Boczna perkusja płynowa: model urazowego uszkodzenia mózgu u myszy

Podsumowanie

Przedstawiono metodę bocznego uderzenia płynnego (LFP), uznany model urazowego uszkodzenia mózgu u myszy. LFP spełnia trzy główne kryteria dla modeli zwierzęcych: poprawność, niezawodność i istotność kliniczną. Opisano procedurę składającą się z chirurgicznej kraniotomii, zamocowania adaptera oraz następującego po nich wywołania urazu, co prowadzi do powstania uszkodzeń ogniskowych i rozlanych.

Streszczenie

Badania nad urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI) zyskały nowy impet dzięki rosnącej świadomości na temat urazów głowy, które prowadzą do zachorowalności i śmiertelności. W zależności od charakteru pierwotnego uszkodzenia po TBI powstają złożone i niejednorodne następstwa wtórne, po których następują procesy regeneracyjne ^1,2. Pierwotne uszkodzenie może być wywołane bezpośrednim stłuczeniem mózgu w wyniku złamania czaszki lub przez ścinanie i rozciąganie tkanek powodujące przemieszczenie mózgu w wyniku ruchu ^3,4. Powstające w ten sposób krwiaki i rozdarcia wywołują odpowiedź naczyniową ^3,5, a uszkodzenia morfologiczne i funkcjonalne istoty białej prowadzą do rozlanego uszkodzenia aksonalnego ^6-8. Dodatkowe zmiany wtórne powszechnie obserwowane w mózgu to obrzęk i zwiększone ciśnienie wewnątrzczaszkowe ⁹. Po TBI występują mikroskopowe zmiany w szlakach biochemicznych i fizjologicznych obejmujące uwalnianie ekscytotoksycznych neuroprzekaźników, mediatorów odpornościowych oraz rodników tlenowych ^10-12, co w konsekwencji prowadzi do długotrwałych niepełnosprawności neurologicznych ^13,14. Dlatego wybór odpowiednich modeli zwierzęcych TBI, które wykazują podobne zdarzenia komórkowe i molekularne jak TBI u ludzi i gryzoni, jest kluczowy dla badania mechanizmów leżących u podstaw uszkodzenia i naprawy.

Opracowano różne modele eksperymentalne TBI w celu odtworzenia aspektów TBI obserwowanych u ludzi, z których trzy konkretne modele są powszechnie stosowane u gryzoni: model perkusji cieczowej, modelu uderzenia korowego oraz modelu spadającego ciężaru/przyspieszenia uderzenia ¹. Urządzenie do perkusji cieczowej powoduje uraz poprzez kraniektomię, przykładając krótki impuls ciśnienia cieczy do nienaruszonej opony twardej. Impuls ten jest generowany przez wahadło uderzające w tłok zbiornika z cieczą. Perkusja powoduje krótkotrwałe przemieszczenie i odkształcenie tkanki nerwowej ^1,15. Z kolei uraz w modelu uderzenia korowego dostarcza energię mechaniczną do nienaruszonej opony twardej za pomocą sztywnego uderzacza pod ciśnieniem pneumatycznym ^16,17. Model spadającego ciężaru/uderzenia charakteryzuje się upadkiem pręta o określonej masie na zamkniętą czaszkę ¹⁸. Wśród modeli TBI, LFP jest najlepiej ugruntowanym i najczęściej stosowanym modelem do oceny mieszanego ogniskowego i rozlanego uszkodzenia mózgu ¹⁹. Jest on powtarzalny i zestandaryzowany, co pozwala na manipulację parametrami urazu. LFP odtwarza urazy obserwowane u ludzi, co czyni go istotnym klinicznie i pozwala na badanie nowych terapii w celu ich implementacji klinicznej ²⁰.

Opisujemy szczegółowy protokół wykonania procedury LFP u myszy. Wywołane uszkodzenie ma stopień od lekkiego do umiarkowanego, przy czym najbardziej podatne na uszkodzenia są obszary mózgu, takie jak kora, hipokamp i ciało modzelowate. Po przeprowadzeniu LFP badane są zadania związane z uczeniem się motorycznym oraz hipokampalnym.

