Artykuł metodologiczny

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

19.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2954

⸱

23 czerwca 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope, 3Shared Resource-DNA/RNA Peptide, Beckman Research Institute of City of Hope

W tym artykule

Podsumowanie

Kilka aptamerów 2’-Fluoro RNA przeciwko HIV-1Ba-L gp120 o powinowactwie nanomolowym zostało wyizolowanych z biblioteki RNA za pomocą procedury in vitro SELEX. Stworzono nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji hamującej przeciwko gp120, która wykazuje znaczny potencjał w systemowej terapii przeciw HIV.

Streszczenie

Globalna epidemia zakażeń HIV stworzyła pilną potrzebę opracowania nowych klas leków antyretrowirusowych. Wykorzystuje się silną zdolność małych interferujących (si)RNA do hamowania ekspresji komplementarnych transkryptów RNA jako nową klasę terapeutyków w leczeniu wielu chorób, w tym HIV. Wiele wcześniejszych doniesień wykazało, że nowatorskie strategie terapeutyczne przeciwko HIV/AIDS oparte na RNAi wykazują znaczny potencjał; jednak kluczową przeszkodą w skutecznym zastosowaniu terapeutycznym i translacji klinicznej siRNAs jest efektywne dostarczanie. Biorąc pod uwagę bezpieczeństwo i skuteczność terapii opartych na RNAi, szczególnie pożądane jest opracowanie metody celowanego wewnątrzkomórkowego dostarczania siRNA do konkretnych populacji komórek lub tkanek. Białko HIV-1 gp120, glikoproteina otoczki na powierzchni HIV-1, odgrywa istotną rolę w wnikaniu wirusa do komórek CD4. Interakcja gp120 i CD4, która wyzwala wniknięcie HIV-1 i inicjuje fuzję komórkową, została potwierdzona jako klinicznie istotna strategia przeciwwirusowa w poszukiwaniu nowych leków.

W niniejszej pracy omawiamy w pierwszej kolejności wybór i identyfikację zmodyfikowanych 2'-F aptamerów RNA przeciwko białku gp120 HIV. Wykorzystując konwencjonalną metodę SELEX z filtrem nitrocelulozowym, wyizolowano kilka nowych aptamerów o powinowactwie nanomolarnym z biblioteki 50 losowych nukleotydów nt RNA. Aby skutecznie uzyskać wiążące się gatunki o wyższym powinowactwie, rygorystyczność selekcji była starannie kontrolowana poprzez dostosowanie warunków. Wybrane aptamery mogą specyficznie wiązać się i być szybko internalizowane do komórek wykazujących ekspresję białka otoczki HIV-1. Ponadto same aptamery mogą neutralizować zakaźność HIV-1. W oparciu o najlepszy aptamer A-1 stworzyliśmy również nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji inhibicyjnej przeciwko gp120, w której zarówno część aptamerowa, jak i część siRNA wykazują silną aktywność przeciwko HIV. Dalej wykorzystujemy chimery aptamer-siRNA gp120 do specyficznego dla typu komórek dostarczania siRNA do zainfekowanych komórek HIV-1. Ta chimera o podwójnej funkcji wykazuje znaczny potencjał w łączeniu różnych terapeutycznych czynników kwasów nukleinowych (aptameru i siRNA) w celu hamowania infekcji HIV-1, co czyni chimery aptamer-siRNA atrakcyjnymi kandydatami terapeutycznymi dla pacjentów, u których wysokoaktywna terapia antyretrowirusowa (HAART) nie przynosi efektów.

Protokół

1. Przygotowanie biblioteki RNA

  1. Wyjściowa biblioteka DNA zawierała 50 nukleotydów sekwencji losowych i została zsyntetyzowana przez Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa). Sekwencja jednoniciowej biblioteki oligo DNA to 5'- GGG AGG ACG ATG CGG - N50- CAG ACG ACT CGC CCG A - 3' (81 nt). Region losowy jest flankowany przez regiony stałe, które obejmują promotor T7 do transkrypcji in vitro oraz znacznik 3' do RT-PCR. Sekwencje stałe 5' i 3' to odpowiednio 5' – TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GGA CGA TGC GG - 3' (32 mer) oraz 5' -TCG GGC GAG TCG TCT G - 3' (16 mer). Przygotować roztwór stokowy w wodzie i przechowywać w alikwotach w temperaturze -20°C.
  2. Przeprowadzić amplifikację jednoniciowej losowej biblioteki oligo DNA (0.4 μM) metodą PCR, stosując 3 μM każdego z primerów 5' i 3', wraz z 2 mM MgCl2 oraz 200 μM każdego dNTP. Aby zachować liczność oryginalnej biblioteki DNA, ograniczyć liczbę cykli PCR do dziesięciu. Po reakcjach PCR (10 reakcji, 100 μL na reakcję), odzyskać zamplifikowaną pulę dsDNA przy użyciu zestawu QIAquick Gel purification Kit (QIAGEN).
  3. Przekształcić otrzymany dsDNA w bibliotekę RNA przy użyciu zestawu DuraScription Kit (Epicentre, Madison, WI) zgodnie z instrukcjami producenta. W mieszaninie reakcyjnej do transkrypcji zastąpić CTP i UTP przez 2'-F-CTP i 2'-F-UTP, aby uzyskać RNA odporne na rybonukleazę. Typowo przygotować 20 μL mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 μg oczyszczonej matrycy DNA, 2 μL 10 x buforu, 2 μL dATP, 2 μL dGTP, 2 μL 2'-F-dCTP, 2 μL 2'-F-dUTP, 2 μL DTT i 2 μL polimerazy RNA T7 w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować w 37°C przez 6 h (50 mM każdego dNTP).
  4. Następnie poddać reakcję trawieniu DNazą I (1,5 μL na 20-μL reakcję transkrypcji T7), aby usunąć matrycę DNA, i oczyścić za pomocą żelu poliakrylamidowego 8% z 7 M mocznikiem. Ilość oczyszczonej biblioteki RNA oznaczyć metodą spektrofotometrii UV.

