Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Podsumowanie

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Streszczenie

Ludzkie peryvaskularne komórki macierzyste (PSCs) można wyizolować w wystarczającej liczbie z wielu tkanek na potrzeby inżynierii tkanki szkieletowej^1-3. PSCs stanowią populację sortowaną metodą FACS, składającą się z „perycytów” (CD146+CD34-CD45-) oraz „komórek adwentycjalnych” (CD146-CD34+CD45-), z których każda, jak wykazaliśmy wcześniej, posiada właściwości mezenchymalnych komórek macierzystych. PSCs, podobnie jak MSCs, są zdolne do różnicowania osteogennego oraz wydzielania cytokin pro-osteogennych^1,2. W niniejszym protokole demonstrujemy osteogenność PSCs w kilku modelach zwierzęcych, w tym poprzez implantację do kieszonki mięśniowej u myszy SCID (z ciężkim złożonym niedoborem odporności), w modelu ubytku sklepienia czaszki u myszy SCID oraz w modelu segmentowego ubytku kości udowej (FSD) u szczurów atymicznych. Model kieszonki w mięśniu uda jest wykorzystywany do oceny ektopowego tworzenia kości. Ubytki sklepienia czaszki są centrowane na kości ciemieniowej i mają standardowo średnicę 4 mm (ubytki o rozmiarze krytycznym)⁸. FSD są ubytkami bikortykalnymi, stabilizowanymi prętem polietylenowym i drutami K-wires⁴. Opisany FSD jest również ubytkiem o rozmiarze krytycznym, który nie goi się znacząco samoistnie⁴. W przeciwieństwie do tego, po dodaniu komórek macierzystych lub czynników wzrostu do miejsca ubytku, można zaobserwować znaczną regenerację kości. Ogólnym celem ksenoprzeszczepów PSCs jest wykazanie potencjału osteogennego tego typu komórek zarówno w ektopowych, jak i ortotopowych modelach regeneracji kości.

Protokół

1. Izolacja komórek macierzystych okołonaczyniowych

Zostało to szczegółowo opisane w towarzyszącym artykule „Purification of Perivascular Stem Cells from Human White Adipose tissue” autorstwa M. Corselli et al.

2. Tworzenie rusztowania

1. Rusztowania są wykonywane na zamówienie zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA, Burmingham Polymer) z powłoką z hydroksyapatytu^4-6. Rusztowania PLGA powlekane apatytem są wytwarzane z PLGA 85/15 metodą odlewania z rozpuszczalnikiem i wymywania cząsteczek. Rusztowania są tworzone w kształcie sferycznym (średnica 2 mm) do implantacji w woreczku mięśniowym, w kształcie dyskowym (średnica 4 mm) do implantacji w czaszce lub cylindrycznym (średnica 4 mm, długość 6 mm) do ubytków segmentowych kości udowej.
2. Krótko mówiąc, roztwory PLGA/chloroform zmieszane z sacharozą (stosunek polimer/sacharoza 5/95, w/w) są odlewane do teflonowej formy o średnicy 200-300 μm w celu stworzenia spersonalizowanej konstrukcji. Po liofilizacji przez noc rusztowania są usuwane z formy teflonowej i zanurzane w ddH₂O w celu rozpuszczenia sacharozy. Rusztowania są dezynfekowane poprzez zanurzenie w 70% etanolu przez 30 min, a następnie trzykrotnie płukane w ddH₂O.
3. W celu nałożenia powłoki apatytowej przygotowuje się roztwór symulowanego płynu ustrojowego (SBF) poprzez sekwencyjne rozpuszczanie CaCl₂, MgCl2•6H₂O, NaHCO₃ i K₂HPO₄•3H₂O w ddH₂O. pH roztworu jest obniżane do 6 poprzez dodanie 1M kwasu solnego w celu zwiększenia rozpuszczalności. Dodaje się Na₂SO₄, KCl oraz NaCl, a końcowe pH jest dostrajane do 6,5 (SBF 1).
4. SBF wolny od Mg2+ i HCO₃- (SBF 2) przygotowuje się poprzez dodanie CaCl₂ i K₂HPO₄•3H₂O do ddH₂O, a pH jest obniżane do 6. Dodaje się KCl i NaCl, a końcowe pH jest dostrajane do 6,8. Wszystkie roztwory są filtrowane sterylnie przez membranę PES 0,22 μm (Nalgene). Bezpośrednio przed procesem powlekania wysuszone rusztowania PLGA są poddawane trawieniu plazmą argonową w wyładowaniu żarowym (Harrick Scientific) w celu poprawy zwilżalności i jednorodności powłoki.
5. Wytrawione rusztowania są następnie inkubowane w SBF 1 przez 12 h, a następnie przenoszone do SBF 2 wolnego od Mg2+ i HCO₃- na kolejne 12 h w temperaturze 37 °C przy łagodnym mieszaniu. Powlekane rusztowania są płukane w ddH₂O w celu usunięcia nadmiaru jonów i liofilizowane przed dalszymi badaniami.

