Przygotowanie neuronów korowych szczura E18 do podziału na przedziały w urządzeniu mikroprzepływowym

Summary

W tym filmie pokazujemy przygotowanie neuronów kory mózgowej E18.

Abstract

W tym filmie pokazujemy przygotowanie neuronów korowych szczurów E18. Neurony korowe szczura E18 są uzyskiwane z kory płodu szczura E18, uprzednio wypreparowanej i przygotowanej. Kora E18 po rozebraniu jest natychmiast dysocjowana na poszczególne neurony. Możliwe jest przechowywanie kory E18 w hibernacyjnym buforze E zawierającym B27 w temperaturze 4°C przez okres do tygodnia przed przeprowadzeniem dysocjacji. Nastąpi jednak spadek żywotności komórek. Zazwyczaj pozyskujemy nasz E18 Cortex świeży. Jest transportowany do laboratorium w lodowatym buforze preparacyjnym bez wapnia i magnezu (CMFM). Po przybyciu trypsyna jest dodawana do kory mózgowej do końcowego stężenia 0,125%. Kora jest następnie inkubowana w temperaturze 37°C przez 8 minut. DMEM zawierający 10% FBS jest dodawany do kory mózgowej w celu zatrzymania reakcji. Kora jest następnie odwirowywana z prędkością 2500 obr./min przez 2 minuty. Supernatant jest usuwany i 2 ml neuronalnych pożywek podstawowych (NBM) zawierających 2% witaminy B27 (obj./obj.) i 0,25% glutamaxu (obj./obj.) dodaje się do kory mózgowej, która jest następnie ponownie zawieszana przez pipetowanie w górę iw dół. Następnie kora jest rozcierana za pomocą wcześniej wypolerowanych na ogniowo szklanych pipet, z których każda ma kolejny mniejszy otwór. Po roztarciu kora jest ponownie odwirowywana z prędkością 2500 obr./min przez 2 minuty. Supernatant jest następnie usuwany, a osad kory mózgowej ponownie zawieszany w 2 ml NBM zawierającym B27 i Glutamax. Zawiesina komórek jest następnie przepuszczana przez nylonowe sitko komórkowe o średnicy 40 um. Następnie komórki są zliczane. Neurony są teraz gotowe do załadowania do urządzenia mikroprzepływowego neuronu.

Protocol

Przygotowanie neuronów korowych płodu E18 u szczura do podziału na przedziały

Przed rozpoczęciem ważne jest, aby podgrzać wszystkie niezbędne media i odczynniki do temperatury 37°C.

Ważne jest również, aby sterylizować wszystko, co jest używane do przygotowania komórek (np. gumowe żarówki, stojaki na tuby, butelki z mediami, itp.), oraz to, co jest umieszczone w kapturze, poprzez przetarcie 70% etanolem.

1. Umieść dwa kawałki kory mózgowej płodu szczura E18 (jeden mózg, wcześniej wypreparowany) w 15 ml probówce zawierającej 1 ml lodowatego buforu do rozwarstwiania bez wapnia i magnezu.
2. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kory w buforze rozwarstwiającym, doprowadzając końcową objętość do 2 ml i końcowe stężenie trypsyny do 0,125%.
3. Umieść probówkę o pojemności 15 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 8 minut.
4. W tym czasie wypoleruj ogniowo 3 szklane pipety Pasteura, tworząc kolejno mniejsze otwory, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby pomóc w utrzymaniu sterylności.
5. Po 8 minutowej inkubacji kory dodaj 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS do kory, aby pomóc zatrzymać reakcję trypsyny.
6. Odwirować probówkę o pojemności 15 ml zawierającą korę i DMEM/10% FBS przy 2500 obr./min przez 2 minuty.
7. W komorze bezpieczeństwa biologicznego usunąć supernatant z kory za pomocą szklanej pipety Pasteura z dołączonym odsysaczem próżniowym. Uważaj, aby nie przeszkadzać ani nie usuwać granulek.
8. Dodać 1 ml NMB do osadu kory mózgowej i delikatnie pipetować w górę iw dół. Bardzo ważne jest, aby unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas w górę iw dół, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą uszkodzić komórki przez utlenianie.
9. Użyj wypolerowanej na gorąco pipety Pasteura z najszerszym otworem, aby rozcierać korę, mocując sterylną gumową bańkę do końca i pipetując w górę iw dół 5 razy, ponownie uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Kontynuuj ten proces z pozostałymi 2 szklanymi pipetami, każda ze zmniejszonym rozmiarem otworu.
10. Po roztarciu ponownie odwirować komórki z prędkością 2500 obr./min przez 2 minuty.
11. Po odwirowaniu ponownie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml NBM.
12. Przefiltrować zawieszony roztwór komórkowy przez sitko o pojemności 45 μm.
13. Zabarwić komórki błękitem trypanowym, policzyć i załadować do urządzeń. Zazwyczaj ładujemy 20 ul ogniw na urządzenie.