2. Generowanie aptamerów in vitro

  1. Przed selekcją przygotować bufor do selekcji oraz bufor do refoldingu. Przygotować bufor HEPES zawierający 100 mM Hepes, pH 7,4. Do regulacji wartości pH użyć NaOH, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować bufor do refoldingu RNA (5xHBS) zawierający 50 mM Hepes pH 7,4, 750 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2 oraz 13,5 mM KCl. Przygotować niskosolny bufor wiążący RNA (10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2,7 mM KCl, 10 mM DTT, 0,01% BSA) oraz wysokosolny bufor wiążący RNA (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2,7 mM KCl, 10 mM DTT, 0,01% BSA). Buforów tych przechowywać w temperaturze -20°C.
  2. Proces SELEX przeprowadzić zgodnie z opisem1-4. Przed każdą rundą selekcji poddać pule RNA refoldingu w buforze 1xHBS (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2,7 mM KCl), podgrzać do 95 °C przez 3 min, a następnie powoli schłodzić do 37°C. Kontynuować inkubację w 37°C przez 10 min.
  3. Zazwyczaj, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie z filtrami nitrocelulozowymi, przed inkubacją z docelowym białkiem gp120 HIV-1Bal należy poddać zrefoldowane pule RNA preadsorpcji na filtrze nitrocelulozowym (filtr HAWP, 0,45 μm) przez 30 min.
  4. W rundach SELEX od 1 do 4 inkubować uprzednio oczyszczoną pulę RNA z białkiem docelowym w niskosolnym buforze wiążącym RNA przez 30 min. Po czwartej rundzie SELEX zastosować wysokosolny bufor wiążący RNA. W miarę postępu procesu SELEX należy zmniejszać ilość białka gp120 i zwiększać ilość konkurującego tRNA drożdżowego, aby zwiększyć rygorystyczność selekcji aptamerów.
  5. W pierwszym cyklu selekcji inkubować uprzednio oczyszczoną losową pulę RNA (40 μg, 1,5 nmol, 9x1014 cząsteczek) oraz białko HIV-1Bal gp120 (0,23 nmol, stosunek RNA/białko 6,5/1) w 200 μL niskosolnego buforu wiążącego RNA na platformie rotacyjnej w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  6. Przesiąknąć mieszaninę reakcyjną przez uprzednio zwilżony filtr nitrocelulozowy i przemyć 1 mL buforu wiążącego.
  7. Eluować związane RNA z filtra przy użyciu 200 μL buforu elucyjnego (7 M mocznika i 5 mM EDTA) w 95 °C przez 5 min, a następnie przeprowadzić ekstrakcję fenol/chloroform i zagęścić za pomocą kolumny Microcon YM-30.
    8. >
  8. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję odzyskaną pulę RNA za pomocą systemu ThermoScript RT-PCR (Invitrogen) i przeprowadzić 15 cykli PCR.
    9. >
  9. Oczyścić amplifikowaną pulę dsDNA za pomocą zestawu QIAquick Gel purification Kit i przeprowadzić transkrypcję zgodnie z powyższym opisem dla kolejnej rundy selekcji.
    10. >

3. Monitorowanie postępu SELEX za pomocą testu wiązania z filtrem

  1. Monitoruj postęp procesu SELEX aptamerów za pomocą testu wiązania na filtrze. Potraktuj pulę RNA fosfatazą alkaliczną z jelita cielęcego (CIP), aby usunąć inicjujący 5'-trifosforan, a następnie oznakuj ją za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 i γ-32P-ATP.
  2. Podgrzej 10 pmol biblioteki RNA potraktowanej CIP w temperaturze 95°C przez 5 min, a następnie schłodź na lodzie. Następnie dodaj 2 μL buforu PNK, 1 μL kinazy polinukleotydowej T4, 1 μL gamma-P32-ATP i wodę do objętości 20 μL.
  3. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 min, następnie dodaj 20 ^mu;L wody i oczyść reakcję na kolumnie G-50. Ostatecznie uzyskaj 40 μL oznakowanego RNA o końcowym stężeniu 250 nM.
  4. Przed testem przeprowadź refolding oznakowanych pul RNA w buforze 1xHBS (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 2.7 mM KCl): podgrzej do 95 °C przez 3 min, a następnie powoli schłodź do 37°C. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37°C przez 10 min.
  5. Przeprowadź reakcję wiązania w objętości 100 μL zgodnie z podanym przykładem. Inkubuj pulę RNA oznakowaną na końcach (10 nM) z białkiem gp120 (100 nM) i 10-krotnym molowym nadmiarem nieswoistego konkurenta tRNA (100 nM) w zasolonym buforze do wiązania RNA przez 30 min.
  6. Oddziel 50 μL reakcji wiązania za pomocą uprzednio zwilżonego filtra nitrocelulozowego.
  7. Przemyj filtr 2 mL buforu do wiązania i zmierz radioaktywność zatrzymaną na filtrze za pomocą wielofunkcyjnego licznika scyntylacyjnego (Beckman Coulter). Jako kontrolę wejściową (input), zmierz jednocześnie pozostałe 50 μL reakcji wiązania. Oblicz procent RNA zatrzymanego na filtrze w stosunku do wejściowego RNA jako powinowactwo wiązania.

4. Klonowanie, sekwencjonowanie i dopasowania

  1. Po 11 rundach, jeśli nie zaobserwowano dalszego wzbogacenia nawet po dodatkowych rundach selekcji, oznacza to, że potencjalnie osiągnięto maksymalne wiązanie puli RNA.
  2. Przeprowadź odwrotną transkrypcję silnie wzbogaconej puli aptamerów (12ta pula RNA) przy użyciu systemu ThermoScript RT-PCR (Invitrogen), a następnie namnóż otrzymane cDNA metodą PCR. Produkt PCR oczyść za pomocą zestawu QIAquick Gel purification Kit (QIAGEN). Sklonuj oczyszczony z żelu produkt DNA do wektora klonującego TA pCR 2.1 (Invitrogen). W sumie zaszczep 170 pojedynczych klonów, a następnie zidentyfikuj je poprzez sekwencjonowanie DNA, aby uzyskać poszczególne sekwencje.
  3. Pogrupuj poszczególne klony w sześć różnych grup na podstawie dopasowania sekwencji poszczególnych aptamerów. Wybierz jedną reprezentatywną sekwencję z każdej grupy (A-1, A-5, A-9, A-12, A-28 oraz B-68) do dalszej charakterystyki ze względu na ich względną liczność w obrębie grupy.