3. Implantacja w modelu kieszonki mięśniowej

1. Bezpośrednio przed implantacją 100 μl zawiesiny PSC w PBS (soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) delikatnie nanosi się na sferyczny implant na bazie PLGA. Komórki zostały wcześniej oznakowane poprzez lentiwirusową insercję lucyferazy świetlika, aby umożliwić śledzenie in vivo po implantacji. Gęstość komórek wynosi 2,5 x 10⁵ na implant.
2. Do badania wykorzystuje się 6-tygodniowe myszy SCID (z ciężkim złożonym niedoborem odporności). Zwierzęta poddaje się znieczuleniu poprzez inhalację izofluranem i premedykację buprenorfiną (Bedford Labs). Po standardowym przygotowaniu pola Betadyną wykonuje się obustronne nacięcia w kończynach tylnych (podłużne, o długości 2 mm).
3. W mięśniach dwugłowych uda, równolegle do długiej osi włókien mięśniowych, wykonuje się kieszonki metodą tępej dyssekcji. W każdej myszy umieszcza się implant na bazie PLGA z PSC, a powłokę nad mięśniem zszywa się nicią 5-0 Vicryl (Ethicon).
4. Następnie skórę zamyka się nicią 5-0 Vicryl szwem podskórnym. Po operacji zwierzęta otrzymują buprenorfinę przez 48 godzin oraz TMP/SMX (trimetoprim/sulfametoksazol; Qualitest) przez 10 dni.

4. Implantacja w modelu defektu sklepienia czaszki

1. Po znieczuleniu myszy SCID (w wieku 12-14 tygodni) izofluranem, sierść zostaje przystrzyżona, a skóra zdezynfekowana betadyną zgodnie z protokołem.
2. Wzdłuż szwu pośrodkowego strzałkowego sklepienia czaszki myszy wykonuje się nacięcie skóry o długości 8 mm. Następnie, za pomocą patyczka higienicznego, delikatnie usuwa się okostną sklepienia czaszki.
3. Następnie, używając wiertła trepanacyjnego z powłoką diamentową w wysokoobrotowym wiertle stomatologicznym, tworzy się ubytek w kości ciemieniowej o średnicy 4 mm. Ubytek jest pełnościenny, jednak należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej.
4. W miejscu ubytku delikatnie umieszcza się wykonany na zamówienie implant na bazie PLGA z wszczepionymi komórkami PSCs. Gęstość komórek wynosi 2,5 x 10⁵ na implant. Na koniec skórę zszywa się nicią 6-0 Vicryl. Po zabiegu zwierzęta otrzymują buprenorfinę przez 48 godzin oraz TMP/SMX przez 10 dni.

5. Implementacja modelu ubytku segmentowego kości udowej

1. Szczury atypiczne (w wieku 12-14 tygodni) poddaje się znieczuleniu za pomocą inhalacji izofluranem. Kość udową przeciera się i przygotowuje zgodnie ze standardowym protokołem przy użyciu betadyny (Rysunek 1).
2. W przednio-bocznej części kości udowej wykonuje się nacięcie podłużne o długości 27-30 mm. Następnie odsłania się trzon kości udowej poprzez rozdzielenie mięśnia obszernego bocznego i mięśnia dwugłowego uda (Rysunek 2).
3. Aby zmaksymalizować powtarzalność regeneracji kości, okostną pokrywającą ubytek w kości udowej usuwa się całkowicie wraz z wyresekcjonowanym segmentem kości udowej.
4. Na powierzchni przednio-bocznej kości udowej umieszcza się płytkę polietylenową (długość 23 mm; szerokość 4 mm; wysokość 4 mm). Płytka posiada sześć nawierconych otworów przeznaczonych dla gwintowanych drutów Kirschnera o średnicy 0,9 mm (Zimmer). Wykorzystując płytkę jako szablon, sześć gwintowanych drutów Kirschnera wprowadza się przez płytkę i obie warstwy kory kostnej (Rysunek 3).
5. Następnie, za pomocą małego oscylującego ostrza piły (Stryker, MI), tworzy się 6-mm ubytek w środkowej części trzonu. Ubytki segmentowe są następnie leczone poprzez wprowadzenie implantów na bazie PLGA, które zostały obsiane komórkami zgodnie z protokołem (Rysunek 4).
6. Znajdujące się powyżej mięśnie i powięź zamyka się za pomocą wchłanialnych szwów Vicryl 4-0, aby unieruchomić implant w miejscu, a następnie zszywa się skórę.

