Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

19.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2957

⸱

23 czerwca 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Hotchkiss Brain Institute, Alberta Children’s Hospital Research Institute, University of Calgary , 2Department of Medical Genetics, Alberta Children’s Hospital Research Institute, Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary

W tym artykule

Podsumowanie

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Streszczenie

Zdolność do manipulowania ekspresją genów stanowi kamień węgielny współczesnej embriologii eksperymentalnej, prowadząc do wyjaśnienia wielu szlaków rozwojowych. Dostępnych jest kilka potężnych i dobrze ugruntowanych technologii transgenicznych pozwalających na manipulację poziomami ekspresji genów u myszy, co umożliwia generowanie modeli zarówno z utratą, jak i z nabyciem funkcji. Jednakże tworzenie myszy transgenicznych jest zarówno kosztowne, jak i czasochłonne. W związku z tym szeroko poszukiwano alternatywnych metod manipulacji genetycznej. Elektroporacja in utero jest metodą dostarczania genów do żywych embrionów myszy1,2, którą z powodzeniem zaadaptowaliśmy3,4. Opiera się ona w dużej mierze na sukcesie technologii elektroporacji in ovo, powszechnie stosowanych u kurcząt5. W skrócie, DNA jest wstrzykiwane do otwartych komór rozwijającego się mózgu, a przyłożenie prądu elektrycznego powoduje powstanie przejściowych porów w błonach komórkowych, co umożliwia wniknięcie DNA do wnętrza komórki. W naszych badaniach embriony można efektywnie elektroporować już w 11,5 dniu embrionalnym (E11.5), podczas gdy celowanie w młodsze embriony wymagałoby protokołu mikroiniekcji sterowanej ultradźwiękami, jak opisano wcześniej6. Z kolei E15.5 jest najpóźniejszym etapem, na którym możemy łatwo przeprowadzić elektroporację, ze względu na rozpoczęcie różnicowania kości ciemieniowych i czołowych, co utrudnia mikroiniekcję do mózgu. W przeciwieństwie do tego, siatkówka jest dostępna aż do końca embriogenezy. Embriony można pobierać w dowolnym momencie w okresie embrionalnym lub wczesnym okresie postnatalnym. Iniekcja konstruktu reporterowego ułatwia identyfikację transfekowanych komórek.

Do chwili obecnej elektroporacja in utero była najszerzej stosowana w analizie rozwoju nowokory).1,2,3,4Nowsze badania koncentrowały się na zarodkowej siatkówce7,8,9 oraz wzgórze10,11,12W niniejszym opracowaniu przedstawiamy zmodyfikowaną wewnątrzmacicznie protokół elektroporacji, który można łatwo dostosować do celowania w różne domeny embrionalnego OUN. Przedstawiamy dowody na to, że stosując tę technikę, możemy celować w embrionalny telencefalon, diencefalon oraz siatkówkę. Zaprezentowano reprezentatywne wyniki, wykazujące w pierwszej kolejności zastosowanie tej techniki do wprowadzania konstruktów ekspresyjnych DNA do komór bocznych, co pozwala na monitorowanie dojrzewania, różnicowania i migracji progenitorów w embrionalnym telencefalonie. Wykazujemy również, że technikę tę można wykorzystać do kierowania DNA do obszarów diencephalicznych otaczających 3rd komorę, co pozwala na monitorowanie dróg migracji różnicujących się neuronów do jąder wzdółmózgowia. Na koniec wykazujemy, że zastosowanie mikromanipulatorów umożliwia precyzyjne wprowadzanie konstruktów DNA do niewielkich obszarów docelowych, w tym do przestrzeni podsiatkówkowej, co pozwala na analizę wpływu manipulacji ekspresją genów na rozwój siatkówki.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Przygotować pole operacyjne zgodnie z rys. 1A,A'. Kluczowe elementy zestawu obejmują mikroinżektor Eppendorf Femtojet, mikromanipulator Narishige z uchwytem do igieł, stereomikroskop Leica, światłowodowy system oświetlenia, system elektroporacji prostokątnej ECM 830 z elektrodami, matę grzewczą oraz waporyzator do znieczulenia izofluranem.
  2. Oczyścić wszystkie narzędzia w myjce ultradźwiękowej Bransonic, używając nisko pieniącego roztworu Metriclean2 do sonikacji narzędzi chirurgicznych. Sterylizować narzędzia w autoklawie. Sterylne narzędzia przechowywać w Germex.
  3. Przygotować strzykawki z ciepłą sterylną solą fizjologiczną oraz sterylnym roztworem Lactated Ringer’s.

