Przedstawiamy protokół analizy strukturalnej i składu naturalnego biofilmu jamy ustnej pobranego z aparatów ortodontycznych z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) oraz konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CLSM). Próbki biofilmu jamy ustnej pobrano z aparatów do rozszerzania podniebienia, zeskrobując z ich powierzchni płatki żywicy akrylowej i przekazując je do obróbki molekularnej.
Artykuł metodologiczny
Analiza biofilmu jamy ustnej w aparatach do rozszerzania podniebienia z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej i konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Konfokalna mikroskopia laserowa (CLSM) naturalnego, heterogennego biofilmu jest obecnie wspierana przez szeroki zakres technik barwienia, z których jedną jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH).1,2 Przeprowadziliśmy badanie pilotażowe, w którym próbki biofilmu jamy ustnej pobrane z aparatów ortodontycznych (rozszerzaczy podniebnych) zostały zabarwione metodą FISH, a celem była ocena trójwymiarowej organizacji naturalnego biofilmu i akumulacji płytki.3,4 FISH stwarza możliwość barwienia komórek w ich rodzinnym środowisku biofilmu przy użyciu sond znakowanych fluorescencyjnie, celujących w 16S rRNA.4-7,19 W porównaniu z alternatywnymi technikami, takimi jak znakowanie immunofluorescencyjne, jest to niedroga, precyzyjna i prosta technika znakowania służąca do badania różnych grup bakterii w mieszanych konsorcjach biofilmu.18,20 Zastosowano sondy ogólne wiążące się z Eubacteria (EUB338 + EUB338II + EUB338III; dalej EUBmix),8-10 Firmicutes (LGC354 A-C; dalej LGCmix),9,10 oraz Bacteroidetes (Bac303).11 Dodatkowo użyto specyficznych sond wiążących się z Streptococcus mutans (MUT590)12,13 i Porphyromonas gingivalis (POGI).13,14 Ekstremalna twardość zastosowanych materiałów powierzchniowych (stal nierdzewna i żywica akrylowa) zmusiła nas do znalezienia nowych sposobów przygotowania biofilmu. Ponieważ materiałów tych nie można było łatwo przeciąć w kriotomie, zbadano różne metody pobierania próbek w celu uzyskania nienaruszonego biofilmu jamy ustnej. W niniejszym komunikacie przedstawiono najbardziej praktyczne z tych podejść. Małe płatki żywicy akrylowej z biofilmem zostały zeskrobane sterylnym skalpelem, dbając o to, aby nie uszkodzić struktury biofilmu. Do pobrania biofilmu z powierzchni stalowych użyto pęsety. Po pobraniu próbki zostały utrwalone i umieszczone bezpośrednio na szkiełkach przedmiotowych powlekanych polilizyną. Metodę FISH przeprowadzono bezpośrednio na tych szkiełkach z użyciem wspomnianych wyżej sond. Różne protokoły FISH zostały połączone i zmodyfikowane w celu opracowania nowego, łatwego w obsłudze protokołu.5,10,14,15 Następnie próbki przeanalizowano za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej. Udało się zwizualizować znane konfiguracje3,4,16,17, w tym formacje w kształcie grzybów oraz skupiska bakterii kokoidnych przeplatane kanałami. Ponadto przeanalizowano skład bakteryjny tych typowych struktur biofilmu i utworzono obrazy 2D oraz 3D.
Protokół
1. Pobieranie próbek
- Usuń stałe rozszerzacze podniebienne po 4 miesiącach użytkowania w jamie ustnej. Przed ich usunięciem zastosuj system NOLA Dry Field System w celu izolacji aparatów (ryciny 1 i 2).
- Użyj wysterylizowanych szczypiec, rękawiczek i tacek, aby usunąć rozszerzacze bez wprowadzania zanieczyszczeń (ryciny 3 i 4).
- Przechowuj obiekty w fiolkach Sarstedt 120 ml w temperaturze -20°C. Przenieś je do laboratorium w lodu i poddaj obróbce w ciągu 24 godzin.
2. Fixacja biofilmu
- Zeskrobać płatki biofilmu za pomocą sterylnego skalpela lub zebrać fragmenty sterylną pęsetą.
