Niniejsza metoda izolacji funkcjonalnych komórek odpornościowych z serca stanowi alternatywę dla konwencjonalnych metod trawienia kolagenazą, która powoduje niepożądaną aktywację komórek odpornościowych, prowadząc do obniżenia ich reaktywności. Nasza metoda izolacji pozwala na uzyskanie funkcjonalnych komórek odpornościowych serca dzięki uniknięciu problemów związanych z trawieniem enzymatycznym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja funkcjonalnych komórek odpornościowych serca
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki odpornościowe serca budzą coraz większe zainteresowanie ze względu na rolę, jaką odgrywają w patologicznym przebudowie w wielu chorobach serca.1-5 Komórki te, do których należą komórki tuczne, limfocyty T oraz makrofagi, gromadzą i uwalniają szereg biologicznie czynnych mediatorów, w tym cytokiny i proteazy, takie jak tryptaza.6-8 Wykazano, że mediatory te są kluczowymi czynnikami w metabolizmie macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez aktywację metaloproteinaz macierzy lub wywoływanie akumulacji kolagenu poprzez modulowanie funkcji fibroblastów serca.9-11 Jednak dostępne techniki izolacji komórek odpornościowych serca są problematyczne, ponieważ wykorzystują bakteryjną kolagenazę do trawienia tkanki mięśnia sercowego. Technika ta powoduje aktywację komórek odpornościowych, a tym samym utratę ich funkcji. Na przykład komórki tuczne serca stają się znacznie mniej reaktywne na związki wywołujące degranulację.12 W związku z tym opracowaliśmy technikę umożliwiającą izolację funkcjonalnych komórek odpornościowych serca, co pozwoli na lepsze zrozumienie roli tych komórek w chorobach serca.13, 14
Ta metoda wymaga znajomości anatomicznej lokalizacji wyrostka xyfoidego, pachy i więzadła sierpowatego u szczura oraz osierdzia serca. Punkty orientacyjne te są istotne dla zwiększenia skuteczności procedury i zapewnienia wyższej wydajności pozyskiwania immunocytów sercowych. Izolowane w ten sposób immunocyty sercowe mogą następnie zostać wykorzystane do charakteryzacji funkcjonalności, fenotypu i stopnia dojrzałości, a także w eksperymentach z kokulturą innych komórek serca w celu lepszego zrozumienia zachodzących między nimi oddziaływań.
Protokół
1. Przygotowanie zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS)
- Zautoklawować szklany zlew o pojemności 1 L, cylinder miarowy 1000 mL oraz mieszadło magnetyczne.
- Rozpuścić proszek HBSS w zautoklawowanym szklanym zlewie o pojemności 1 L, dolewając wodę dwukrotnie destylowaną do poziomu 900 mL.
- Zmieszać roztwór HBSS z 3,4 g soli Hepes Na+ i dostosować pH do wartości w zakresie 7,35-7,41, używając stężonego HCL lub NaOH.
- Po osiągnięciu i ustabilizowaniu pożądanej wartości pH, dodać do roztworu w temperaturze pokojowej 5 g albuminy surowicy bydlęcej i mieszać do całkowitego rozpuszczenia albuminy.
- Dodać do roztworu 10 mL antybiotyku i antymykotyku, a następnie uzupełnić wodą dwukrotnie destylowaną do całkowitej objętości 1000 mL.
- Dokładnie wymieszać roztwór.
- Przefiltrować roztwór HBSS i rozdzielić go do probówek Falcon 50 mL do późniejszego użycia. Dodatkowe probówki można zamrozić i wykorzystać w późniejszym terminie.
2. Przygotowanie zwierzęcia – wprowadzenie rurki intubacyjnej
- Przygotuj tacę z niezbędnymi instrumentami i materiałami do wprowadzenia rurki intubacyjnej (np. pęsetą, nożyczkami, rurką intubacyjną, czarną plecioną nicią chirurgiczną 3-0, respiratorem dla małych zwierząt itp.).
- Po całkowitym znieczuleniu szczura mieszanką ketaminy i ksylazyny w stosunku 2:1 (ketamina do ksylazyny), wygol brzuch, klatkę piersiową i gardło zwierzęcia. Aby upewnić się, że osiągnięto głęboką narkozę, uciśnij palec szczura i sprawdź odruch cofania kończyny. Przed wykonaniem wszelkich nacięć upewnij się, że szczur jest głęboko znieczulony.
- Umieść szczura z uniesioną głową na desce operacyjnej nachylonej pod kątem 30°.
- Wykonaj nacięcie skóry od środka brzucha aż do miejsca poniżej dolnej żuchwy. Odsuń mięśnie przedniego trójkąta szyi, aby odsłonić tchawicę.
- Umieść czarną plecioną nić chirurgiczną 3-0 pod tchawicą.