5. Generowanie aptamerów i RNA chimerycznych poprzez transkrypcję in vitro

  1. Bezpośrednio wygenerować matrycę dwuniciowego DNA za pomocą PCR, stosując po 2 μM starterów 5' i 3', wraz z 2 mM MgCl2 oraz 200 μM każdego dNTP, a następnie odzyskać otrzymane produkty PCR za pomocą zestawu QIAquick Gel purification Kit.
  2. Przeprowadzić transkrypcję nici sensu chimery z wygenerowanych w PCR matryc DNA przy użyciu zestawu DuraScription Kit (Epicentre, Madison, WI). W mieszaninie reakcyjnej transkrypcji zastąpić kanoniczne CTP i UTP analogami 2'-F-CTP oraz 2'-F-UTP, aby uzyskać RNA odporne na degradację przez RNazę A.
  3. Zazwyczaj inkubować 20 μL reakcji zawierającej 1 μg matrycy DNA, 2 mL buforu 10x, 2 μL dATP, 2 μL dGTP, 2 μL 2'-F-dCTP, 2 μL 2'-F-dUTP, 2 μL DTT oraz 2 μL polimerazy RNA T7 w temperaturze 37 °C przez 6 h, a następnie oczyścić produkt za pomocą kolumien Bio-Spin 30 (Bio-Rad) po ekstrakcji fenolowej i precypitacji etanolem.
  4. Aby uniknąć odpowiedzi interferonowej, poddać transkrybowane RNA dalszej obróbce za pomocą CIP w celu usunięcia inicjującego trifosforanu 5'. Inkubować łącznie 60 μL reakcji zawierającej 3 μg transkrypcji, 6 μL Buforu 3 oraz 0,25 μL CIP w temperaturze 37 °C przez 60 min. Po ekstrakcji fenol/chloroform i precypitacji etanolem, resuspendować osad RNA w wodzie.
  5. W celu przygotowania chimer połączyć chimery zawierające tylko RNA nici sensu z odpowiednim RNA nici antysens w buforze do refoldingu, podgrzać do 95 °C przez 3 min, a następnie powoli schłodzić do 37 °C. Kontynuować inkubację w 37 °C przez 10 min. Krok refoldingu przeprowadzić w końcowym stężeniu 1x buforu HBS. Na przykład: zmieszać 10 μL 10 μM nici sensu chimery, 10 μL 10 μM nici antysens oraz 5 μL buforu do refoldingu (5xHBS) w układzie o objętości 25 μL.

6. Wyznaczanie stałych dysocjacji za pomocą analizy przesunięcia w elektroforezie żelowej

  1. oznacz końcówkę P32 reprezentatywnego aptameru z każdej grupy oraz pasmo sensowne chimery, a następnie przeprowadź refolding RNA w buforze 1xHBS zgodnie z powyższym opisem.
  2. Przygotuj 25 mL 5% żelu, mieszając 2,5 mL buforu 10xTBE z 3,125 mL 40% roztworu akryloamidu/bis, 19,375 mL wody, 150 μL 10% roztworu persiarczanu amonu (APS) oraz 30 μL TEMED. Żel powinien spolimeryzować w ciągu około 30 min. Ostrożnie usuń grzebień i użyj strzykawki 30 mL z igłą, aby wypłukać dołki buforem do elektroforezy (1xTBE).
  3. Zmontuj całkowicie jednostkę żelową i podłącz ją do zasilacza. Żel można poddać wstępnemu przebiegowi przez jedną godzinę przy 180 V w temperaturze 4°C.
  4. Przygotuj rozcieńczenia szeregowe białka HIV-1Bal gp120 w buforze wiążącym do pożądanych stężeń. Końcowe stężenia gp120 w reakcji wynoszą 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 nM. Inkubuj stałą ilość RNA oznakowanego P32 na końcu 5' (10 nM) z rosnącymi stężeniami białka gp120 w buforze wiążącym (całkowita objętość reakcji 20 μL) na platformie rotacyjnej w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  5. Po inkubacji zmieszaj 20 μL mieszaniny reakcyjnej z 5 μL natywnego buforu do nakładania i nanieś na 5% niedenaturujący żel poliakryloamidowy. Przygotuj natywny bufor do nakładania (4x) zawierający 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA, 0,1% błękitu bromofenolowego, 0,1% Xylene Cyanol FF, 0,1% Orange G oraz 40% glicerolu. Przechowuj w alikwotach w temperaturze -20°C.
  6. Po elektroforezie (180 V w 4°C przez 2 godziny, aż wtórny barwnik dotrze do środka żelu), naświetl żel na ekran fosforowy i skwantyfikuj radioaktywność za pomocą skanera Typhoon.
  7. Oblicz stałe dysocjacji, wykorzystując nieliniową regresję krzywej w programie Graph Pad Prism.

7. Badania wiązania do powierzchni komórek metodą cytometrii przepływowej

  1. Przygotować fluorescencyjne aptamery i chimery, wykorzystując zestaw Silencer siRNA Labeling Kit (Ambion). Dodać kolejno następujące odczynniki: 22,5 μL wody wolnej od nukleaz; 5 mL 10 x Labeling Buffer; 15 μL RNA (5 μg); 7,5 μL Labeling Dye. Inkubować całkowitą objętość reakcji znakowania (50 μL) w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
  2. Po inkubacji dodać 5,0 μL (0,1 obj.) 5 M NaCl oraz 125 μL (2,5 obj.) zimnego 100% EtOH i dokładnie wymieszać. Inkubować w temperaturze -20°C przez 60 min. Wirować z maksymalną prędkością w temperaturze 4°C przez 20 min. Odpiąć supernatant i przemyć osad 175 μL 70% EtOH. Suszyć osad na powietrzu w ciemności, a następnie zawiesić znakowane RNA w 15 μL wody wolnej od nukleaz.
  3. Zmierzyć absorbancję znakowanego RNA przy 260 nm oraz przy maksymalnej absorbancji barwnika fluorescencyjnego. Obliczyć stosunek zasad do barwnika oraz stężenie RNA zgodnie z kalkulatorem dostępnym pod adresem http://www.ambion.com/techlib/append/base_dye.html.
  4. Wymieszać pasmo sens i pasmo antisense chimer znakowanych Cy3, a następnie przeprowadzić refolding w buforze do refoldingu zgodnie z powyższym opisem.
  5. Pozyskać komórki kontrolne CHO-WT wykazujące ekspresję gp160 oraz CHO-EE za pośrednictwem AIDS Research and Reference Reagent Program5, 6. Hodować komórki w medium GMEM-S (minimalne medium niezbędne, pozbawione glutaminy, z dodatkiem 400 μM sulfoksyminy metioniny (MSX)) (Gibco, Invitrogen). Hodować komórki w inkubatorze z 5% CO2 i wilgotną atmosferą w temperaturze 37 °C.
  6. Przemyć komórki CHO-WT gp160 lub kontrolne komórki CHO-EE podgrzanym wcześniej buforem do mycia, poddać trypsynizacji i odczepić od płytek. Po dwukrotnym przemyciu komórek 500 μL buforu wiążącego, zawiesić osady komórkowe w buforze wiążącym i inkubować w temperaturze 37°C przez 30 min. Odwirować komórki, a następnie zawiesić je w 50 μL podgrzanego buforu wiążącego zawierającego 400 nM eksperymentalnych RNA znakowanych Cy3.
  7. Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 40 min przemyć komórki trzykrotnie 500 μL podgrzanego buforu wiążącego, a na koniec zawiesić w 350 μL buforu wiążącego podgrzanego do 37°C i niezwłocznie poddać analizie metodą cytometrii przepływowej.