2. Znieczulenie

  1. Umieść zwierzę w małej (12cm x 20cm) komorze anestezjologicznej. Za pomocą waporyzatora podawaj 5% izofluranu i tlen z przepływem 1L/min (Ryc. 1A,A'). Należy zwrócić szczególną uwagę na odprowadzanie wyczerpanego izofluranu za pomocą systemu ewakuacyjnego.
  2. Wyjmij zwierzę z komory, gdy oddech stanie się głęboki i regularny. Aby upewnić się, że znieczulenie jest pełne, przeprowadź testy poprzez uciskanie palców u stóp oraz sprawdzenie odruchu mrugania oka.
  3. Umieść ciężarną mysz na grzbiecie na podkładce grzewczej (37°C). Podkładkę grzewczą należy najpierw wysterylizować, przecierając ją 70% etanolem, a następnie przykryć sterylną gazą niepozostawiającą włókien. Podczas operacji stosuj aparat z rurką i maską oddechową do podawania izofluranu (2,25%).
  4. Wstrzyknij buprenorfinę (0,1mg/kg masy ciała) podskórnie w okolicy karku.
  5. Przez cały czas trwania operacji monitoruj oddech zwierzęcia, aby upewnić się, że jest głęboki i regularny. Zwierzę nie powinno łapać powietrza ani oddychać płytko lub szybko. Płytki, szybki oddech może być oznaką zbyt płytkiej anestezji, w takim przypadku należy zwiększyć przepływ izofluranu. Jeśli zwierzę zacznie łapać powietrza, należy zmniejszyć przepływ izofluranu. W przypadku zatrzymania oddechu wyłącz izofluran i zwiększ przepływ tlenu, aż zwierzę odzyska przytomność. Następnie ponownie podaj izofluran w niższym stężeniu.

3. Przygotowanie zwierząt do zabiegu chirurgicznego

  1. Przyklej przednie kończyny zwierzęcia do mata grzewczego i ponownie sprawdź reakcję cofania, ściskając tylną stopę tępą pęsetą.
  2. Za pomocą sterylnego patyczka z watą nałóż grubą warstwę kremu do depilacji (np. Nair) na brzuch. Pewnymi ruchami upewnij się, że podszerstka została całkowicie pokryta. Pozostaw preparat średnio na trzy minuty, okresowo sprawdzając usuwanie włosów za pomocą sterylnego, czystego patyczka. Zwilż sterylną gazę sterylną wodą i przemyj brzuch, aż do całkowitego usunięcia pozostałości kremu. Powtórz czynność, używając środka do oczyszczania skóry z chlorheksydyną (np. Stanhexidine) oraz wody. Osusz brzuch czystą, sterylną gazą.
  3. Zdezynfekuj miejsce nacięcia chlorheksydyną (np. Stanhexidine), a następnie sterylną wodą. Osusz brzuch czystą, sterylną gazą. Powtórz ten krok, używając 70% etanolu i nowego, wysterylizowanego patyczka z watą.
  4. Umieść na brzuchu sterylną gazę z nacięciem w środku, przez które podczas operacji zostaną wyprowadzone rogi macicy.