Protokół

1. Kraniektomia

1. Przygotowuje się sterylny obszar operacyjny, w tym instrument do wyrównywania stereotaktycznego (Kopf Instruments) dla myszy z uchwytem głowy do gazowej anestezji myszy (Kopf Instruments) podłączonym do aparatu do znieczulania z przepływem O₂ (Parkland Scientific), aby umożliwić ciągłą inhalację izofluranu podczas operacji. Pod myszą podczas zabiegu umieszcza się matę grzewczą utrzymywaną w temperaturze 37°C. Wymagany jest mikroskop chirurgiczny oraz źródło światła. Eksperymentator powinien nosić fartuch laboratoryjny, maskę chirurgiczną, ochraniacze na stopy, rękawiczki i nakrycie głowy. Wszystkie narzędzia i materiały mające kontakt z obszarem operacyjnym muszą zostać wysterylizowane.
2. Piastę urazową, składającą się z żeńskiego końca złącza Luer-lok, tworzy się poprzez odcięcie metalnego końca igły 20 g 1 ½" (Becton Dickinson) za pomocą żyletki. Piasta powinna być odcięta pod lekkim kątem i mieć otwór o średnicy wewnętrznej około 3 mm. Trepan (patrz krok 1.10) może być użyty do pomiaru i wykonania piasty urazowej o właściwej średnicy. Na każde zwierzę wymagana jest jedna piasta. Piasta zostanie przymocowana do czaszki i podłączona do urządzenia LFP w celu dostarczenia impulsu ciśnienia.
3. Lity sznur nylonowy (średnica 1,7 mm, np. żyłka do podkaszarki) jest cięty na dyski o grubości ~1 mm za pomocą żyletki. Ponownie, na każde zwierzę wymagany jest jeden dysk. Jest on używany do stabilizacji trepana podczas wykonywania kraniektomii (patrz krok 1.10).
4. Myszami mogą być zwierzęta dowolnej szczepu i w dowolnym wieku (używamy głównie szczepu C57BL/6 w wieku 1–9 miesięcy). Myszy waży się i znieczula w małej komorze indukcyjnej (wcześniej wypełnionej 4–5% izofluranem w 100% O₂) przez co najmniej 1 minutę. W celu przeciwbólowej profilaktyki podaje się dootrzewnowo zastrzyk buprenorfiny (0,1 mg/kg), a mysz umieszcza się ponownie w komorze na kolejną minutę. Schemat przeciwbólowy powinien zostać potwierdzony po konsultacji z lokalną komisją ds. etyki i opieki nad zwierzętami.
5. Sierść na szczycie głowy myszy jest przycinana jak najbliżej skóry. Mysz jest pozycjonowana w instrumencie do wyrównywania stereotaktycznego z płytką zgryzową zaprojektowaną do podawania gazowej anestezji lotnej (Kopf Instruments). Poziom gazu izofluranu jest redukowany do 2% lub do uzyskania efektu. Częstość oddechów jest monitorowana wizualnie podczas operacji. Inne parametry fizjologiczne, takie jak gazy krwi (_pO₂, _pCO₂), pH krwi lub ciśnienie tętnicze, mogą być mierzone za pomocą odpowiedniego sprzętu w trakcie procedury.
6. Na oczy myszy nakłada się za pomocą aplikatora bawełnianego maść do oczu z syntetycznymi łzami, aby zapobiec ich wysychaniu. Na skórę między oczami a szyją nakłada się aplikatorem bawełnianym powidnon-jodynę, a następnie 70% alkohol. Aplikację powidnon-jodyny i alkoholu powtarza się łącznie 3 razy.
7. Za pomocą skalpela (ostrze nr 15) wykonuje się cięcie skóry w linii środkowej od oczu do szyi, a skórę odsuwa się małymi kleszczykami typu bulldog (Fine Science Tools #18050-28), aby odsłonić czaszkę i zapewnić czyste pole operacyjne. Kleszczyki bulldog zwisają z bocznych krawędzi czaszki.