8. Badania internalizacji i lokalizacji wewnątrzkomórkowej za pomocą konfokalnej mikroskopii żywych komórek

  1. Na dzień przed analizą należy wysiać komórki kontrolne CHO-WT gp160 oraz CHO-EE na płytkach 35 mm w gęstości 0,3x106 w 2 mL pożywki GMEM-S, aby po 24 h uzyskać około 70% konfluencji.
  2. W dniu przeprowadzenia eksperymentów komórki należy przemyć 1 mL podgrzanego PBS, a następnie inkubować z 1 mL podgrzanej pełnej pożywki wzrostowej przez 30 min w temperaturze 37°C.
  3. Należy przygotować chimery aptamer-siRNA znakowane Cy3 zgodnie z powyższym opisem. Należy inkubować zrefoldowany aptamer-stick z siRNA-stick zawierającym sensowną nić znakowaną 5'-Cy3, aby utworzyć koniugat aptamer-stick-siRNA zgodnie z powyższym opisem.
  4. Przed analizą należy przygotować roztwór Hoechst 33342 (barwnik jądrowy do żywych komórek, Molecular Probes, Invitrogen, CA) o stężeniu 0,15 mg/mL w wodzie i przechowywać w alikwotach w temperaturze 4°C.
  5. Komórki należy zbarwić za pomocą 0,15 mg/mL Hoechst 33342 przez 15 min w temperaturze 37°C. Następnie należy niezwłocznie dwukrotnie wypłukać barwnik 1,0 mL świeżej pożywki i dodać 2 mL podgrzanej świeżej pożywki.
  6. Do pożywki należy dodać chimerę aptamer-siRNA znakowaną Cy3 do końcowego stężenia 100 nM i inkubować w celu przeprowadzenia konfokalnej mikroskopii żywych komórek w inkubatorze mikroskopowym z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  7. Obrazy należy gromadzić co 15 min, korzystając z systemu konfokalnego mikroskopu dwufotonowego Zeiss LSM 510 Meta Inverted z imersją wodną przy powiększeniu 40x.

9. Próba zakażenia HIV-1 in vitro oraz analiza antygenu p24

  1. Należy zakupić komórki CCRF-CEM z ATCC. Hodować je w pożywce RPMI-1640 (Cellgro, Mediatech Inc.) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, HyClone), L-glutaminę oraz 1x Pen-Strep (Gibco, Invitrogen). Hodować komórki w uwilgotnionym inkubatorze z 5% CO22 inkubator w temperaturze 37 °C.
  2. Pobierz próbki mononuklearnych komórek krwi obwodowej od zdrowych dawców z City of Hope National Medical Center (personel kliniczny).
  3. Wyizolować PBMC z krwi pełnej poprzez wirowanie w roztworze Ficoll-Hypaque (Histopaque-1077, Sigma). Usunąć komórki CD8 (limfocyty T cytotoksyczne/supresyjne) z PBMC, wykorzystując Dynabeads CD8 (Invitrogen, CA).
  4. Hodować komórki w medium aktywującym limfocyty T (BioE, St. Paul, MN). Kulturować komórki w humidyfikowanym inkubatorze z 5% CO22 inkubator w temperaturze 37 °C.
  5. Należy pozyskać wirusy HIV-1 IIIB i NL4-3 oraz wirus HIV-1 Bal z programu AIDS Research and Reference Reagent Program. Po namnożeniu wirusa należy go przechowywać w alikwotach w temperaturze -80°C.
  6. Zakaź komórki CCRF-CEM lub ludzkie PBMC wirusami HIV (szczepy IIIB, NL4-3 lub Bal) (MOI 0,001 lub 0,005). 24 godziny po zakażeniu delikatnie przemyj komórki trzy razy za pomocą PBS, aby usunąć wolne wiriony. Kontynuuj hodowlę zakażonych komórek w atmosferze 5% CO22 inkubator mikroskopowy w temperaturze 37°C przez 4 dni.
  7. Przed obróbką RNA zainfekowane komórki należy delikatnie przemyć trzy razy roztworem PBS, aby usunąć wolne wirusy. Inkubować 2x104 zakażone komórki i 3x104 niezakażone komórki z refoldowanymi eksperymentalnymi RNA w końcowym stężeniu 400 nM w płytkach 96-dołkowych przy 37°C (100 μL na studzienkę, test tripleksowy).
  8. Zebrać nadsączki z hodowli (10 μL na dołek) w różnych odstępach czasu (3 d, 5 d, 7 d i 9 d) i przechowywać w temperaturze -20°C do czasu przeprowadzenia analizy p24.
  9. Przeprowadź analizy antygenu p24, korzystając z zestawu ELISA do wykrywania antygenu p24 HIV-1.