4. Nacięcie i odsłonięcie rogów macicy

  1. Aby odsłonić rogi macicy, najpierw zlokalizuj linię białą (linea alba) jako słabą linię pod skórą w linii środkowej. Używając pincety, odciągnij skórę od ściany brzusznej i wykonaj małe, proste nacięcie od środka brzucha w dół za pomocą nożyczek do skóry (o długości około 1 cm).
  2. Powtórz tę procedurę w odniesieniu do otrzewnej, używając zakrzywionej pincety i nożyczek.
  3. Umieść sterylną gazę z małym pionowym nacięciem nad rozcięciem i zwilż ją ogrzaną sterylną solą fizjologiczną.
  4. Wsuń pincetę do rozcięcia i zlokalizuj macicę. Trzymaj rozcięcie otwarte za pomocą pincety podczas wyciągania rogów macicy.
  5. Ostrożnie chwyć macicę pomiędzy pierwszym a drugim widocznym embrionem i wyciągnij embriony na gazę. Usuń obie strony rogów macicy, kładąc je na sterylnej gazie, a następnie policz embriony, odnotowując wszelkie resorpcje lub embriony „niezdrowe” (np. o mniejszym rozmiarze ciała). Zwilż rogi macicy solą fizjologiczną i ostrożnie wprowadź połowę macicy z powrotem do jamy brzusznej.

5. Wstrzykiwanie DNA do komór mózgu

  1. Igły chirurgiczne przygotowuje się za pomocą wyciągacza mikropipet Sutter Flaming Micropipette Puller, wykorzystując mikropipety borokrzemianowe z kapilarami (program: heat=750, Pull=30, Vel= 90, Time= 150). Za pomocą sterylnego ostrza skalpela końcówka igły jest delikatnie ścięta pod kątem 45 stopni.
  2. Aby napełnić igłę, pipety Pasteura są wyciągane do wąskiej średnicy nad płomieniem. Do pipety do napełniania dołącza się końcówkę ustną, aby pobrać ˜10 μl DNA wolnego od endotoksyn w stężeniu 3 mg/ml zmieszanego z 0,01% zieleni metylowej (uwaga: barwnik w postaci zieleni metylowej umożliwia wizualizację wstrzykniętego DNA). Napełnioną igłę montuje się następnie na statywie mikromanipulatora i podłącza do injektora Femtojet.
  3. Zaczynając od zarodka położonego najbliżej jajnika, za pomocą pęsety okrągłej delikatnie obraca się zarodek w obrębie błony蜕decidua, tak aby był on ustawiony „przodem”, co umożliwia wykonywanie wstrzyknięć w kierunku od strony rostralnej do kaudalnej. Do oświetlenia i wizualizacji linii środkowej mózgu zarodkowego, która w obszarach rostralnych jest flankowana przez duże komory boczne, używa się światłowodowego źródła światła (Rys. 1B,B').
  4. Zarodek jest utrzymywany w pozycji za pomocą pęsety okrągłej. Igłę ustawia się nad macicą tak, aby kąt wejścia do mózgu wynosił około 45 stopni. Za pomocą mikromanipulatora, szybkim i pewnym ruchem, końcówka igły jest wprowadzana przez ścianę macicy do komory bocznej zarodka. Wstrzyknięcia kieruje się do komór bocznych, trzeciej komory lub przestrzeni podsiatkówkowej, aby celować odpowiednio w telencefalon, diencefalon i siatkówkę. Należy pamiętać, że pęcherzyki mózgu zarodkowego są otwarte we wczesnych stadiach rozwoju, tak że DNA wstrzyknięte do komór bocznych przepływa do 3rd komory.
  5. Należy nacisnąć pedał nożny, aby wstrzyknąć DNA wolne od endotoksyn (1-3 μL) za pomocą mikroinjektora Eppendorf Femtojet. Prawidłowe wstrzyknięcie jest łatwo widoczne dzięki rozprzestrzenianiu się zieleni metylowej w komorach mózgu zarodkowego. Następnie igłę powoli wycofuje się w górę, aby uniknąć jej złamania.

