Przygotowanie neuronów korowych szczura z 18. dnia embrionalnego (E18) do kompartymentacji w urządzeniu mikroprzepływowym

Podsumowanie

W tym filmie demonstrujemy przygotowanie neuronów korowych szczura z 18. dnia embrionalnego (E18).

Streszczenie

W tym filmie demonstrujemy przygotowanie neuronów korowych szczura z zarodkowego 18. dnia (E18). Neurony korowe szczura E18 pozyskuje się z wcześniej wypreparowanej i przygotowanej kory płodu szczura E18. Po wypreparowaniu kora E18 jest natychmiast dysocjowana do pojedynczych neuronów. Możliwe jest przechowywanie kory E18 w buforze Hibernate E zawierającym B27 w temperaturze 4°C do tygodnia przed przeprowadzeniem dysocjacji. Powiąże się to jednak ze spadkiem żywotności komórek. Zazwyczaj korzystamy ze świeżej kory E18. Jest ona transportowana do laboratorium w lodowatym buforze do dysekcji wolnym od wapnia i magnezu (CMFM). Po dostarczeniu do kory dodaje się trypsynę do stężenia końcowego 0,125%. Następnie korę inkubuje się w temperaturze 37°C przez 8 minut. Aby zatrzymać reakcję, do kory dodaje się DMEM zawierający 10% FBS. Następnie korę wiruje się przy 2500 rpm przez 2 minuty. Nadpływ zostaje usunięty, a do kory dodaje się 2 ml pożywki Neural Basal Media (NBM) zawierającej 2% B27 (obj/obj) i 0,25% Glutamax (obj/obj), po czym materiał jest resuspendowany poprzez pipetowanie w górę i w dół. Następnie korę tryturuje się za pomocą wcześniej wypalanych szklanych pipet o sukcesywnie mniejszej średnicy otworu. Po tryturacji korę ponownie wiruje się przy 2500 rpm przez 2 minuty. Nadpływ zostaje usunięty, a osad z kory resuspendowany w 2 ml NBM zawierającej B27 i Glutamax. Zawiesinę komórkową przepuszcza się następnie przez nylonowy sitko komórkowe o rozmiarze oczek 40 um. Następnie wykonuje się zliczenie komórek. Neurony są teraz gotowe do wprowadzenia do mikrofluidycznego urządzenia neuronowego.

Protokół

Przygotowanie neuronów korowych płodowych szczurów z 18. dnia embrionalnego (E18) do kompartymentalizacji

Przed rozpoczęciem pracy należy podgrzać wszystkie niezbędne pożywki i odczynniki do 37°C.

Ważne jest również, aby sterylizować wszystkie przedmioty używane do przygotowania komórek (np. gumowe gruszki, statywy na probówki, butelki z pożywką itp.) oraz wszystko to, co umieszcza się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przecierając je 70% etanolem.

1. Umieścić dwa fragmenty kory płodowej szczura w stadium E18 (jeden mózg, wcześniej wypreparowany) w probówce 15 ml zawierającej 1 ml schłodzonego do temperatury 4°C buforu do dyssekcji wolnego od wapnia i magnezu.
2. Dodać 1 ml 0,25% Trypsyny-EDTA do kory w buforze do dyssekcji, tak aby końcowa objętość wyniosła 2 ml, a końcowe stężenie trypsyny 0,125%.
3. Umieścić probówkę 15 ml w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na 8 minut.
4. W tym czasie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu zachowania sterylności, wypalić końce 3 szklanych pipet Pasteura, tworząc sukcesywnie mniejsze otwory.
5. Po 8-minutowej inkubacji kory dodać do niej 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS, aby zatrzymać reakcję trypsyny.
6. Wirować probówkę 15 ml zawierającą korę i DMEM/10% FBS przy 2500 rpm przez 2 minuty.
7. W komorze z laminarnym przepływem powietrza usunąć nadCiecz znad kory za pomocą szklanej pipety Pasteura z podłączonym odsysaczem próżniowym. Należy uważać, aby nie naruszyć ani nie przemieścić osadu.
8. Dodać 1 ml NMB do osadu z kory i delikatnie pipetować w górę i w dół. Bardzo ważne jest unikanie tworzenia pęcherzyków powietrza podczas pipetowania, ponieważ mogą one uszkodzić komórki poprzez  utlenianie.
9. Użyć wypalonej pipety Pasteura z najszerszym otworem do tryturacji kory, mocując na końcu sterylną gruszkę gumową i pipetując w górę i w dół 5 razy, ponownie uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Kontynuować ten proces  z pozostałymi 2 szklanymi pipetami, z których każda ma mniejszą średnicę otworu.
10. Po tryturacji ponownie odwirować  komórki przy 2500 rpm przez 2 minuty.
11. Po wirowaniu ponownie usunąć nadciecz i resuspendować osad komórkowy w 2 ml NBM.
12. Przefiltrować resuspendowany roztwór komórkowy przez sitko komórkowe o oczkach 45 um.
13. Przebarwić komórki błękitem trypanowym, policzyć je i załadować do urządzeń. Zazwyczaj ładujemy 20 ul komórek na urządzenie.