10. Wykrywanie funkcji siRNA za pomocą ilościowego testu RT-PCR

  1. Zainfekuj komórki CCRF-CEM lub ludzkie PBMC wirusami HIV (IIIB, NL4-3 lub Bal) i potraktuj je eksperymentalnymi cząsteczkami RNA (400 nM) zgodnie z powyższym opisem.
  2. Po 7 dniach inkubacji z preparatem, zcentryfuguj komórki i wyizoluj całkowite RNA za pomocą STAT-60. Potraktuj całkowite RNA nukleazą DNase I w celu usunięcia DNA genomicznego, a następnie przeprowadź syntezę cDNA, wykorzystując 2 μg całkowitego RNA.
  3. Wymieszaj następujące odczynniki: 8 mL wody wolnej od nukleaz; 1,5 mL 10 x buforu do DNazy; 4 μL RNA (2 μg); 0,5 μL inhibitora RNain oraz 1,0 μL DNase I wolnej od RNaz. Inkubuj całkowitą objętość reakcji 15 μL w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, a następnie podgrzej do 80°C przez 10 min w celu inaktywacji DNase I. Natychmiast schłodź mieszaninę reakcyjną na lodzie.
  4. Do powyższej mieszaniny reakcyjnej dodaj 2 μL starterów losowych (50 ng/μL) oraz 1 μL dNTP (10 mM), a następnie podgrzej w temperaturze 65°C przez 5 min. Natychmiast schłodź mieszaninę reakcyjną na lodzie.
  5. Dodaj następujące odczynniki: 5 mL 5x buforu do pierwszej nici; 2,5 mL 0,1 M DTT; 0,5 mL inhibitora RNain oraz 1,0 mL MMLV-RT. Inkubuj całkowitą objętość reakcji 27 mL w temperaturze 25°C przez 10 min oraz w 37°C przez 1 godzinę. Po zakończeniu reakcji podgrzej mieszaninę do 70°C przez 15 min w celu inaktywacji odwrotnej transkryptazy, a następnie schłodź na lodzie. cDNA jest gotowe do analizy qRT-PCR.
  6. Przeanalizuj ekspresję genów docelowych za pomocą ilościowego RT-PCR, wykorzystując 2 x iQ SyberGreen Mastermix oraz specyficzne zestawy starterów w końcowym stężeniu 400 nM (test triplex). Wykorzystaj ekspresję GAPDH jako kontrolę wewnętrzną do normalizacji danych qPCR.

11. Reprezentatywne wyniki:

1. Nowe aptamery RNA przeciwko HIV-1BaL gp120 zostają wyizolowane i scharakteryzowane.

Zgodnie z opisem w sekcji eksperymentalnej, wstępna biblioteka oligonukleotydów DNA zawierająca 50 nt losowego regionu flankowanego stałymi regionami starterów na końcach 5' i 3' zostaje namnożona i przepisana na pulę RNA. Ta wstępna biblioteka składa się z maksymalnie 1015 zróżnicowanych sekwencji (1 nmol), które zwijają się w szeroki wachlarz różnych struktur 3-D. Wysoka złożoność i różnorodność wstępnej biblioteki mogą gwarantować obecność aktywnych struktur o dobrym powinowactwie wiązania do celu.

Zastosowano procedurę SELEX in vitro (Rysunek 1) w celu wyselekcjonowania aptamerów RNA modyfikowanych 2'-fluoropirymidyną, które selektywnie wiążą białko otoczki gp120 wirusa HIV-1BaL szczepu R57. Jak pokazano na Rysunku 1, zastosowano strategię selekcji opartą na nitrocelulozie, aby wyizolować RNA wiążące docelowe białko od cząsteczek RNA niewiążących. Ponieważ białko przylega do nitrocelulozy, na membranie mogą zostać zatrzymane jedynie kompleksy RNA/białko lub agregaty, natomiast wolne cząsteczki RNA są wypłukiwane. W warunkach denaturujących odzyskano związane RNA, które poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA, a następnie amplifikowano do postaci dsDNA i poddano transkrypcji in vitro, aby utworzyć nową pulę RNA do kolejnego cyklu selekcji. Rygor selekcji zwiększano poprzez zmniejszanie ilości białka docelowego i zwiększanie ilości konkurencyjnego tRNA. Ilość puli RNA, białka oraz konkurencyjnego tRNA użytych w każdej rundzie selekcji przedstawiono w Tabeli 1.

Monitoruj postępy selekcji po każdym cyklu SELEX za pomocą testu wiązania na filtrze. Oceń powinowactwo wiązania jako procent RNA zatrzymanego na filtrze w całkowitej puli RNA. Początkowa pula RNA (1-RNA) wykazuje jedynie 0,1% RNA wejściowego zatrzymanego na membranie. Jednak po dziewięciu rundach selekcji dziewiąta biblioteka RNA (9-RNA) wykazuje wiązanie 9,72% RNA wejściowego. Mimo przeprowadzenia dodatkowych rund selekcji nie zaobserwowano dalszego wzbogacenia, co sugeruje, że osiągnięto maksymalne wiązanie puli RNA (Ryc. 2A). Podobnie jak w przypadku testu wiązania na filtrze, test przesunięcia w żelu jest również jedną z najpopularniejszych strategii wyznaczania stałych dysocjacji. Procedura ta jest prosta i wygodna. Jak pokazano na Ryc. 2B, testy przesunięcia w żelu dodatkowo potwierdzają aktywność wiążącą pul RNA. Wyniki te dowodzą, że w pulach RNA sukcesywnie wzbogacają się niektóre ligandy o wysokiej specyficzności wiązania do białka docelowego.

Przeprowadzono klonowanie i sekwencjonowanie silnie wzbogaconych pul aptamerów (12-RNA). Na podstawie dopasowania sekwencji poszczególnych sklonowanych aptamerów wyodrębniono sześć różnych grup, przedstawionych w Tabeli 2. Około 40% klonów (aptamery z grup I i II) zawiera konserwatywną sekwencję: A(A/G)TTGAGGGACC(A/G). Ze względu na ich względną liczność w danej grupie, do dalszej charakterystyki wybrano jedną reprezentatywną sekwencję z każdej grupy (na przykład: A-1, A-5, A-9, A-12, A-28 oraz B-68). Za pomocą natywnego testu przesunięcia mobilności w żelu obliczono stałe dysocjacji (Kd) tych reprezentatywnych aptamerów (Rysunek 3A). Na przykład aptamer A-1, wykazujący najlepsze właściwości, posiada pozorną wartość Kd wynoszącą 52 nM (Rysunek 3B). Jak pokazano na Rysunku 3A, wybrane aptamery mogą selektywnie wiązać się z docelowym białkiem HIV-1 Bal gp120, ale nie z białkiem HIV gp120 CM.

2. Aptamer anty-gp120 specyficznie wiąże się i jest internalizowany przez komórki wykazujące ekspresję HIV gp160 oraz hamuje zakażenie HIV-1 w hodowlach komórkowych.

