$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Konfiguracja
- Ustawić obszar operacyjny, jak pokazano na ryc. 1A,A'. Kluczowe elementy zestawu to mikroiniektor Eppendorf Femtojet, mikromanipulator Narishige z uchwytem na igłę, steromikroskop Leica, światłowodowy system oświetleniowy, system elektroporacji fal prostokątnych ECM 830 z elektrodami, poduszka grzewcza i parownik do znieczulenia izofluranem.
- Wyczyść wszystkie narzędzia myjką ultradźwiękową Bransonic przy użyciu niskopieniącego roztworu Metriclean2 do sonikacji narzędzi chirurgicznych. Sterylizuj narzędzia przez autoklawowanie. Wysterylizowane narzędzia są następnie przechowywane w Germex.
- Przygotować strzykawki z ciepłą sterylną solą fizjologiczną i sterylnym roztworem Ringera z mleczanami.
2. Znieczulenie
- Umieść zwierzę w małej (12 cm x 20 cm) komorze anestezjologicznej. Za pomocą parownika dostarczyć 5% znieczulenia izofluranem i tlen w tempie 1 l/min (rys. 1A,A'). W szczególności ważne jest, aby zbierać spaliny z izofluranu za pomocą systemu oczyszczania.
- Wyjmij zwierzę z komory, gdy oddech stanie się głęboki i regularny. Testy szczypania palców u nóg i odruchu mrugania oczami są stosowane w celu zapewnienia pełnego znieczulenia.
- Połóż ciężarną mysz na plecach na poduszce grzewczej (37°C). Poduszka grzewcza jest najpierw sterylizowana przez przetarcie 70% etanolem, a następnie przykrywana wysterylizowaną, niestrzępiącą się gazikiem. Użyj rurki respiratora i maski, aby dostarczyć izofluran (2,25%) podczas operacji.
- Wstrzyknąć buprenorfinę (0,1 mg/kg masy ciała) podskórnie pod skórę na karku.
- Monitoruj zwierzę przez cały czas trwania operacji, aby uzyskać głębokie i regularne oddychanie. Zwierzę nie powinno sapać, oddychać płytko ani szybko. Płytki, szybki oddech może być oznaką lekkiego znieczulenia, a przepływ izofluranu powinien być zwiększony. Jeśli zwierzę zacznie sapać, zmniejsz przepływ izofluranu. W przypadku zatrzymania oddechu należy wyłączyć izofluran i zwiększyć przepływ tlenu do czasu wyzdrowienia zwierzęcia. Wznowić działanie izofluranu w niższym stężeniu.
3. Przygotowanie zwierząt do operacji
- Przyklej przednie kończyny zwierzęcia do poduszki grzewczej i ponownie sprawdź, czy nie ma reakcji wycofania, ściskając tylną stopę kleszczami.
- Za pomocą sterylnego wacika z bawełnianą końcówką rozprowadź grubą warstwę kremu do depilacji (tj. Nair) na brzuchu. Mocnymi pociągnięciami upewnij się, że podszerstek jest całkowicie pokryty. Pozostaw na średnio trzy minuty, sprawdzając co jakiś czas sterylnym, czystym wacikiem do depilacji. Zwilż sterylny gazik sterylną wodą i wytrzyj brzuch, aż wszystkie ślady znikną. Powtórz z chlorheksydyną (tj. Stanheksydyną), środkiem do czyszczenia skóry i większą ilością wody. Osusz brzuch czystą, sterylną gazą.
- Wysterylizuj miejsce nacięcia chlorheksydyną (tj. Stanheksydyną), a następnie bardziej sterylną wodą. Osusz brzuch czystą, sterylną gazą. Powtórz ten krok, używając 70% etanolu i świeżego, wysterylizowanego wacika.
- Umieść sterylną gazikę na brzuchu ze szczeliną pośrodku, przez którą zostaną przeciągnięte rogi macicy podczas operacji.
4. Nacięcie i odsłonięcie rogów macicy
- Aby odsłonić rogi macicy, najpierw zlokalizuj linea alba jako słabą linię pod skórą w linii środkowej. Za pomocą kleszczy odciągnij skórę od ściany brzucha i wytnij małe, proste nacięcie od połowy brzucha w dół nożyczkami do skóry (o długości około 1 cm).
