz rodzaju optyki mikroskopu fluorescencyjnego (prosty lub odwrócony), ten etap można przeprowadzić na szkiełku przedmiotowym lub w płytce 24-dołkowej. W celu realizacji zadania opisanego w tej procedurze, ommatidia zostaną wypreparowane bezpośrednio na szkiełku szklanym.
- Chwyć pęsetą najbardziej grzbietowy lub brzuszny koniec siatkówki. Za pomocą mikronożyczek przetnij siatkówkę na pół wzdłuż linii środkowej grzbietowo-brzusznej, aby odsłonić ommatidia w środkowej części oka.
- Nadal trzymaj siatkówkę tak, aby rogówka była skierowana w dół, a lamina w górę. Używając cienkiej igły wolframowej, oddziel ommatidia od laminy i rogówki.
- Pojedyncze ommatidia oraz ich grupy zbiorą się na dnie dołka lub szkiełka. Przed kontynuacją usuń wszelkie większe zanieczyszczenia, które mogły się tam zebrać.
3. Traktowanie, barwienie i obrazowanie
- Aby przeanalizować autofagię, rozcieńczyć Lysotracker w stosunku 1:1000 w kropli medium Schneidera (najpierw rozcieńczyć 1:10 w medium Schneidera, a następnie dodać 0,5 μl do kropli na szkiełku), wymieszać i odczekać 10 sekund.
- Usunąć nadmiar cieczy ze szkiełka, uważając, aby nie usunąć ommatidiów. Najlepiej wykonać to za pomocą cienkiej końcówki do nakładania żelu.
- Dodać kroplę Vectashield, aby pokryć ommatidia, nałożyć szkiełko nakrywkowe i uszczelnić lakierem do paznokci.
4. Reprezentatywne wyniki:
Prawidłowe wykonanie protokołu powinno pozostawić liczbę pojedynczych ommatidiów oraz małych grup ommatidiów utrzymanych razem przez fragmenty lamina, ale wyraźnie oddzielonych od strony rogówki. Można je obrazować, jak w tym przykładzie, aby zwizualizować Atg8:GFP i Lysotracker, ukazując autofagosomy, lizosomy i autofagolizosomy (Rys. 3). Metodę tę można stosować do obrazowania na żywo, jednak w tym przypadku należy zauważyć, że autofluorescencja medium Schneidera utrudni rozróżnienie sygnałów fluorescencyjnych o niskim natężeniu. Dodatkowym problemem jest fakt, że ziarna pigmentu pozostające przy fotoreceptorach wykazują intensywną fluorescencję, szczególnie w kanale czerwonym. Może być wymagane zdjęcie w świetle przechodzącym, aby odróżnić je od rzeczywistych organelli.
Rysunek 1. Schemat procedury sekcji w celu uzyskania pojedynczych ommatidiów lub małych grup ommatidiów z siatkówki muchy.
Rysunek 2. Możliwe wariacje prostego protokołu opisanego w niniejszym materiale obejmują genetykę much i starzenie przed etapem preparowania i barwienia lub hodowlę do 24 godzin oraz podawanie leków po etapie preparowania.
Rysunek 3. Skan konfokalny autofagosomów i lizosomów w pojedynczym ommatidium wyizolowanym z muchy w; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP::Atg8/+, wykazującej ekspresję mutanta Atrophin z poliglutaminą i utrzymywanej przez 12 dni w temperaturze 29°C. Panel w świetle widzialnym (prawy górny róg) przedstawia niemal nienaruszoną strukturę ommatidium, a ramka wskazuje obszar skanowania. Kolor czerwony oznacza lizosomy, zielony autofagosomy; autolizosomy, powstałe w wyniku fuzji obu organelli, mają kolor żółty. Groty strzałek wskazują dwa trwające procesy fuzji autofagosomów z lizosomami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj dyssekcja pojedynczego ommatidium umożliwia gromadzenie głębszych informacji biologiczno-komórkowych na temat procesów takich jak neurodegeneracja, modelowanych w oku Drosophila. Neurony fotoreceptorowe są łatwiej dostępne niż inne neurony, a ich cytoplazma jest szczególnie obszerna, co czyni je odpowiednimi do badania dynamiki pęcherzyków w tych samych komórkach, które są skutecznie wykorzystywane w wielu modelach do ilościowego określania neurodegeneracji in vivo. Kluczowym aspekte...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Bernardowi Charrouxowi za dyskusje. Praca ta była finansowana przez KCL Biomedical School.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przenośny dozownik CO2 | Flystuff | 59-150 | Dostępne również wkłady zamienne |
| Pinceta DUMONT nr 5 | Agar Scientific | T5034 | |
| Szkiełko przedmiotowe z 3 wgłębieniami | EMS | 71561-01 | |
| Mikronożyczki | VWR international | HAMMHSB516-09 | |
| Medium Schneider’a | VWR international | 733-1663 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| Szkiełka Superfrost | VWR international | 631-0108 | |
| Vectashield z Dapi | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Kryszalki | VWR international | 631-1336 |
Bibliografia
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Nisoli, I. Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy. Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).
- Charroux, B., Fanto, M. The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration. Autophagy. 6, 667-669 (2010).
- Hardie, R. C. Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors. J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).
- Napoletano, F. Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat. The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).
- Ravikumar, B. Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nature. 36, 585-595 (2004).
- Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