- Wykonaj nacięcie w tchawicy pomiędzy pierścieniami chrzęstnymi i wprowadź rurkę intubacyjną. Mocno zawiąż nić, aby przymocować rurkę do tchawicy.
- Podłącz rurkę intubacyjną do respiratora dla małych zwierząt.
3. Przygotowanie aparatury do izolacji komórek odpornościowych
- Przygotuj tackę z instrumentami do procedury izolacji komórek odpornościowych (tj. pęsetę, nożyczki, HBSS, przyciętą miękką kaniulę wewnątrznaczyniową Baxter 24G typu quick-cath nad igłą wykonaną z Teflonu)
- Przygotuj dwie strzykawki 10cc; jedną strzykawkę napełnij HBSS w celu wprowadzenia buforu do worka osierdziowego, a drugą zachowaj do aspiracji HBSS zawierającego komórki.
3.2.1. W celu przeprowadzenia izolacji skróć końcówkę Teflonową kaniuli wewnątrznaczyniowej Baxter 24G typu quick-cath nad igłą (1.6 cm) o 1/2 do 3/4 jej pierwotnej długości. - Umieść wszystkie strzykawki, bufory oraz pustą probówkę Falcon 15 mL (do przelania wyekstrahowanego płynu po zakończeniu procedury) na lodzie.
4. Izolacja komórek odpornościowych
- Wykonaj cięcie pośrodkowe w ścianie brzusznej (wzdłuż linea alba) aż do wyrostka mieczykowatego.
- Zaczynając nieco bocznie od wyrostka mieczykowatego, wykonaj obustronne cięcia przez klatkę piersiową, prowadząc je pod kątem w stronę pachwiny. Należy uważać, aby nie przebić płuc, serca ani osierdzia.
- Po zakończeniu cięć po obu stronach mostka oddziel przeponę od dolnych żeber, tnąc od strony bocznej do przyśrodkowej.
Uwaga: Należy stale monitorować miejsce połączenia osierdzia z przeponą i mostkiem, aby uniknąć uszkodzeń. Użyj więzadła sierpowatego jako punktu orientacyjnego, aby zlokalizować miejsce przyczepu osierdzia po przeciwnej stronie przepony. Ponadto, w przypadku przecięcia osierdzia, tracona jest możliwość izolacji komórek. - Delikatnie unieś jedną stronę klatki piersiowej, aby odsłonić jamę klatki piersiowej i serce (nadal zamknięte w osierdziu).
- Używając strzykawki wypełnionej HBSS, znajdź punkt w worku osierdziowym w połowie drogi między mostkiem a sercem (najlepiej bardziej rostralnie niż kaudalnie) i wprowadź teflonową końcówkę skróconego szybkowprowadnika (quick-cath) przez obie warstwy osierdzia.
- Po umieszczeniu cewnika delikatnie wypełnij przestrzeń osierdziową od 2 do 3 ml buforu HBBS. Prawidłowe umiejscowienie cewnika zostanie natychmiast zasygnalizowane przez rozszerzenie przestrzeni osierdziowej. Jeśli nie zaobserwowano napełniania, wycofaj i ponownie ustaw szybkowprowadnik.
- Gdy worek osierdziowy zostanie wypełniony, weź drugą strzykawkę 10 cc, wprowadź końcówkę ponownie do osierdzia i zacznij aspirować bufor. Można użyć tego samego otworu wejściowego lub utworzyć nowy. Upewnij się, że końcówka nie znajdzie się zbyt blisko ścian worka osierdziowego podczas zasysania, szczególnie po dolnej stronie serca. Mogłoby to doprowadzić do przebicia worka osierdziowego i utraty komórek.
- Podczas aspiracji buforu końcówką cewnika można poruszać wewnątrz worka osierdziowego, aby zebrać jak największą ilość buforu.
Uwaga: Jeśli podczas tej czynności lekko rozedrzycie osierdzie i powiększycie otwór na górnej części serca w stosunku do pierwotnego, nie należy wpadać w panikę. Dopóki osierdzie nadal otacza wystarczającą część serca, można przeprowadzić kolejne płukanie serca, choć z użyciem mniejszej ilości buforu. Aby zebrać optymalną liczbę komórek, konieczne jest wykonanie od trzech do czterech dodatkowych płukań.
- Przenieś wyekstrahowany bufor do probówek typu Falcon umieszczonych w lodzie.
- Usuń serce, płuca i/lub każdą inną tkankę, jeśli jest ona potrzebna do dalszych badań. Po pobraniu komórek odpornościowych i innych tkanek szczura należy szybko i w sposób humanitarny poddać eutanazji.
- Odwiruj pobrane próbki komórek odpornościowych przez 10 min przy 200g w temperaturze 4°C. Probówki nieużywane należy zawsze przechowywać w lodzie.
- Odlej supernatant i resuspendu pellet w 1 mL buforu Hyclone lub HBSS.
Uwaga: Ważne jest, aby policzyć liczbę komórek odpornościowych uzyskanych z każdego serca po procedurze izolacji komórek odpornościowych.