- Za pomocą zakrzywionych kleszczy i nożyczek powtórz proces z otrzewną.
- Umieść sterylną gazę z małą pionową szczeliną nad nacięciem i zwilż podgrzaną sterylną solą fizjologiczną.
- Wsuń kleszcze do nacięcia i zlokalizuj macicę. Przytrzymaj otwarte nacięcie kleszczami podczas usuwania rogów macicy.
- Ostrożnie chwyć macicę między pierwszym a drugim widocznym zarodkiem i pociągnij zarodki na gazę. Usuń obie strony rogów macicy, umieszczając je na sterylnej gazie i policz liczbę zarodków, zwracając uwagę na wszelkie resorpcje lub "niezdrowe" (np. mniejsze rozmiary ciała) zarodki. Zwilż rogi macicy solą fizjologiczną i ostrożnie włóż połowę macicy do brzucha.
5. Wstrzyknięcie DNA do komór
- Igły chirurgiczne są przygotowywane za pomocą ściągacza do mikropipet Sutter Flaming przy użyciu mikropipet borokrzemianowych z naczyniami włosowatymi (Program: ciepło = 750, Ciągnięcie = 30, Vel = 90, Czas = 150). Za pomocą sterylnego ostrza skalpela końcówka igły jest delikatnie golona pod kątem 45 stopni.
- Aby załadować igłę, pipety Pasteura są ciągnięte do wąskiej średnicy pod płomieniem. Do pipety ładującej dołącza się ustnik w celu pobrania 10 μl 3 mg/ml DNA wolnego od endotoksyn zmieszanego z 0,01% zieleni metylowej (uwaga: barwnik zieleni metylowej umożliwia wizualizację wstrzyknięć DNA). Napełniona igła jest następnie montowana na stojaku mikromanipulatora i mocowana do wtryskiwacza Femtojet.
- Zaczynając od zarodka znajdującego się najbliżej jajnika, stosuje się okrągłe kleszcze, aby delikatnie obrócić zarodek w obrębie decidua, tak aby był ustawiony "twarzą do przodu", umożliwiając wstrzyknięcie w kierunku rostralnym do ogonowego. Światłowodowe źródło światła do oświetlenia służy do wizualizacji linii środkowej embrionalnego mózgu, która jest otoczona dużymi bocznymi komorami w obszarach rostralnych (ryc. 1B, B').
- Zarodek jest utrzymywany w pozycji za pomocą okrężnych kleszczy. Igła jest umieszczona nad macicą, tak aby kąt wejścia do mózgu wynosił około 45 stopni. Za pomocą mikromanipulatora oraz szybkim i jednostajnym ruchem końcówka igły jest wprowadzana przez ścianę macicy do bocznej komory zarodka. Zastrzyki są kierowane w stronę komór bocznych, trzeciej komory lub przestrzeni podsiatkówkowej, aby celować odpowiednio w kresomózgowie, międzymózgowie i siatkówkę. Należy zauważyć, że embrionalne pęcherzyki mózgowe są otwarte we wczesnych stadiach embrionalnych, tak że DNA wstrzyknięte do komór bocznych wpłynie do 3. komory.
- Naciśnij pedał nożny, aby wstrzyknąć DNA wolne od endotoksyn (1-3 μl) za pomocą mikrowstrzykiwacza Eppendorf Femtojet. Udane wstrzyknięcie można łatwo zobrazować, rozprowadzając zielony barwnik metylowy w embrionalnych komorach mózgu. Igła jest następnie powoli usuwana, wciągając ją z powrotem, aby uniknąć złamania.
6. Elektroporacja
- Wstrzyknięty zarodek (jeszcze w macicy) umieszcza się na sterylnej gazie przykrytej brzuchem matki i dokładnie zwilża podgrzaną solą fizjologiczną. Uwaga** Dodanie soli fizjologicznej do powierzchni membrany jest niezbędne, aby umożliwić efektywny przepływ prądu elektrycznego.