6. Elektroporacja

  1. Wstrzyknięty zarodek (nadal wewnątrz macicy) umieszcza się na sterylnej gazie położonej na brzuchu matki i dokładnie zwilża ogrzaną solą fizjologiczną. Uwaga** Dodanie soli fizjologicznej na powierzchnię błony jest niezbędne, aby umożliwić efektywny przepływ prądu elektrycznego.
  2. Do uchwycenia macicy po wstrzyknięciu DNA używa się elektrod GenePaddle. Pięć kwadratowych impulsów elektrycznych o napięciu 40-50V i czasie trwania 50 ms podaje się z częstotliwością jednego impulsu na sekundę, korzystając z systemu do elektroporacji ECM8300 BTX (Rys. 1C,C').
  3. Wstrzyknięty/elektroporowany zarodek przykrywa się ochronną mokrą gazą, a następnie przechodzi do kolejnego zarodka.
  4. Po zakończeniu wstrzykiwania/elektroporacji wszystkich wybranych zarodków, rogi macicy ostrożnie wsuwa się z powrotem do jamy brzusznej (Rys. 1D).
  5. Ostrożnie wyjmuje się drugi róg macicy i rozpoczyna procedurę ponownie, zaczynając od zarodka położonego najbliżej jajnika.

7. Szycie i staplowanie

  1. Po powrocie wszystkich embrionów do macicy, wstrzyknąć do jamy brzusznej ˜2-3 ml ciepłej soli fizjologicznej.
  2. Aby zamknąć ranę, należy najpierw usunąć gazę z brzucha i zidentyfikować krawędzie otrzewnej. Rozpocząć szycie otrzewnej, używając czarnej plecionej nici jedwabnej. W tej procedurze nie zaleca się stosowania szwów wchłanialnych, ponieważ są one zazwyczaj słabsze, co może prowadzić do krwawień pooperacyjnych i infekcji. Zakotwiczyć nić na otrzewnej najbliżej mostka, a następnie szyć w kierunku przeciwnym do punktu zakotwiczenia. Należy upewnić się, że wszystkie szwy są ciasne i że do otrzewnej nie zostały przypadkowo wszyte żadne leżące poniżej organy ani skóra. Odciąć pozostałą część nici i usunąć ją.
  3. Za pomocą pęsety ściągnąć skórę nad linią szwów. Używając zszywek do zamykania skóry Reflex™ 9 mm, zszyć skórę nad raną, dbając o to, aby nie zszywać linii szwów znajdującej się poniżej oraz nie naciągać skóry zbyt mocno. Preferowaną metodą jest uniesienie skóry pęsetą z dala od ciała i wprowadzenie zszywki pod kątem 90 stopni. Kontynuować do całkowitego zamknięcia rany (około trzech zszywek). Po zakończeniu upewnić się, że zszywki są ciasne, delikatnie dociskając je narzędziem do zszywania (Rys. 1D').

8. Opieka pooperacyjna

  1. Aby monitorować wybudzanie z narkozy, ułożyć samicę na brzuchu i wyłączyć izofluran. Pozostawiając pysk zwierzęcia w aparacie oddechowym, zwiększyć dopływ tlenu do 3%, aby wspomóc powrót do świadomości. Zwierzę należy umieścić na czystym, suchym gaziku na podgrzewaczce, aby zapobiec hipotermii.
  2. Gdy zwierzę jest jeszcze w stanie otumanienia, wstrzyknąć podskórnie 2 mL roztworu Ringera w okolicy karku.
  3. Kontynuować podawanie tlenu przez kilka minut oraz stosować ogrzewające gaziki, aby pobudzić zwierzę. Powinny pojawić się krótkie zrywy ruchowe w miarę powrotu do normalnego rytmu oddechowego. Obserwować zwierzę przez kilka minut, aż odzyska pełną świadomość.
  4. Spryskać brzuch samicy sprayem z gentamycyną i owinąć zwierzę sterylnym gazikiem.
  5. Przenieść zwierzę do sterylnej klatki z autoklawowaną ściółką i kartonowym schronieniem.
  6. Butelki z wodą należy dokładnie oczyścić, wysterylizować i napełnić sterylną wodą. Do 500 mL wody dodać 2 mL antybiotyku sulfametazyny (roztwór zapasowy 25%).
  7. Następnego dnia rano po operacji podać podskórnie buprenorfinę w dawce 0,05 mg/kg.
  8. Dokładnie monitorować samicę przez pierwsze 24 godziny po zabiegu. Jeśli zwierzęta są utrzymywane dłużej niż 24 h, drugiego dnia samice przenosi się do nowych sterylnych klatek.

