Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Muszka owocówka Drosophila melanogaster wniosła nieoceniony wkład w badania nad neuronauką i jest szeroko wykorzystywana jako model chorób neurodegeneracyjnych ze względu na swój potężny aparat genetyczny1. Oko muchy w szczególności stało się organem pierwszego wyboru w badaniach nad neurodegeneracją, będąc najbardziej dostępną i nieistotną dla przeżycia częścią układu nerwowego Drosophila. Jednak głównym mankamentem nienaruszonych oczu jest trudność w obrazowaniu zdarzeń wewnątrzkomórkowych, takich jak dynamika autofagii2, które są kluczowe dla zrozumienia neurodegeneracji, co wynika z intensywnej autofluorescencji pigmentu.
Niedawno wykorzystaliśmy metodę wypreparowywania i hodowli pojedynczych ommatidiów3, która okazała się kluczowa dla zrozumienia dysfunkcji autofagii w modelu muchy z zanikiem Dentatorubro-Pallidoluysian (DRPLA)3, 4.
Przedstawiamy obecnie szczegółowy opis tej techniki (Ryc. 1), zaadaptowanej z badań elektrofizjologicznych5, która prawdopodobnie znacznie poszerzy możliwości wykorzystania modeli much w badaniach nad neurodegeneracją. Metodę tę można dostosować do obrazowania żywych zdarzeń subkomórkowych oraz monitorowania skuteczności podawania leków do komórek fotoreceptorowych (Ryc. 2). W połączeniu z technikami mozaikowymi6-8 możliwe jest równoległe badanie odpowiedzi genetycznie zróżnicowanych komórek (Ryc. 2).
Protokół
1. Disekcja siatkówki Drosophila
- Napełnić jeden otwór szkiełka przedmiotowego z 3 otworami fosforanem soli buforowych (PBS 1X), a następnie znieczulić muchy za pomocą CO2. W tym eksperymencie można wykorzystać zarówno samce, jak i samice.
- Po znieczuleniu much, chwycić pojedynczą muchę pęsetą i umieścić ją w małym naczyniu z PBS.
- Pod mikroskopem stereoskopowym chwycić pęsetą trąbkę, a następnie oddzielić głowę od ciała, przecinając szyję drugą pęsetą.
- Trzymając głowę muchy za trąbkę, przeciąć ją na pół wzdłuż linii środkowej lewo-prawo za pomocą mikronozyciór, aby odsłonić mózg.
- Używając ściętej końców....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj dyssekcja pojedynczego ommatidium umożliwia gromadzenie głębszych informacji biologiczno-komórkowych na temat procesów takich jak neurodegeneracja, modelowanych w oku Drosophila. Neurony fotoreceptorowe są łatwiej dostępne niż inne neurony, a ich cytoplazma jest szczególnie obszerna, co czyni je odpowiednimi do badania dynamiki pęcherzyków w tych samych komórkach, które są skutecznie wykorzystywane w wielu modelach do ilościowego określania neurodegeneracji in vivo. Kluczowym aspekte.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Bernardowi Charrouxowi za dyskusje. Praca ta była finansowana przez KCL Biomedical School.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przenośny dozownik CO2 | Flystuff | 59-150 | Dostępne również wkłady zamienne |
| Pinceta DUMONT nr 5 | Agar Scientific | T5034 | |
| Szkiełko przedmiotowe z 3 wgłębieniami | EMS | 71561-01 | |
| Mikronożyczki | VWR international | HAMMHSB516-09 | |
| Medium Schneider’a | VWR international | 733-1663 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| Szkiełka Superfrost | VWR international | 631-0108 | |
| Vectashield z Dapi | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Kryszalki | VWR international | 631-1336 |
Bibliografia
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Nisoli, I.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