- Elektrody GenePaddle służą do chwytania macicy po wstrzyknięciu DNA. Pięć kwadratowych impulsów elektrycznych o napięciu 40-50 V i długości 50 ms jest dostarczanych z szybkością jednego impulsu na sekundę za pomocą systemu elektroporacji ECM8300 BTX (rys. 1C,C').
- Przykryj wstrzyknięty/elektroporowany zarodek ochronną mokrą gazą i przejdź do następnego zarodka.
- Po zakończeniu iniekcji/elektroporacji wszystkich pożądanych zarodków, ostrożnie wepchnij rogi macicy z powrotem do jamy brzusznej (ryc. 1D).
- Ostrożnie usuń drugi róg macicy i zacznij od nowa z zarodkiem znajdującym się najbliżej jajnika.
7. Szwy i zszywanie
- Gdy wszystkie zarodki znajdą się z powrotem w macicy, dodaj do jamy brzusznej ̃2-3 ml ciepłej soli fizjologicznej.
- Aby zamknąć ranę, zacznij od usunięcia gazy z brzucha i zidentyfikowania boków otrzewnej. Rozpocznij szycie otrzewnej za pomocą czarnej plecionej jedwabnej żyłki. Nie zaleca się stosowania szwów wchłanialnych do tego zabiegu, ponieważ są one zazwyczaj słabsze i mogą prowadzić do krwawienia pooperacyjnego i infekcji. Zakotwicz linkę na otrzewnej najbliżej mostka i przystąp do zszywania od kotwicy. Upewnij się, że wszystkie szwy są szczelne i że żadne leżące pod nimi narządy ani skóra nie zostały przypadkowo wszyte w otrzewną. Przytnij pozostałą linię szwu i wyrzuć.
- Pociągnij skórę zamkniętą nad linią szwów za pomocą kleszczy. Używając zszywek do zamykania skóry Reflex™ 9 mm, przypiąć skórę do rany, uważając, aby nie zszyć linii szwów pod spodem ani nie naciągnąć skóry zbyt mocno. Preferowaną metodą jest trzymanie skóry w górze i z dala od ciała za pomocą kleszczy i wsuwanie pod kątem 90 stopni za pomocą zszywki. Kontynuuj, aż rana zostanie zamknięta (około trzech zszywek). Po zakończeniu upewnij się, że zszywki są napięte, delikatnie dociskając do siebie za pomocą narzędzia do szycia (rys. 1D').
8. Opieka pooperacyjna
- Aby monitorować powrót do zdrowia po znieczuleniu, obróć kobietę na brzuch i wyłącz izofluran. Trzymając twarz zwierzęcia w aparacie oddechowym, obróć tlen do 3%, aby pomóc w powrocie do zdrowia po znieczuleniu. Zwierzę należy umieścić na czystej, suchej gazionce na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii.
- Gdy zwierzę jest oszołomione, wstrzyknąć 2 ml roztworu Ringera podskórnie pod skórę szyi zwierzęcia.
- Kontynuuj trzymanie zwierzęcia pod strumieniem tlenu przez kilka minut i rozgrzewanie gazików, aby obudzić zwierzę. Należy obserwować krótkie zrywy ruchu zwierzęcia, gdy wraca ono do normalnego wzorca oddychania. Obserwuj przez kilka minut, aż zwierzę stanie się przytomne i przytomne.
- Spryskaj brzuch samicy sprayem z gentamycyną i zawiń zwierzę w sterylną gazik
.
- Przenieś zwierzę do sterylnej klatki z autoklawowaną ściółką i tekturową obudową.
- Butelki z wodą należy dokładnie wyczyścić, wysterylizować i napełnić sterylną wodą. Do 500 ml wody dodaj 2 ml antybiotyku sulfametazynowego (25% bulionu).
- Buprenorfinę należy podawać podskórnie w dawce 0,05 mg/kg mc. rano po zabiegu.
- Uważnie monitoruj samicę przez pierwsze 24 godziny po operacji. Jeśli zwierzęta są trzymane dłużej niż 24 godziny, samice są przenoszone do nowych sterylnych klatek w 2 dniu.