6. Oceny in vivo

1. Oceny radiograficzne są przeprowadzane w sposób podłużny, wykorzystując zarówno RTG o wysokiej rozdzielczości, jak i analizę μCT (mikrotomografii komputerowej) o wysokiej rozdzielczości. W analizie μCT (Skyscan 1172F) obrazy są skanowane z rozdzielczością 19,73 μm (źródło promieniowania 100 kV i 100 mA, z zastosowaniem filtra aluminiowego 0,5 mm). Obrazy są analizowane przy użyciu oprogramowania DataViewer, Recon, CTAn oraz CTVol.
2. Obrazowanie bioluminescencyjne jest również wykonywane seryjnie w celu oceny przyjęcia przeszczepu komórkowego, żywotności, proliferacji oraz wykluczenia migracji poza miejsce implantu. Obrazowanie bioluminescencyjne jest realizowane za pomocą urządzenia IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Emisję światła kwantyfikuje się przy użyciu oprogramowania Living Image (Xenogen). Całkowita emisja światła jest zapisywana w fotonach/sekundzie/cm²/steradianie.
3. Analizy histologiczne i histomorfometryczne są przeprowadzane pośmiertnie. Stosowane rutynowe barwienia obejmują trichrom Massona, błękit anilinowy, pentachrom oraz czerwony Picrosirius. Analizę histomorfometryczną wykonuje się łatwo przy zastosowaniu barwienia błękitem anilinowym lub pentachromem, w których osteoida wykazuje odpowiednio ciemnoniebieski i żółty kolor. Liczbę pikseli na pole widzenia przy dużym powiększeniu oblicza się za pomocą narzędzia magiczna różdżka w programie Adobe Photoshop.

7. Reprezentatywne wyniki

Ponieważ zarówno ubytki w sklepieniu czaszki, jak i w kości udowej są ubytkami krytycznymi, nie należy spodziewać się znaczącego gojenia bez zastosowania czynników wzrostu lub egzogennych komórek macierzystych.

W odniesieniu do manewrów chirurgicznych, wypreparowanie kieszonki mięśniowej powinno przebiegać wzdłuż płaszczyzn powięziowych, dzięki czemu krwawienie powinno być minimalne. Mimo że model kieszonki mięśniowej jest wykonywany obustronnie, mysz powinna bez problemu poruszać się w 1. dobie po operacji. W przypadku defektu sklepienia czaszki występuje krwawienie, które można tamponować za pomocą patyczka higienicznego. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej, ponieważ zakłóci to prawidłowy proces gojenia. W modelu FSD należy uważać, aby nie uszkodzić głównych naczyń krwionośnych, co zapobiegnie nadmiernemu krwawieniu, oraz nerwu udowego, aby uniknąć uszkodzeń neurologicznych. Druty Kirschnera należy wprowadzać przy użyciu niewielkiego nacisku, aby nie uszkodzić w ten sposób kości korowej.

Rysunek 1. Przygotowanie przedoperacyjne do wytworzenia ubytku segmentowego kości udowej (FSD) u szczurów atymicznych. Samce szczurów (w wieku 12–14 tygodni) są znieczulone w drodze inhalacji izofluranu. Kość udową oczyszczono i przygotowano zgodnie ze standardowym protokołem przy użyciu betadyny.

Rysunek 2. Dojście chirurgiczne w celu utworzenia ubytku segmentowego kości udowej (FSD). Wykonuje się podłużne cięcie o długości 27-30 mm nad przednio-boczną powierzchnią kości udowej. Następnie odsłania się boczną stronę trzonu kości udowej poprzez rozdzielenie mięśnia obszernego bocznego oraz mięśnia dwugłowego uda.

Rysunek 3. Fiksacja przy tworzeniu segmentowego ubytku kości udowej (FSD). Płytkę polietylenową (długość 23 mm, szerokość 4 mm, wysokość 4 mm) umieszcza się na powierzchni przedniobocznej kości udowej. Płytka posiada sześć nawierconych otworów przeznaczonych dla gwintowanych drutów Kirschnera o średnicy 0.9 mm. Wykorzystując płytkę jako szablon, sześć gwintowanych drutów Kirschnera wprowadza się przez płytkę i obie kory kostne. Następnie tworzy się 6 mm ubytek w części środkowej trzonu kości. Po wykonaniu tego kroku bezpośrednio wprowadza się wykonowany na zamówienie rusztowanie (scaffold), które dokładnie pasuje do miejsca ubytku (nie pokazano).