Komórki CHO-gp160 stabilnie eksponujące glikoproteinę otoczki HIV gp160 są wykorzystywane do badania wiązania i internalizacji wybranych aptamerów anty-gp120. Komórki te nie przetwarzają gp160 do gp120 i gp41, ponieważ brakuje im proteaz kodowanych przez gen gag, które są niezbędne do przetwarzania otoczki. Jako kontrolę stosuje się rodzimą linię komórkową CHO-EE, która nie eksponuje gp160. Analizy cytometryczne (Rycina 4A) wykazują, że aptamery znakowane Cy3 wiążą się specyficznie z komórkami CHO-gp160, ale nie z kontrolnymi komórkami CHO-EE. Ponadto konfokalna mikroskopia żywych komórek w czasie rzeczywistym w osi Z wskazuje, że znakowany Cy3 aptamer jest selektywnie internalizowany w komórkach CHO-gp160 (Rycina 4B i 4C) po 2 godzinach inkubacji, natomiast nie zachodzi to w kontrolnych komórkach CHO-EE (Rycina 4D). Rycina 4C pokazuje również, że aptamer zagregował w cytoplazmie, co sugeruje, że aptamery gp120 mogą wnikać do komórek poprzez endocytozę zależną od receptorów.

W teście z wyzwaniem wirusem HIV-1 komórki PBMC zainfekowane HIV-1 są traktowane aptamerami. W różnych dniach po zastosowaniu aptamerów analizuje się próbki medium pod kątem poziomu antygenu wirusowego p24 (Rycina 4E). Wyniki pokazują, że aptamery anty-gp120 (A-1) hamują produkcję p24 HIV-1 w stężeniu nano-moliwnym.

3. Zaprojektowano chimerę aptamer-siRNA anty-gp120 i oceniono jej skuteczność jako system dostarczania siRNA specyficzny dla typu komórek

Jak pokazano na rysunku 5A, aptamer oraz segment nici sensownej siRNA zawierają odporne na nukleazy 2'-fluorowy UTP i 2'-fluorowy CTP i są syntetyzowane z odpowiadających im matryc dsDNA poprzez transkrypcję in vitro z użyciem bakteriofaga. Aby zwiększyć elastyczność cząsteczki, pomiędzy aptamerem a częścią będącą substratem dla białka Dicer wprowadzono dw nukleotydowy łącznik (UU). Aby przygotować chimery zawierające siRNA, in vitro transkrybowane polimery chimeryczne aptamer-nić sensowna są hybrydyzowane z ekimolarnymi stężeniami niemodyfikowanej RNA nici antysensownej. Te dane z analizy przesunięcia elektroforetycznego (Rysunek 5B) oraz cytometrii przepływowej (Rycina 5C) wskazują, że chimery zachowują w przybliżeniu takie same powinowactwa wiązania jak same aptamery. Obrazy z przebiegu czasowego uzyskane za pomocą konfokalnej mikroskopii w czasie rzeczywistym (Rysunek 5D) wykazuje, że chimera Ch A-1 znakowana Cy3 może zostać skutecznie zinternalizowana do cytoplazmy komórek. Zgodnie z oczekiwaniami, w przypadku komórek kontrolnych CHO-EE nie obserwuje się pobierania chimery (Rycina 5E).

Podobnie, potencjał przeciwwirusowy cząsteczek RNA oceniono za pomocą testu zakaźnego HIV-1. Wyniki analiz antygenu p24 HIV (rycina 6A i 6B) wykazują, że zarówno aptamer, jak i chimera hamują produkcję p24, jednak najsilniejsze hamowanie zaobserwowano po zastosowaniu chimery Ch A-1.

Aby potwierdzić, że komponent siRNA funkcjonuje wraz z aptamerem, po internalizacji chimery Ch A-1 w zakażonych komórkach, oceniliśmy również względne poziomy hamowania ekspresji genów tat/rev za pomocą ilościowych testów ekspresji RT-PCR. Stwierdzono, że traktowanie zakażonych komórek chimerami jest w stanie wywołać wyciszenie genu tat/rev, podczas gdy sam aptamer nie wpłynął na ekspresję genu tat/rev (Rysunek 6C i 6D). Wyniki te stanowią dodatkowe potwierdzenie, że siRNA dostarczone przez aptamer wyzwala mechanizm RNAi.

 Ilość białka, puli RNA i tRNA użytych do selekcji 
Rundy SELEXStosunek Target/RNABiałko Gp120Pula RNAKonkurencyjne tRNABufor selekcyjny
11/6.5229.8 pmol1.5 nmol (40.1 μg)0Bufor SELEX o niskim zasoleniu
21/6.5114.9 pmol0.75 nmol (20.1 μg)0.25 nmol (6.6 μg)
31/876.6 pmol0.625 nmol (16.7 μg)0.25 nmol (6.6 μg)
41/876.6 pmol0.625 nmol (16.7 μg)0.25 nmol (6.6 μg)
51/838.3 pmol0.306 nmol (8.18 μg)0.5 nmol (13.2 μg)Bufor SELEX o wysokim zasoleniu
61/838.3 pmol0.306 nmol (8.18 μg)0.5 nmol (13.2 μg)
71/1026.8 pmol0.268 nmol (7.16 μg)0.5 nmol (13.2 μg)
81/1026.8 pmolpmol 0.268 nmol (7.16 μg)1 nmol (26.4 μg)
91/1015.3 pmol0.153 nmol (4.09 μg)1 nmol (26.4 μg)
101/1015.3 pmol0.153 nmol (4.09 μg)1.5 nmol (39.6 μg)
111/12.57.66 pmol0.096 nmol (2.56 μg)2 nmol (52.8 μg)
121/12.57.66 pmol0.096 nmol (2.56 μg)2 nmol (52.8 μg)

Tabela 1. Warunki selekcji. Wskazano ilość białka, pulę RNA oraz tRNA wykorzystaną do każdej selekcji, a także zastosowany bufor do selekcji.

GrupaRNASekwencje losoweCzęstotliwość (140 klonów)
Grupa IA-1AATTGAGGGACCACGCGCTGCTTGTTGTGATAAGCAGTTTGTCGGATGG33 (23.6%)
B-7AATTGAGGGACCAACGCGAGGATGTGGATAGTGTGTATTTGCGTGATGG3
A-32AATTGAGGGACCGTTGGTAAAAGCCGGAAATTGAGCTTTTACGGCGATGG5
B-55AATTGAGGTACCGCGTTATTAGGAACAAATTGGAATTCTAAACGCGATGG2
A-24AATAGAGGGACCCAGATATAGGCTACACGGATGATGGTGTATCTGGATGG1
B-19AATAGAGGAACCGTTTCAGAAGACTACAGGTTAGTCCAATGAAGCGACGG1
B-31AATAGAGGGACCGTGGACAATAATTTATGGTCA TTTATTGGCACGATGG1
Grupa IIA-12AGTAGAGGAACCAAGCAATGGATGAATGCAAAAGTGTAAATGCTTGATGG10 (7.1%)
Grupa IIIA-9TGAGTTTGGGTAAATTTCCGGTTTCGGTTTACTCACGAAAGATCGGTCGG15 (10.7%)
Grupa IVA-28TAAAGGAGGGAAGGATGAGACCGCACGAAAAATATCAGCATACGTTTGTG10 (7.1%)
Grupa VA-5GAAACTAGTTTGAATAATGGTGTAGAGGAGGGTCAATAGTTTCGTTGGTG9 (6.4%)
Grupa VIB-68ACATAGTAATGACACGGAGGATGGAGAAAAAACAGCCATCTCTTGACGGT2
Inne Sekwencja osierocona48