- Dodać lodowaty 4% roztwór PFA, aż próbka zostanie całkowicie zakryta.
- Inkubować mieszaninę w temperaturze +4°C (nie zamrażać) przez okres od 3 do 12 godzin. Dłuższy czas fiksacji lub wyższa temperatura fiksacji mogą zmniejszyć przepuszczalność osłonek komórkowych komórek gram-ujemnych dla sond oligonukleotydowych.
- Usunąć roztwór PFA i przemyć lodowatym 1X PBS. Powtórzyć ten krok 2-3 razy, aby usunąć resztki PFA.
- Resuspendować próbkę w 1 obj. lodowatego 1X PBS i dodać 1 obj. lodowatego 96% (v/v) etanolu.
- Przechowywać próbkę w temperaturze -20°C. Próbki ufiksowane zgodnie z tym protokołem mogą być przechowywane od kilku miesięcy do kilku lat.
3. Odwodnienie utrwalonych próbek
- Nanieść 5-30 μl materiału próbki utrwalonej w PFA na szkiełko przedmiotowe.
- Suszyć w temperaturze 46°C przez około 15 min lub w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas. Odmrozić lizozym oraz formamid.
- Dodać 250 μl lizozymu (1mg/ml) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min, aby ułatwić penetrację sond do wnętrza komórek poprzez częściowe zniszczenie ścian komórkowych.
- Zanurzać szkiełko kolejno w etanolu o stężeniach 50%, 80% i 96% (v/v) na 3 min każde. Efekt odwadniania wynikający z serii stężeń etanolu spowoduje dezintegrację błon komórkowych.
- Suszyć szkiełka w temperaturze 46°C przez 10 min.
4. Hybrydyzacja in-situ
- Przygotować 1 ml świeżego buforu do hybrydyzacji (stężenia podano w Tabeli 1). Stężenia formamidu zastosowane w niniejszym badaniu: 10% (EUBmix), 20% (Bac303, POGI, MUT590) lub 45% (LGCmix).
- Odmrozić roztwory sond oligonukleotydowych. Odmrożone sondy należy przechowywać w lodzie i chronić przed światłem.
- Dodać 2 μl każdej sondy do 200 μl buforu do hybrydyzacji, dokładnie wymieszać i nanieść mieszaninę na odwodnioną próbkę na szkiełku przedmiotowym.
- Umieścić kawałek ręcznika papierowego w kwadratowej szalce Petriego i wlać pozostały bufor do hybrydyzacji na ręcznik.
- Natychmiast umieścić szkiełko poziomo w szalce i zamknąć naczynie. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 46°C przez 1-5 godzin (w większości przypadków wystarczy 90 min). Szalka pełni funkcję komory wilgotnościowej, zapobiegając odparowywaniu roztworu do hybrydyzacji ze szkiełka. W szczególności odparowanie formamidu może prowadzić do nieswoistego wiązania sond z komórkami niebędącymi celem.
- Przygotować 50 ml buforu do płukania (stężenia podano w Tabeli 2). Bufor do płukania należy przygotować w probówce 50 ml i podgrzać do 48°C w łaźni wodnej. Etap płukania przeprowadza się w temperaturze 48°C.
- Wyjąć szalkę ze szkiełkiem z inkubatora do hybrydyzacji. Natychmiast spłukać bufor do hybrydyzacji niewielką objętością uprzednio podgrzanego buforu do płukania, a następnie przenieść szkiełko do pozostałego buforu do płukania.
- Umieścić probówkę zawierającą bufor do płukania i szkiełko z powrotem w łaźni wodnej i inkubować w 48°C przez 10-15 min.
- Wyjąć szkiełko z probówki i zanurzyć w lodowatej ddH2O na 2-3 sekundy, aby usunąć pozostałości buforu do płukania.
- Osuszyć szkiełko na powietrzu tak szybko, jak to możliwe (zaleca się użycie sprężonego powietrza). Szybkie suszenie ograniczy dysocjację sond.
- Wysuszone szkiełka można przechowywać w ciemności w temperaturze -20°C przez kilka tygodni bez znacznej utraty sygnału fluorescencji nadanego przez sondy.