Rycina 4. Przykład pooperacyjnego defektu sklepienia czaszki. U myszy atymicznych w prawej kości ciemieniowej utworzono okrągły defekt sklepienia czaszki o średnicy 4 mm. Przedstawione zdjęcie obrazuje miejsce defektu po implantacji PSC w 8. tygodniu po operacji. Zwróć uwagę na obecność nowej kości w obrębie miejsca defektu.

Dyskusja

Izolacja PSC jest dobrze opisana w innych źródłach^1-3, w tym w oddzielnie przesłanej publikacji JoVE poświęconej konkretnie protokołom i metodom izolacji PSC. Specyficznym celem niniejszego artykułu jest opisanie i zademonstrowanie trzech protokołów zastosowania PSC in vivo w celu formowania/regeneracji kości. Torebka mięśniowa myszy SCID jest powszechnie opisywanym modelem ektopowego formowania ludzkiej kości⁷. Istnieją istotne różnice między modelami ektopowymi a ortotopowymi (defektu) kości, w tym interakcje parakrynne z komórkami gospodarza tworzącymi kość⁸, a także obfitość osteogennych czynników sygnałowych obecnych w mikrośrodowisku defektu szkieletowego. W niniejszej pracy przedstawiono dwa defekty: defekt sklepienia czaszki8 oraz segmentowy defekt kości udowej⁴. W obu przypadkach dobrze udokumentowano, że są to defekty o rozmiarze krytycznym (tj. nie zagoją się samoistnie).

Istnieją interesujące różnice między defektami sklepienia czaszki a defektami kości udowej. Po pierwsze, oddziaływanie komórka-komórka między ksenoprzeszczepionymi PSC a komórkami endogennymi jest bardzo odmienne. W przypadku defektu sklepienia czaszki PSC oddziałują z leżącą pod nimi oponą twardą (zewnętrzną warstwą opon mózgowych), a także z osteoblastami i komórkami okostnej otaczającymi miejsce defektu. Co istotne, interakcje między zaimplantowanymi komórkami a otaczającymi je osteoblastami⁸ lub między zaimplantowanymi komórkami a leżącą pod nimi oponą twardą (Levi et al., w druku) są kluczowe dla przebiegu prawidłowej osteogenezy indukowanej przez komórki macierzyste. W przypadku segmentowego defektu kości udowej (FSD) ksenoprzeszczepione PSC są narażone na zupełnie inne środowisko komórkowe i cytokinowe. Na przykład miejsce FSD składa się ze szpiku i towarzyszących mu mezenchymalnych komórek macierzystych, a także z endosteum, okostnej i osteoblastów kości długich. Teoretycznie każda komórka wykazuje własną reakcję na uraz i każda z nich może wchodzić w interakcje komórka-komórka z ksenoprzeszczepami PSC.

Istnieją inne wyraźne różnice między ubytkami w obrębie sklepienia czaszki a ubytkami w kości udowej. Kości sklepienia czaszki powstają początkowo w procesie kostnienia błonowego, podczas gdy kości długie tworzą się poprzez pośrednictwo chrząstki (kostnienie chrzęstne). Co więcej, proces naprawczy po urazie również odzwierciedla te pochodzenia rozwojowe. Po FSD obserwuje się tworzenie kostni chrzęstnego, podczas gdy w ubytku kości ciemieniowej nie powstaje żadne pośrednictwo chrzęstne. Wreszcie, pochodzenie embrionalne czaszki może różnić się od pochodzenia kości długich. Większość czaszki (w tym komórki okołonaczyniowe – perycyty – w całym obszarze głowy) pochodzi z grzebienia neuronalnego (mezektodermy), podczas gdy szkielet kończyn wywodzi się z mezodermy paraksialnej⁹. Wszystkie te różnice mogą prowadzić do istotnych rozbieżności w zakresie naprawy kości pośredniczonej przez PSC.

Stosowanie PSC niesie ze sobą szereg korzyści w porównaniu do tradycyjnych mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC). PSC nie wymagają hodowli i stanowią oczyszczoną populację komórek, która nie zawiera innych komórek zrębu nieuczestniczących w różnicowaniu osteogenicznym – a wręcz mogących je negatywnie regulować – takich jak komórki śródbłonka¹⁰. W przeciwieństwie do nich, na przykład analizy klonalne ASC wykazują, że tylko subpopulacja tych komórek jest zdolna do różnicowania osteogenicznego in vitro¹¹. W perspektywie długoterminowej działania w zakresie inżynierii tkanki szkieletowej będą prawdopodobnie łączyć osteokompetentne komórki macierzyste (takie jak PSC) z egzogennymi czynnikami wzrostu oraz rusztowaniem osteokondukcyjnym (takim jak HA-PLGA zastosowane w niniejszych metodach), aby w optymalny sposób leczyć ubytki szkieletowe.