Tabela 2. Dopasowanie i identyfikacja aptamerów RNA. Po 12tej rundzie selekcji wybrana pula RNA została sklonowana i zsekwencjonowana. Po dopasowaniu wszystkich 140 klonów zidentyfikowano sześć grup aptamerów anty-gp120. Wskazano jedynie losowe sekwencje rdzeniowych regionów aptamerów (5'-3'). Określono izolaty występujące z różną częstotliwością.

Selekcja aptamerów RNA do białka Gp120; schemat przedstawiający RT-PCR, filtrację na błonie nitrocelulozowej oraz proces SELEX.
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja procedury selekcji in vitro z wykorzystaniem błony nitrocelulozowej w celu wytworzenia aptamerów RNA do białka HIV-1 Bal gp120. (A) Początkowa pula RNA oraz białko docelowe zostały inkubowane w celu utworzenia kompleksu. (B) Związane cząsteczki RNA zostały zatrzymane na błonie, a następnie eluowane z błony w warunkach denaturujących. (C) Niezwiązane cząsteczki RNA zostały wypłukane. (D) Wyselekcjonowane RNA poddano odwrotnej transkrypcji i amplifikacji metodą PCR. (E) Odpowiednie DNA zostało następnie przetranskrybowane do nowej puli RNA na kolejne cykle selekcji. (F) Po 10–15 rundach selekcji wyselekcjonowane aptamery zostały sklonowane i zsekwencjonowane.

Postępy SELEX: wykres analizy wiązania na filtrze; wyniki analizy przesunięcia w żelu dla różnych stosunków białka gp120 do RNA.
Rycina 2: Postępy selekcji aptamerów do HIV-1 gp120. (A) Aktywność wiązania puli RNA w każdym cyklu analizowano za pomocą analizy wiązania na filtrze z tRNA jako konkurentem. Aktywność wiązania obliczono jako procent wejściowego RNA zatrzymanego na filtrze w kompleksie białko/RNA. (B) Aktywność wiązania puli RNA w każdym cyklu analizowano za pomocą analizy przesunięcia w żelu. 12na pula RNA wykazała najwyższą aktywność wiązania.

Schemat analizy przesunięcia w żelu; analiza oddziaływania aptamer-białko; elektroforeza, dane krzywej wiązania.
Rycina 3: Analiza aktywności wiązania wybranych pojedynczych aptamerów z HIV-1Bal gp120. (A) Pojedyncze aptamery znakowane P32 na końcu 5' inkubowano z rosnącymi ilościami docelowego białka gp120 lub nieswoistego białka CM. Mieszaniny reakcyjne wiązania analizowano za pomocą analizy przesunięcia mobilności w żelu. Aptamery A-1 i B-68 wykazały najlepsze powinowactwo wiązania do białka docelowego, ale nie do białka CM. Dane przedstawiają średnią z czterech powtórzeń. (B) Krzywa wiązania z analizy przesunięcia w żelu.

specyficzność wobec HIV-1, wiązanie aptameru, gp120, cytometria przepływowa, lokalizacja, fluorescencja, komórki CHO.
Rysunek 4: Badania wiązania i pobierania aptamerów specyficzne dla typu komórek.AWiązanie z powierzchnią komórek RNA znakowanych Cy3 oceniono metodą cytometrii przepływowej. Testowano wiązanie RNA znakowanych Cy3 do komórek CHO-gp160 oraz kontrolnych komórek CHO-EE. Wybrane aptamery wykazały specyficzne dla typu komórek powinowactwo wiązania. 2nd Jako kontrole negatywne wykorzystano pulę RNA oraz nieistotne cząsteczki RNA. Dane reprezentują średnią z trzech powtórzeń. (B) Analiza internalizacji. Komórki CHO-gp160 hodowano w płytkach 35 mm i inkubowano z Cy3-znakowanym A-1 w stężeniu 100 nM w pożywce hodowlanej w celu przeprowadzenia analizy za pomocą konfokalnej mikroskopii obrazowej żywych komórek w czasie rzeczywistym. Obrazy gromadzono w odstępach 15-minutowych przy użyciu powiększenia 40X. (C, D) Analiza lokalizacji. Komórki CHO-gp160 oraz kontrolne komórki CHO-EE hodowano w płytkach 35 mm. Przed inkubacją ze 100 nM znakowanego Cy3 związku A-1, komórki barwiono Hoechst 33342 (barwnikiem jądrowym do żywych komórek), a następnie analizowano przy użyciu konfokalnej mikroskopii czasu rzeczywistego. (EWybrane aptamery anty-gp120 hamują replikację HIV-1 w ludzkich PBMC uprzednio zainfekowanych wirusem HIV-1 NL4-3. Przedstawiono różne stężenia i punkty czasowe. Podano wartość IC50. Dane stanowią średnią z pomiarów p24 wykonanych w trzech powtórzeniach.

Schemat i wyniki edycji genów; analiza przesunięcia w żelu siRNA, cytometria przepływowa i obrazowanie fluorescencyjne.
Rycina 5: Projektowanie i ocena systemu dostarczania chimerycznego aptameru-siRNA.A) Schemat chimerycznych RNA aptamer-siRNA: region aptameru anty-gp120 odpowiada za wiązanie z gp120, a siRNA jest skierowany przeciwko wspólnemu eksonowi HIV-1 tat/revModyfikowany 2'-fluorowo poczuciowy pojedynczy pasmo aptameru-siRNA poddano wspólnej transkrypcji, po czym przeprowadzono hybrydyzację z komplementarnym antypoczuciowym pasmem siRNA w celu utworzenia chimerycznej cząsteczki. Linker (UU) pomiędzy aptamerem a siRNA zaznaczono kolorem zielonym.BChimeryczne RNA typu aptamer-siRNA, które wykazują porównywalne wartości Kd co aptamery macierzyste, specyficznie wiążą się z HIV Bal białko gp120. Dane przedstawiają średnią z trzech powtórzeń. (C) Badania wiązania aptamerów specyficzne dla typu komórek. RNAs znakowane Cy3 przetestowano pod kątem wiązania z komórkami CHO-gp160 oraz kontrolnymi komórkami CHO-EE. Wiązanie RNAs znakowanych Cy3 z powierzchnią komórek oceniono metodą cytometrii przepływowej. Wybrane aptamery wykazały powinowactwo wiązania specyficzne dla typu komórek. 2nd Jako kontrole negatywne wykorzystano pulę RNA oraz nieistotne RNA. Dane przedstawiają średnią z dwóch powtórzeń. (D, E) Analizy internalizacji i lokalizacji wewnątrzkomórkowej. Komórki CHO-gp160 hodowano na płytkach 35 mm i barwiono Hoechst 33342 (barwnikiem jądrowym do żywych komórek). Następnie komórki inkubowano w pożywce hodowlanej z chimerą znakowaną Cy3 w stężeniu 100 nM w celu przeprowadzenia analizy za pomocą konfokalnej mikroskopii żywych komórek w czasie rzeczywistym, zgodnie z wcześniejszym opisem.