9. Reprezentatywne wyniki
Kora nowa
Kora nowa to obszar OUN, który jest odpowiedzialny za przetwarzanie wzrokowe i sensomotoryczne oraz wyższe funkcjonowanie poznawcze. Składa się z neuronów projekcyjnych glutaminergiczny i interneuronów GABA-ergicznych, które pochodzą odpowiednio z kresomózgowia grzbietowego i brzusznego. Aby zająć się rolami różnych genów w rozwoju kory nowej, używamy elektroporacji in utero w celu nieprawidłowej ekspresji lub zablokowania ekspresji (tj. Za pomocą konstruktów shRNA) różnych genów w kresomózgowiu grzbietowym lub brzusznym1,3,4. Aby nieprawidłowo wyrażać geny w embrionalnym kresomózgowiu, używamy bicystronicznego wektora ekspresyjnego (pCIG2), zawierającego promotor-wzmacniacz CMV-βaktyny i kasetę białka zielonej fluorescencji wzmocnionego wewnętrznym miejscem wejścia rybosomów (IRES; w pCIG2), umożliwiając wykrycie transfekowanych komórek za pomocą epifluorescencji (ryc. 2A-C). Użyliśmy tej technologii do wprowadzenia konstruktów ekspresji do kresomózgowia od E11.5 do E15.5 (pokazane dane są na E12.5; Rys. 2). Pozwalając zarodkom rozwijać się kilka dni po elektroporacji, jesteśmy w stanie śledzić różnicowanie i migrację komórek progenitorowych znakowanych GFP. W miarę postępu różnicowania, 3 dni po elektroporacji komórki GFP+ różnicują się i migrują ze strefy komorowej (vz), podkomorowej (svz) i pośredniej (iz) do płytki korowej (cp; Rys. 2C). Jeśli mózgi poddane elektropoturze w E12,5 są analizowane po 24 godzinach, możemy monitorować wcześniejsze zdarzenia w dojrzewaniu progenitorów i migracji neuronów poprzez współznakowanie markerami wierzchołkowych progenitorów (tj. Pax6; Ryc. 2A), podstawni przodkowie (tj. Tbr2; Ryc. 2B) i postmitotyczne neurony kory nowej (tj. Tbr1; Rys. 2C).
Międzymózgowie
Podwzgórze leży u podstawy brzusznej OUN i funkcjonuje jako brama między hormonalnym a autonomicznym układem nerwowym. Podczas rozwoju wiele jąder tworzących dojrzałe podwzgórze różnicuje się ze wspólnej strefy progenitorowej, która wyściela najbardziej brzuszny obszar embrionalu międzymózgowia. Obecnie szlaki molekularne, które regulują proliferację komórek progenitorowych, różnicowanie neuronów i tworzenie jąder podwzgórza, są słabo poznane. Zastosowaliśmy elektroporację in utero, aby ukierunkować ekspresję genu reporterowego na międzymózgowie embrionalne poprzez wstrzyknięcie DNA do 3. komory zarodków E12. Następnie śledziliśmy rozkład GFP w różnicowaniu neuronów w E14. Dzięki tej metodologii udało nam się ukierunkować ekspresję GFP na wzgórze, przedwzgórze i podwzgórze (ryc. 3A). Analiza odcinków koronalnych pokazuje, że udało nam się skierować ekspresję GFP do komórek progenitorowych, które wyściełają strefę komorową 3. komory i neuronów, które migrują do strefy płaszcza, tworząc jądra (ryc. 3B)
Siatkówka
Siatkówka to warstwa neuronowa oka, odpowiedzialna za przekształcanie fotonów światła w impulsy elektryczne przesyłane do mózgu. Rozwija się jako wycięcie z embrionalnego międzymózgowia, a zatem pochodzi z cewy nerwowej. Siatkówka nerwowa rozwija się z wierzchołkowego przedziału progenitorowego, który przylega do przestrzeni podsiatkówkowej, jamy oddzielającej oko od mezenchymy głowy. Ukierunkowanie konstruktów DNA na komórki progenitorowe siatkówki wymaga zatem wykonania iniekcji w małym obszarze docelowym. Za pomocą mikromanipulatorów udało nam się skutecznie celować w ten mały obszar w zarodkach od E13,5 do E15,5 (pokazano elektroporacje E15,5 pCIC z reporterem mCherry; Rys. 4). Jeśli elektroporowane siatkówki są badane 24 godziny po transfekcji, obserwujemy, że większość komórek mCherry + znajduje się w zewnętrznej warstwie neuroblastów (onbl), gdzie znajdują się dzielące się komórki progenitorowe, a nie w warstwie komórek zwojowych siatkówki (gcl; obraz wstawkowy), gdzie lokalizują się komórki postmitotyczne.