5. Mikroskopia
- Po przeprowadzeniu FISH i przemyciu, nanieś dwie krople środka zapobiegającego blaknięciu (antifadent) w pobliżu lewego i prawego końca szkiełka (przekroje mrożone należy uprzednio ogrzać do temperatury pokojowej przed tym krokiem).
- Nałóż na wierzch szkiełko nakrywkowe i poczekaj, aż antifadent rozprzestrzeni się na całym preparacie. Należy pamiętać, że nadmierna ilość antifadentu może spowodować rozmycie obrazu mikroskopowego.
- Próbki należy obserwować pod konfokalnym skaningowym mikroskopem laserowym wyposażonym w odpowiednie filtry lub lasery. W tej procedurze wykorzystano jednostkę Leica TCS (HCX PL APO/63x; NA 1.2). Dane można analizować za pomocą oprogramowania takiego jak IMARIS lub AMIRA.
- Szkiełka z naniesionym antifadentem można przechowywać w temperaturze +4°C (nie zamrażać) do 7 dni, zanim fluorescencja nadana przez sondę zacznie słabnąć. Alternatywnie, antifadent można usunąć za pomocą ddH2O, a wysuszone szkiełka przechowywać w temperaturze -20°C przez dłuższy czas.
6. Reprezentatywne wyniki:
Zeskrobanie biofilmu z utrwalonych aparatów ortodontycznych (Rycina 5) pozwala na uzyskanie odpowiednich płatków (Rycina 6), które mogą zostać poddane hybrydyzacji bezpośrednio na powlekanych szkiełkach przedmiotowych do mikroskopii. W ten sposób można zidentyfikować różne grupy bakterii orobiomu w ich naturalnym środowisku trójwymiarowym poprzez znakowanie bakteryjnego rRNA za pomocą specyficznych sond z różnymi znacznikami (Ryciny 7 i 8). Na Rycini 7 biofilm został zabarwiony EUBmix (zielony, wszystkie bakterie) oraz LGCmix (żółty, Firmicutes). Firmicutes widoczne są na zielono, ponieważ zostały zabarwione na żółto i niebiesko. Na Rycini 8 biofilm został zabarwiony EUBmix (czerwony, wszystkie bakterie), Bac303 (niebieski, Bacteroidetes) oraz POGI (żółty, Porphyromonas gingivalis). Porphyromonas gingivalis jest przedstawiona w kolorze żółtawo-białym, ponieważ wszystkie trzy sondy wiążą się z jej DNA, a nałożenie się kolorów daje biały sygnał. Można również zidentyfikować różnice morfologiczne między grupami bakterii (Ryciny 9 i 10). Duże skupiska bakterii kokoidalnych pokazano na Rycini 9, gdzie barwienie przeprowadzono z użyciem EUBmix (zielony, wszystkie bakterie). Różne kształty bakterii jamy ustnej zwizualizowano na Rycini 10, gdzie bakterie kokoidalne i nitkowate można rozróżnić dzięki barwieniu EUBmix (czerwony). Ponadto typową strukturę biofilmu przypominającą grzyba można opracować za pomocą modelowania 3D danych z CLSM (Ryciny 11 i 12) Kliknij tutaj, aby obejrzeć film z modelowania 3D.
Rycina 1. Stały ekspander podniebienny in situ.
Rysunek 2. System suchego pola Nola.
Rycina 3. Sterylne szczypce, rękawiczki i tacka.
Rycina 4. Usunięty ekspander.
Rycina 5. Zeskrobywanie biofilmu za pomocą sterylnego skalpela.
Rycina 6. Płatki żywicy bezpośrednio hybrydyzowane na powlekanych szkiełkach przedmiotowych.
Rysunek 7. Obraz CLSM: różnicowanie specyficznej grupy bakterii. Nakładka 2D danych z serii obrazów 3D CLSM. Biofilm zabarwiony EUBmix (zielony, wszystkie bakterie) i LGCmix (żółty, Firmicutes).
Rysunek 8. Obraz CLSM: różnicowanie specyficznej grupy bakteryjnej. Nakładka 2D danych ze stosu 3D CLSM. Biofilm zabarwiony EUBmix (czerwony, wszystkie bakterie), Bac303 (niebieski, Bacteroidetes) i POGI (żółty, Porphyromonas gingivalis).