Wykres słupkowy ekspresji HIV-1, CEM/IIIB vs. PBMC/Bal; wpływ siRNA, analiza Tat/rev, badanie 7-8 dniowe.
Rysunek 6: Podwójne hamowanie infekcji HIV-1 pośredniczone przez chimery aptamer-siRNA. Zarówno aptamer anty-gp120, jak i chimery aptamer-siRNA neutralizowały infekcję HIV-1 odpowiednio w kulturach (A) komórek CEM (szczep IIIB) oraz (B) ludzkich PBMC (szczep BaL). Dane przedstawiają średnią z pomiarów p24 wykonanych w trzech powtórzeniach. Chimery wykazały silniejsze hamowanie niż sam aptamer, co wskazuje, że (C, D) siRNA dostarczone przez aptamery obniżyły ekspresję genów tat/rev w PBMC. Dane przedstawiają średnią z trzech powtórzeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aptamery to ewoluowane in vitro kwasy nukleinowe, które przyjmują specyficzne i stabilne kształty trójwymiarowe, zapewniając tym samym bardzo specyficzne i silne wiązanie z cząsteczkami docelowymi8. Niskonanomolarna powinowactwo wiązania i wyjątkowa specyficzność aptamerów względem ich celów sprawiają, że są one wszechstronnymi narzędziami w diagnostyce, obrazowaniu in vivo oraz terapeutyce9. Dzięki rozwojowi technologii aptamerów w ukiernicowanym dostarczaniu siRNA, możliwe jest o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

J. R i J. Z. posiadają oczekiwany patent na „System dostarczania aptameru-siRNA specyficznego dla typu komórek w terapii HIV-1”. USPTO, nr 12/328994, data publikacji: 11 czerwca 2009 r.

Podziękowania

Dziękujemy Britta Hoehn, Guihua Sun, Harris Soifer oraz Lisa Scherer za pomocne dyskusje. Niniejsza praca została sfinansowana z grantów National Institutes of Health AI29329 i HL07470 przyznanych J.J.R. Poniższe odczynniki zostały pozyskane poprzez NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: linia komórkowa CHO-EE i CHO-gp160; wektor pNL4-3 luc; HIV-1BaL gp120 z DAIDS, NIAID.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
filtr membranowy MF-MilliporeEMD MilliporeHAWP01300rozmiar porów 0,45 μm
uchwyt do filtrów SwinnexEMD MilliporeSX0001300średnica 13 mm
zestaw do ekstrakcji żelowej QIAquickQiagen28706oczyszczanie DNA
kolumna Microcon YM-30EMD Millipore42410koncentracja RNA
kolumna Bio-spin 30Bio-Rad732-6250oczyszczanie RNA
polimeraza DNA Taq PCRSigma-AldrichD1806
system ThermoScript RT-PCRInvitrogen11146-024
zestaw do transkrypcji T7 DuraScribeEpicentre BiotechnologiesDS010925
dNTP do PCRRoche Group1 581 295
kwas rybonukleowy, transfer z E.coliSigma-AldrichR1753konkurent tRNA
białko HIV-1Ba-L gp120National Institutes of Health4961białko docelowe
zestaw do znakowania siRNA Silencer – Cy3Ambion1632
roztwór kwasowego fenolu/chloroformu 5/1 (pH 4,5)AmbionAM9720
roztwór chloroformu/izopropanolu 24/1Sigma-AldrichC0549
fosfataza jelitowa cielęca (CIP)New England BiolabsM0290L
polinukleotydowa kinaza T4New England BiolabsM0201L
glikogenRoche Group10 901 393 001wytrącanie RNA
Gamma-P32-ATPMP Biomedicals013502002radioaktywność
40% AccuGel 19:1National DiagnosticsEC-850
10xTBENational DiagnosticsEC-860
N,N,N,N’-tetrametylのエチレンジアミン (TMEMD)Sigma-AldrichT9281
persiarczan amonu (APS)Sigma-AldrichA3678
L-metioninosulfoxyminaSigma-AldrichM5379-250 mg
pożywka RPMI 1640Invitrogen11835-030
roztwór wodorowęglanu sodu, 7,5% m/vInvitrogen25080-094
podstawkowa pożywka niezbędna (MEM) (10')Invitrogen11430-030
niezbędne aminokwasy MEM (100')Invitrogen11140-050
zestaw do klonowania TA z pCR 2.1InvitrogenK2040-01

Bibliografia

  1. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  2. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  3. Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature. 344, 467-468 (1990).
  4. Fitzwater, T., Polisky, B. A SELEX primer. Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).
  5. Weiss, C. D., White, J. M. Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol. 67, 7060-706 (1993).
  6. Vodicka, M. A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses. Virology. 233, 193-198> (1997).
  7. Zhou, J. Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells. Nucleic Acids Res. , (2009).
  8. Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).
  9. Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).
  10. Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. Aptamer mediated siRNA delivery. Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).
  11. McNamara, J. O., 2nd, Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).
  12. Dassie, J. P. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors. Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).
  13. Zhou, J., Rossi, J. J. The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers. Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).
  14. Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy. Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Selekcja aptamer w RNASELEX z u yciem filtra nitrocelulozowegoRNA modyfikowane 2 fluoremchimera aptamer siRNAanaliza przesuni cia elektroforetycznego gel shift assaymikroskopia konfokalnacytometria przep ywowadostarczanie specyficzne dla typu kom rekneutralizacja HIV 1

Powiązane artykuły