9. Reprezentatywne wyniki

Nowokora

Neocortex to obszar OUN odpowiedzialny za przetwarzanie informacji wizualnych i sensoryczno-motorycznych oraz za wyższe funkcje poznawcze. Składa się on z glutaminergicznych neuronów projekcyjnych oraz GABAergicznych interneuronów, które pochodzą odpowiednio z grzbietowej i brzusznej części telencefalonu. Aby zbadać rolę poszczególnych genów w rozwoju neocortex, stosujemy elektroporację in utero w celu nadekspresji lub zablokowania ekspresji (np. poprzez zastosowanie konstruktów shRNA) wybranych genów w grzbietowym lub brzusznym telencefalonie1,3,4. Do nadekspresji genów w embrionalnym telencefalonie używamy bicistronowego wektora ekspresyjnego (pCIG2), który zawiera promotor-enhancer CMV-βactin oraz kasetę IRES (internal ribosome entry site)-EGFP (enhanced green fluorescent protein; w pCIG2), co pozwala na wykrycie przetransfekowanych komórek za pomocą epifluorescencji (Ryc. 2A-C). Technologię tę wykorzystaliśmy do wprowadzenia konstruktów ekspresyjnych do telencefalonu od E11.5 do E15.5 (dane przedstawiono dla E12.5; Ryc. 2). Pozwalając embrionom rozwijać się przez kilka dni po elektroporacji, jesteśmy w stanie śledzić różnicowanie i migrację progenitorów znakowanych GFP. W miarę postępującego różnicowania, 3 dni po elektroporacji komórki GFP+ różnicują się i migrują z strefy komórkowej (vz), strefy podkomórkowej (svz) i strefy pośredniej (iz) do płytki kory (cp; Ryc. 2C). Jeśli mózgi poddane elektroporacji w E12.5 zostaną przeanalizowane po 24 godzinach, możemy monitorować wcześniejsze etapy dojrzewania progenitorów i migrację neuronów poprzez współznakowanie markerami progenitorów apikalnych (np. Pax6; Ryc. 2A), progenitorów bazalnych (np. Tbr2; Ryc. 2B) oraz postmitotycznych neuronów neocortex (np. Tbr1; Ryc. 2C).

Wzgórze

Podwzgórze znajduje się w brzusznej części podstawy OUN i pełni funkcję bramy między układem hormonalnym a autonomicznym układem nerwowym. W trakcie rozwoju liczne jądra tworzące dojrzałe podwzgórze różnicują się ze wspólnej strefy progenitorowej wyścielającej najbardziej brzuszny region embrionalnego międzymózgowia. Obecnie szlaki molekularne regulujące proliferację komórek progenitorowych, różnicowanie neuronalne oraz formowanie się jąder podwzgórza są słabo poznane. Wykorzystaliśmy wewnątrzmacicznie elektroporacja w celu ukierunkowania ekspresji genu reporterowego w embrionalnym przedmózgowiu poprzez wstrzyknięcie DNA do 3rd komorę zarodków E12. Następnie śledziliśmy rozkład GFP w różnicujących się neuronach w stadium E14. Dzięki tej metodologii udało nam się skutecznie skierować ekspresję GFP do wzgórza, przedwzgórza i podwzgórza (Rys. 3A). Analiza przekrojów czołowych wykazuje, że pomyślnie skierowaliśmy ekspresję GFP do komórek progenitorowych wyścielających strefę komorową 3rd komora i neurony migrujące do strefy płaszcza w celu utworzenia jąder (Rys. 3B)