Uwaga: końcowe stężenie komórek wynosi zazwyczaj od 2,5 miliona komórek/ml do 8 milionów komórek/ml

Wczytywanie komórek

Po zliczeniu komórek, nadszedł czas, aby załadować komórki do urządzenia:

1. Przygotowane wcześniej urządzenia zawierające NBM należy przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego w celu zachowania sterylności.
2. Usuń nadmiar mediów ze studzienek przez odsysanie próżniowe. Należy jednak uważać, aby nie usunąć wszystkich nośników — w głównym kanale muszą znajdować się jakieś multimedia.
3. Nałóż 20 ul ogniw na lewy górny zbiornik urządzenia (w razie potrzeby patrz schemat). Komórki wpływają do urządzenia i przyczepiają się do powierzchni poddanej obróbce PLL.
4. Po załadowaniu umieść urządzenia zawierające komórki z powrotem w inkubatorze na 10 minut, aby umożliwić przyczepienie się komórek.
5. Po 10 minutach napełnij zbiorniki pożywką i umieść urządzenia z powrotem w inkubatorze.

Discussion

Gęstość komórek może się zmieniać w zależności od zastosowania. Jednak wysiewanie pierwotnych neuronów o zbyt niskiej gęstości zwykle prowadzi do śmierci komórki. W zależności od inkubatora i poziomu wilgotności może być konieczna wymiana pożywek w urządzeniach co 2 do 3 dni. Podczas wymiany mediów ważne jest, aby po wyjęciu mediów ze zbiorników nigdy nie wyjmować mediów z głównych kanałów. Ponadto dobrą praktyką jest umieszczanie świeżych mediów w górnych studzienkach i pozwalanie, aby część świeżych mediów przepływała przez urządzenie i do głównych kanałów przed napełnieniem wszystkich zbiorników.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pożywka	NBM	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media jest otrzymywana przez Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.
E18 Zarodki szczurów	Zwierzę			Uzyskiwane z ciężarnych szczurów Sprague Dawley. Ciężarna szczur jest uśmiercana, a płodowe młode szczurów E18 są preparowane w celu uzyskania kory płodu E18 szczura.
CMFM bufor preparacyjny HBSS	lodowaty Bezwapniowy Bez magnezu Bufor rozwarstwiający na bazie HBSS.
15 ml	Probówka	BD Biosciences	Falcon nr 352097	Dostępne w katalogu Fisher Scientific numer 14-959-70C
0,25% Odczynnik Trypsyna-EDTA		Invitrogen
37˚ C kąpiel
Pipety		Pasteura Fisher Scientific		szkło
DMEM	podłoże	Invitrogen
FBS	Odczynnik	Invitrogen		surowica, stosowana w stężeniu 10% w
wirówce DMEM ustawionej				na 2500 obr./min
Trypan Blue		Invitrogen		do liczenia żywych/martwych komórek
Filtr siatkowy BD Falcon Cell 40 um	Narzędzie	BD Biosciences	Falcon cat# 352340	Dostępne za pośrednictwem Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
Odczynnik B27		Invitrogen	17504-044	B27 to zastrzeżony suplement dostępny za pośrednictwem Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.
Odczynnik Glutamax		Invitrogen	35050-061	Glutamax jest dostępny w Invitrogen w ramach linii odczynników do hodowli komórkowych Gibco.