5. Reprezentatywne wyniki:
Przykład izolowanych mastocytów sercowych otrzymanych za pomocą tej techniki i barwionych błękitem toluidynowym oraz safraniną O/błękitem alcianem przedstawiono odpowiednio na rycinach 2A i 2B. Jak widać na Rycini 3, mastocyty sercowe zachowały zdolność do uwalniania histaminy po traktowaniu znanymi aktywatorami, takimi jak związek 48/80 i substancja P, zgodnie z opisem w pracy Morgan i wsp.9Reprezentatywne wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej komórek CD4+ i komórek CD8+ przedstawiono odpowiednio na rycinach 4 i 5. Limfocyty T zostają następnie zidentyfikowane i poddane fenotypowaniu jako populacja komórek przy użyciu tej techniki.
Rysunek 1. Schemat procedury izolacji immunologicznych komórek serca.
Rysunek 2. Reprezentatywne obrazy histologiczne komórek tucznych serca zabarwione następująco: (A) błękitem toluidyny oraz (B) safraniną O/błękitem alkianowym.
Rycina 3. Badanie funkcjonalne mastocytów serca wyizolowanych z obszaru epikardialnego mięśnia sercowego i stymulowanych związkiem 48/80 (10μg/mL) oraz substancją P (10μM).
Rysunek 4. Reprezentatywne wykresy rozrzutu z cytometrii przepływowej dla wyizolowanych komórek CD4+ znakowanych Substancją P (rozcieńczenie 1:100).
Rycina 5. Reprezentatywna cytometria przepływowa izolowanych komórek CD8+ znakowanych substancją P (rozcieńczenie 1:100).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ta metoda izolacji komórek odpornościowych serca umożliwia analizę ich funkcji, fenotypu i stopnia dojrzałości bez niepożądanej aktywacji, która zazwyczaj występuje podczas tradycyjnej techniki izolacji z użyciem trawienia enzymatycznego. Średnia całkowita liczba komórek uzyskanych tą techniką wynosi około 400 000 na serce szczura, a barwienie różnicujące i analiza cytometrii przepływowej tych komórek przy zastosowaniu tej techniki wskazują na mieszaną populację limfocytów T (~70%), makrofagów (~12%) i komórek tucznych (...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez stypendium doktoranckie UNCF-Merck Graduate Science Research Dissertation Fellowship (J.L.M.) oraz granty National Heart, Lung, and Blood Institute RO1-HL-62228 (J.S.J.) i RO1-HL-073990 (J.S.J.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zrównoważony roztwór soli Hanksa’ | Sigma-Aldrich | H4891 | Jedna butelka pozwala na przygotowanie 1 L zrównoważonego roztworu soli Hanksa’ . Przygotuj roztwór soli Hanksa’ zgodnie z procedurą. |
| Antybiotyk-antymykotyk | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Albuminy surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| Butelka z filtrem Nalogene 250 mL | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 157-0020 | |
| 12 N HCl | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | Aby uzyskać 6 N, dodaj równe objętości HCl do wody dejonizowanej. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | Aby uzyskać 5 N, dodaj równe objętości NaOH do wody dejonizowanej. |
| Woda podwójnie destylowana | |||
| Tabela specjalistycznego sprzętu: | |||
| Pleciona jedwabna nić chirurgiczna 3-0 | Ethicon Inc. | SA64H | |
| Wentylator dla małych zwierząt | CWE, Inc. | SAR-830 | Ustaw częstotliwość oddychania na 40,5 oddechów na min. |
| Igła skośna 18 G | BD Biosciences | 305199 | Przytnij igłę o 1/2 do 3/4 jej pierwotnej długości, aby użyć jej jako rurki tchawiczej. |
| Końcówka teflonowa (bez igły) cewnika Baxter quick-cath 24 G | Baxter Internationl Inc. | 2N111 | Skróć długość końcówki teflonowej o 1/2 do 3/4. |
| Strzykawka 10 cc | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| Probówki Falcon 15 mL | BD Biosciences | 352097 | |
| Chłodzona wirówka Sorvall RT6000B | Fisher Scientific | 75-004-377 | Należy pamiętać o wcześniejszym schłodzeniu i utrzymywaniu temperatury 4°C. |
| Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S300030.02 | |
| Hemocytometr | Hausser Scientific | HS-LB-1483 |
Bibliografia
- Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).
- Brower, G. L., Janicki, J. S. Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats. Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).
- Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).
- Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).
- Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat. Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).
- Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure. Cytokine. 34, 284-290 (2006).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis. Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).
- Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure. Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).
- Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats. Circulation. 97, 1382-1391 (1998).
- Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion. Circulation. 98, 699-710 (1998).
- Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).
- Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells. Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).
- Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart. Hypertension. 55, 270-276 (2010).
- Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. A novel technique for isolating functional mast cells from the heart. Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