Siatkówka

Siatkówka jest warstwą neuronalną oka, odpowiedzialną za przekształcanie fotonów światła w impulsy elektryczne przesyłane do mózgu. Powstaje ona jako wypustka embrionalnego przedmózgowia, a zatem pochodzi z cewy nerwowej. Siatkówka neuronalna rozwija się z apikalnej strefy progenitorów, która znajduje się sąsiadująco z przestrzenią podsiatkówkową – jamą oddzielającą oko od mezenchymy głowy. Dostarczanie konstruktów DNA do progenitorów siatkówki wymaga zatem wykonywania iniekcji w niewielki obszar docelowy. Dzięki zastosowaniu mikromanipulatorów udało nam się skutecznie celować w ten mały obszar w embrionach od E13.5 do E15.5 (przedstawiono elektroporację pCIC z reporterem mCherry w stadium E15.5; Ryc. 4). Jeśli zelektroporowane siatkówki zostaną zbadane 24 h po transfekcji, obserwujemy, że większość komórek mCherry+ znajduje się w zewnętrznej warstwie neuroblastów (onbl), gdzie rozmieszczone są dzielące się progenitory, a nie w warstwie komórek zwojowych siatkówki (gcl; obraz wstawkowy), w której lokalizują się komórki postmitotyczne.

Układ mikrochirurgiczny do edycji genów poprzez mikroiniekcję i elektroporację w eksperymencie na embrionach.
Rycina 1. Wstęp do układu i metodologii elektroporacji in utero. (A) Kluczowe elementy układu chirurgicznego obejmują mikroiniektor Eppendorf Femtojet (1), mikromanipulator Narishige z uchwytem do igieł (2), stereomikroskop Leica (3), światłowodowy system oświetlenia (4), system elektroporacji prostokątnej ECM 830 z elektrodami (5) oraz matę grzewczą (6). (A') Zwierzę zostaje znieczulone przy użyciu waporyzatora do anestetyku izofluranu. (B,B') W skrócie, po znieczuleniu odsłania się rogi macicy, a DNA zmieszane z fast green wstrzykuje się do pęcherzyków mózgowych embrionu. Poprawność iniekcji jest wizualizowana poprzez śledzenie barwnika fast green (B'). (C,C') Po pomyślnym wstrzyknięciu DNA, elektrody płytkowe umieszcza się po obu stronach macicy, pozycjonując embrion tak, aby DNA zostało przyciągnięte w stronę bieguna dodatniego do wybranego obszaru mózgu. (D,D') Po iniekcji we wszystkich wybranych embrionach, macica jest wprowadzana z powrotem do jamy brzusznej (D), otrzewna zostaje zaszyta, a skóra zszyta zszywkami (D'). Następnie ciężarna samica przechodzi rekonwalescencję, a elektroporowane potomstwo jest pobierane w wybranych punktach czasowych.

Schemat rozwoju neuronalnego z markerami Pax6/GFP, Tbr2/GFP, Tbr1/GFP w progenitorach apoptycznych, bazalnych i neuronach.
Rysunek 2. Reprezentatywny przykład elektroporacji grzbietowej telencefalonu. (A-C) Mikrofotografia przekroju koronarnego przez grzbietowy telencefalon płodu w wieku E13,5, poddanego elektroporacji pCIG2 w wieku E12,5. Elektroporowane komórki GFP+ analizowano pod kątem ekspresji markerów progenitorów apoptycznych (Pax6+, czerwony, A), progenitorów bazalnych (Tbr2+, czerwony, B) oraz neuronów pomitotycznych (Tbr1+, czerwony, C). cp, blaszka korowa; svz, strefa podkomorowa, vz; strefa komorowa.