Rysunek 9. Obraz CLSM: różnicowanie specyficznych morfologii. Nakładka 2D danych ze stosu 3D CLSM. Biofilm barwiony EUBmix (zielony, wszystkie bakterie). Duże skupiska bakterii kokoidalnych (strzałki).
Rycina 10. Obrazy CLSM: rozróżnienie specyficznych morfologii. Nakładka 2D danych ze stosu 3D CLSM. Biofilm barwiony EUBmix (kolor czerwony, wszystkie bakterie). Można rozróżnić bakterie kokoidalne (strzałka poniżej) oraz nitkowate (strzałka powyżej).
Rysunek 11. Struktura grzyba, widoki 3D od dołu. Stosy płatków biofilmu (zeskrobanych z powierzchni urządzenia ortodontycznego), barwione EUBmix i przetworzone w programie IMARIS (obraz CLSM).
Rysunek 12. Struktura grzyba, widok z boku 3D. Stosy płatków biofilmu (zeskrobane z powierzchni aparatu ortodontycznego) przetworzone w programie IMARIS (obraz CLSM).
| Bufor do hybrydyzacji (200 μl) | |||
| Stężenie formamidowe | 10% | 20% | 45% |
| 5 M NaCl | 36 | 36 | 36 |
| 1 M Tris-HCl | 4 | 4 | 4 |
| 2% SDS | 1 | 1 | 1 |
| FA | 20 | 40 | 90 |
| ddH2O | 138 | 118 | 68 |
| Dowolna sonda FISH | 2 | 2 | 2 |
Tabela 1. Składniki buforu do hybrydyzacji (stężenia w μl).
| Bufor piorący (50 ml) | |||
| Stężenie formamidyny | 10% | 20% | 45% |
| 5 M NaCl | 4500 | 2150 | 300 |
| 1 M Tris-HCl | 1000 | 1000 | 1000 |
| 0,5 M EDTA | 0 | 500 | 500 |
| ddH2O2O | 44 500 | 46 350 | 48 200 |
Tabela 2. Składniki buforu płuczącego (stężenia w μl).
Dyskusja
Opisany tutaj protokół stanowi wysoce efektywne podejście do barwienia biofilmów pobranych z materiałów twardych. Pobieranie próbek i hybrydyzacja są najbardziej krytycznymi etapami. Podczas pobierania należy zadbać o to, aby zebrane plastry miały odpowiednią grubość, co zapewni zachowanie nienaruszonej struktury biofilmu. Podczas hybrydyzacji niezbędne jest unikanie nadmiernych wahań temperatury, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu lub utracie wiązania fluorescencyjnie znakowanych sond. Niniejszy protokół FISH jest elegancką metodą barwienia naturalnych, heterogenicznych biofilmów bezpośrednio na szkiełkach przedmiotowych, bez zaburzania ich składu. Szkiełka mogą być natychmiast wykorzystane do mikroskopii, bez konieczności ponownego przenoszenia próbki. W ten sposób uzyskano usprawnienie w stosunku do barwienia w probówkach dzięki zastosowaniu mniejszej siły ścinającej oddziałującej na biofilm. W ten sposób można przygotować i badać plastry o grubości > 50 μm.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Hygiene Fonds Uniwersytetu Medycznego w Grazie. Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę. Zgoda instytucjonalna na protokół badania została uzyskana z Uniwersytetu Medycznego w Grazie.
Bibliografia
- Sunde, P. T. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth. Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).
- Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi. Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).
- Kolenbrander, P. E. Communication among oral bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).
- Zijnge, V. Oral biofilm architecture on natural teeth. PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).
- Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque. J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).
- Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. Bacterial interactions in dental biofilm development. J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).
- Jung, D. J. Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ. J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).
- Al-Ahmad, A. Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization. J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber. Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).
- Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007. Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).
- Diaz, P. I. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).
- Kolenbrander, P. E. Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontology. 42, 47-79 (2000).
- Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).
- Chalmers, N. I. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Wecke, J. A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets. FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).
- Moter, A., Gobel, U. B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).
Przedruki i uprawnienia