Uwaga: końcowe stężenie komórek wynosi zazwyczaj od 2,5 million cells/ml do 8 million cells/ml

Nakładanie komórek

Po policzeniu komórek należy wprowadzić je do urządzenia:

1. Przenieś wcześniej przygotowane urządzenia zawierające NBM do komory bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność.
2. Usuń nadmiar pożywki z dołków za pomocą ssania próżniowego. Należy jednak uważać, aby nie usunąć całej pożywki –  w głównym kanale musi pozostać pewna ilość pożywki.
3. Nanieś 20 µl komórek do górnego lewego zbiornika urządzenia (w razie potrzeby sprawdź schemat). Komórki wpłyną do urządzenia i przywierną do powierzchni potraktowanej PLL.
4. Po załadowaniu umieść urządzenia z komórkami z powrotem w inkubatorze na 10 minut, aby umożliwić komórkom przytwierdzenie się.
5. Po 10 minutach napełnij zbiorniki pożywką i umieść urządzenia z powrotem w inkubatorze.

Dyskusja

Gęstość komórek można różnicować w zależności od zastosowania. Jednak wysiewanie pierwotnych neuronów przy zbyt niskiej gęstości zazwyczaj prowadzi do śmierci komórek. W zależności od inkubatora i poziomu wilgotności, pożywkę w urządzeniach może być konieczne wymieniać co 2 do 3 dni. Podczas wymiany pożywki, po usunięciu jej z rezerwuarów, ważne jest, aby nigdy nie usuwać pożywki z kanałów głównych. Ponadto dobrą praktyką jest wprowadzenie świeżej pożywki do górnych studni i dopuszczenie do przepływu części świeżej pożywki przez urządzenie do kanałów głównych przed całkowitym napełnieniem wszystkich rezerwuarów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NBM	pożywka	Invitrogen	21103-049	Pożywka Neural Basal Media jest pozyskiwana od firmy Invitrogen z linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.
embriony szczura E18	Zwierzę			Pozyskiwane z ciężarnych szczurów Sprague Dawley. Ciężarna szczurica jest uśmiercana, a płody szczurze E18 są preparowane w celu uzyskania kory mózgu płodów szczurzych E18.
bufor do preparowania CMFM HBSS	bufor			lodowaty bufor do preparowania na bazie HBSS, wolny od wapnia i magnezu.
probówka 15 ml	Narzędzie	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Dostępna w katalogu Fisher Scientific, numer 14-959-70C
0.25% Trypsyna-EDTA	Odczynnik	Invitrogen
kąpiel wodna 37˚C
pipety Pasteura		Fisher Scientific		szklane
DMEM	pożywka	Invitrogen
FBS	Odczynnik	Invitrogen		surowica, stosowana w stężeniu 10% w DMEM
wirówka				ustawiona na 2500 rpm
Błękit Trypanu		Invitrogen		do zliczania żywych/martwych komórek
sito do komórek BD Falcon 40 um	Narzędzie	BD Biosciences	Falcon cat# 352340	Dostępne przez Fisher Scientific. Katalog Fisher# 08-771-1
B27	Odczynnik	Invitrogen	17504-044	B27 jest zastrzeżonym suplementem dostępnym od firmy Invitrogen z linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.
Glutamax	Odczynnik	Invitrogen	35050-061	Glutamax jest dostępny od firmy Invitrogen z linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.