Schemat neurobiologiczny przedstawiający ekspresję pCIG2 w przekrojach embrionalnego mózgu E12-E14; analiza fluorescencyjna.
Rysunek 3. Reprezentatywny przykład elektroporacji międzymózgowia. (A) Widok brzuszny mózgu E14, który został poddany elektroporacji pCIG2 w stadium E12. Epifluorescencja GFP jest widoczna w wzgórzu, przedwzgórzu i podwzgórzu, co demonstruje rozprzestrzenianie się mikroiniekcyjnego plazmidu pCIG2 w obrębie 3rd komory. (B) Fotomikrografia przekroju czołowego przez elektroporowany mózg, pokazująca migrację komórek GFP+ z strefy komorowej do strefy płaszcza, gdzie uformują się jądra podwzgórza. 3V, trzecia komora; T, wzgórze; Hy, podwzgórze; mz, strefa płaszcza; Tel, telencephalon; PreT, przedwzgórze; vz, strefa komorowa.

Mikroskopia fluorescencyjna rozwoju siatkówki wykazująca ekspresję mCherry/Brn3b; od E15.5 do E16.5.
Rycina 4. Reprezentatywny przykład elektroporacji siatkówki. Przekrój czołowy oka w stadium E16.5 po elektroporacji pCIC w stadium E15.5, wykazujący gromadzenie się komórek mCherry+ w zewnętrznej warstwie neuroblastów, a nie w komórkach zwojowych siatkówki Brn3b+ w warstwie komórek zwojowych. Wstawka przedstawia obraz zaznaczonego obszaru w większym powiększeniu. gcl, warstwa komórek zwojowych siatkówki; le, soczewka; onbl, zewnętrzna warstwa neuroblastów; re, siatkówka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