Rysunek 1. Wprowadzenie do konfiguracji i metodologii elektroporacji in utero. (A) Kluczowe elementy zestawu chirurgicznego obejmują mikrowstrzykiwacz Eppendorf Femtojet (1), mikromanipulator Narishige z uchwytem igły (2), steromikroskop Leica (3), światłowodowy system oświetleniowy (4), system elektroporacji fali prostokątnej ECM 830 z elektrodami (5) i poduszką grzewczą (6). (A') Zwierzę jest znieczulane za pomocą parownika do znieczulenia izofluranem. (B,B') Krótko, po znieczuleniu, rogi macicy są odsłaniane, a DNA zmieszane z szybką zielenią jest wstrzykiwane do embrionalnych pęcherzyków mózgowych. Udane wstrzyknięcie jest wizualizowane poprzez śledzenie szybkiego zielonego barwnika (B'). (C,C') Po pomyślnym wstrzyknięciu DNA elektrody łopatkowe umieszcza się po obu stronach macicy, ustawiając zarodek tak, aby DNA zostało przyciągnięte w kierunku bieguna dodatniego do wybranego obszaru mózgu. (D,D') Po wstrzyknięciu wszystkich pożądanych zarodków macica jest wpychana z powrotem do jamy brzusznej (D), otrzewna jest zszywana, a skóra jest zszywana (D'). Ciężarnej samicy pozwala się następnie wyzdrowieć, a młode poddane elektroporacji są zbierane w pożądanych punktach czasowych.
Rysunek 2. Reprezentatywny przykład elektroporacji kresomózgowia grzbietowego. (A-C) Mikrofotografia przekroju koronalnego przez grzbietową kresomózgowienie E13.5 elektroporowaną w E12.5 z pCIG2. Elektroporowane komórki GFP+ są analizowane pod kątem ekspresji markerów wierzchołkowych komórek progenitorowych (Pax6+, czerwony, A), podstawnych komórek progenitorowych (Tbr2+, czerwony, B) i neuronów postmitotycznych (Tbr1+, czerwony, C). cp, płytka korowa; SVZ, strefa podkomorowa, vz; strefa komorowa.
Rysunek 3. Reprezentatywny przykład elektroporacji międzymózgowiowej. (A) Widok brzuszny mózgu E14, który został elektroporowany w E12 za pomocą pCIG2. Epifluorescencja GFP jest widoczna we wzgórzu, przedwzgórzu i podwzgórzu, co świadczy o rozprzestrzenianiu się mikrowstrzykniętego plazmidu pCIG2 w 3. komorze. (B) Mikrofotografia przekroju koronalnego przez elektroporowany mózg, pokazująca migrację komórek GFP+ ze strefy komorowej do strefy płaszcza, gdzie utworzą się jądra podwzgórza. 3V, trzecia komora; T, wzgórze; Hy, podwzgórze; mz, strefa płaszcza; Tel, kresomózgowie; PreT, przedwzgórze; vz, strefa komorowa.
Rysunek 4. Reprezentatywny przykład elektroporacji siatkówki. Przekrój koronalny przez oko E16.5 elektroporowany pCIC przy E15.5 wykazujący akumulację komórek mCherry + w zewnętrznej warstwie neuroblastów, a nie w komórkach zwojowych siatkówki Brn3b + w warstwie komórek zwojowych. Wstawka to obraz obszaru ramkowego w większym powiększeniu. GCL, warstwa komórek zwojowych siatkówki; le, soczewka; ONBL, zewnętrzna warstwa neuroblastów; re, siatkówka.