In utero elektroporacja może być wykorzystana do analizy szerokiej gamy procesów rozwojowych. Na przykład transfekcja genów reporterowych, takich jak GFP, mCherry lub fosfataza alkaliczna, może służyć do przeprowadzania eksperymentów z mapowaniem linii komórkowych oraz migracją neuronów. Alternatywnie, rekombinaza Cre może być wyrażana przejściowo, aby selektywnie eliminować allel floxowany w sposób kontrolowany przestrzennie i/lub czasowo. Ponadto, w celu wyciszenia funkcji genów docelowych, można zastosować el...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Evie Hadzimovie, Pierre'owi Mattarowi oraz Christopherowi Kovachowi za ich wstępną pracę nad wdrożeniem technologii elektroporacji in utero w laboratorium CS. Praca ta była finansowana z grantu Canadian Institute of Health Research (CIHR) (MOP 44094) oraz grantu CIHR/Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging Team Grant (00933-000) przyznanego CS, a także z grantu Alberta Children's Hospital Research Foundation przyznanego DMK. RD otrzymał wsparcie w ramach CIHR Canada Hope Scholarship, RC korzysta ze wsparcia FFB Studentship, a LML otrzymał wsparcie z grantu szkoleniowego CIHR w zakresie genetyki i rozwoju dziecka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Precyzyjne nożyczkiNarzędzia chirurgiczneFine Science Tools14078-10
Nożyczki irydologiczne, zakrzywioneNarzędzia chirurgiczneFine Science Tools14061-10
igłotrzymacz Olsen-Hegar Ex-DelicateNarzędzia chirurgiczneFine Science Tools12002-12
Kleszczyki pierścieniowe, 9 mmNarzędzia chirurgiczneFine Science Tools11103-09
Pinceta okulistyczna do opatrunkówNarzędzia chirurgiczneFine Science Tools11051-10
Pęseta Dumont #7 DMXNarzędzia chirurgiczneFine Science Tools11271-30
Pinceta Dumont #5 DMXNarzędzia chirurgiczneFine Science Tools11251-30
Pinceta anatomiczna AdsonaNarzędzia chirurgiczneFine Science Tools11027-12
Aplikator klipsów ReflexNarzędzia chirurgiczneWorld Precision Instruments, Inc.500343
Łyżka perforowana, średnica 15 mmNarzędzia chirurgiczneFine Science Tools10370-18
Narzędzie do usuwania autoklipówNarzędzia chirurgiczneMikron427637
Nici chirurgiczne jedwabne, czarne, plecioneNarzędzia chirurgiczneEthicon Inc.K871
Stalowe klipsy do zamykania ran Reflex Skin ClosureNarzędzia chirurgiczneWorld Precision Instruments, Inc.500346
System do elektroporacji prostokątnej ECM 830InstrumentyVWR international58018-004
Pinceta ze zmiennym odstępem i dwiema okrągłymi platynowymi elektrodami o średnicy 5 mmInstrumentyProtech International, Inc.CUY650P5
Pinceta ze zmienną szczeliną, 2 okrągłe elektrody z płytek platynowych 7 mmInstrumentyProtech International, Inc.CUY650P7
Mikroinjektor Eppendorf FemtojetInstrumentyVWR internationalCA62111-488
Sterowanie nożne mikroinjektora Eppendorf FemtojetInstrumentyVWR internationalCAACCESS (różne)
Myjka ultradźwiękowa Bransonic Model 1510R-DTHPrzyrządyVWR InternationalCA33995-534CPN-952-118
Wytciągacz mikropipet Sutter P97 InstrumentySutter Instrument Co.P-97
Mikropipety -– Szkło borokrzemowe z włóknem o średnicy zewnętrznej: 1 mm, średnicy wewnętrznej: 0,78 mm i długości 10 cmInstrumentySutter Instrument Co.BF100-78-10
Trójosiowy manipulator gruboosiowyInstrumentyCarl Zeiss, Inc.M-152
Magnetyczne urządzenie mocujące do mikromanipulatoraInstrumentyWorld Precision Instruments, Inc.M1
Stalowa płyta bazowa do mikromanipulatoraInstrumentyWorld Precision Instruments, Inc.5052
Stojak na mikropipety InstrumentyWorld Precision Instruments, Inc.MPH3
Uchwyt mikropipetyInstrumentyWorld Precision Instruments, Inc.5444
StereomikroskopInstrumentyLeica MicrosystemsMZ6
Parowarz do izofluranu anestetycznegoInstrumentyPorter Instruments CompanyMODEL 100-F
Metriclean2 Niskopieniący roztwór do mycia narzędzi chirurgicznych w myjce ultradźwiękowejOdczynniki chirurgiczneMetrex Research Corporation10-8100
Spray antybiotykowy z gentamycyną 40 mg/ml w 0,2 g błękitu metylenowego stosowany po szyciuOdczynniki chirurgiczneSigma-AldrichG1264
Germex do sterylizacji narzędzi chirurgicznychOdczynniki chirurgiczneVétoquinolDIN# 00141569
maść okulistyczna BNPOdczynniki chirurgiczneVétokinolDIN# 00516414
Nair®Odczynniki chirurgiczneKościół & Dwight Co.dostępny w handlu
środek do oczyszczania skóry Stanhexidine 4% w/vOdczynniki chirurgiczneOmega Laboratories Inc.01938983
Analgetyk buprenorfina (Temgesic)Odczynniki chirurgiczneMerck &i Wsp.531-535
Sulfonamidy "25" antybiotyk doustny sulfametazynaOdczynniki chirurgiczneProfesjonalne Laboratoria WeterynaryjneDIN# 00308218
Roztwór Ringera z mleczanemOdczynniki chirurgiczneBaxter International Inc.DIN# 0061085
Sól fizjologiczna -– 0,9% chlorek soduOdczynniki chirurgiczneB. Braun MedicalDIN# 01924303
Anestetyk inhalacyjny -– izofluran USPOdczynniki chirurgicznePharmaceutical Partners of CanadaDIN# 02237518
Fast Green FCFOdczynniki chirurgiczneSigma-AldrichF7252

Bibliografia

  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  2. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
  3. Langevin, L. M. Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236. , 1273-1286 (2007).
  4. Mattar, P. Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity. Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).
  5. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).
  6. Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
  7. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
  8. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
  9. Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
  10. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  11. Vue, T. Y. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  12. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).
  13. Buffo, A. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zarodkowy OUNwstrzykiwanie DNAimpulsy elektryczneprogenitorzy neuronalnimikroskopia immunofluorescencyjnacelowanie w telencefaloncelowanie w diencefalonprzestrzeń podsiatkówkowa
Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.