8. Na czaszkę nakłada się aplikatorem bawełnianym miejscowe znieczulenie bupiwakainą (0,025% w soli fizjologicznej), a powięź zeskrobuje się z czaszki końcówką narzędzia dentystycznego lub skrobaka do kości (np. Fine Science Tools, #10075-16).
9. Za pomocą trwałego markera zaznacza się na czaszce punkt w połowie drogi między bregma a lambda oraz między szwem strzałkowym a krawędzią boczną nad prawą półkulą (~2 mm na prawo od linii środkowej). Kroplę kleju cyjanoakrylowego Loctite (Loctite Tak Pak 454) umieszcza się w plastikowej łódce wagowej, a pęsetą boczną (Fine Science Tools, Dumont #6) zanurza się dysk z litego sznura nylonowego (patrz 1.3 powyżej) w kleju, a następnie dociska dysk do zaznaczenia na czaszce. Za pomocą strzykawki 1 ml i igły 26 3/8 G podaje się jedną do dwóch kropli akceleratora Loctite na wierzch dysku, aby spowodować utwardzenie kleju. Przed kontynuacją należy sprawdzić przyczepność dysku do czaszki.
10. Należy umieścić trepan o średnicy zewnętrznej 3 mm (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania) nad dyskiem i obracać go zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż do przecięcia czaszki. Należy często sprawdzać postęp trepanowania, aby uniknąć zbyt głębokiego wiercenia w czaszce i przerwania opony twardej. Wokół obwodu dysku nastąpi cieńczenie czaszki, a płat kostny będzie wydawał się luźny przy lekkim nacisku. Narzędzie dentystyczne należy ustawić równolegle/poziomo do powierzchni czaszki, aby podważyć i unieść płat kostny. Kość oddziela się od czaszki pęsetą. W przypadku niewielkiego krwawienia, bez uszkodzenia opony twardej, należy użyć aplikatora bawełnianego, aby wywrzeć nacisk do momentu ustąpienia krwawienia i zapobiec dostaniu się pyłu kostnego na oponę twardą. Jeśli jednak dojdzie do przerwania opony twardej w taki sposób, że widoczne jest wypadanie treści mózgowej, zwierzę należy wycofać z eksperymentu poprzez humanitarną eutanazję. Ten krok wymaga wystarczającej praktyki w celu osiągnięcia wymaganych umiejętności chirurgicznych.
11. Za pomocą pęsety utrzymuje się piastę urazową w pozycji nad kraniektomią w czaszce tak, aby skos piasty był wyrównany z krzywizną czaszki (tzn. dłuższa krawędź piasty znajduje się w pobliżu bocznej krawędzi czaszki). Jednocześnie, używając drewnianego patyczka ściętego pod kątem żyletką tak, aby miał ostrą końcówkę, drugą ręką nakłada się żelowy superklej wokół zewnętrznych krawędzi piasty i stabilizuje ją, aż zostanie przymocowana pionowo nad otworem. Należy uważać, aby nie nanieść kleju na oponę twardą. Klej na oponie twardej spowoduje osłabienie urazu.
12. W małym papierowym kubku miesza się akryl dentystyczny metakrylan metylu (Jet Acrylic Liquid z Perm Reline/Repair Resin, Butler Schein), aby stworzyć lepki roztwór. Za pomocą strzykawki 1 cc bez igły nakłada się cement dookoła piasty urazowej. Cement powinien pokrywać dolne 2 mm piasty urazowej oraz otaczającą ją odsłoniętą czaszkę. Szwy czaszki są uszczelniane cementem, aby zapewnić, że bolus płynu z urazu pozostanie wewnątrz jamy czaszki.
13. Piastę wypełnia się sterylnym 0,9% NaCl (solą fizjologiczną) za pomocą strzykawki i stępionej igły. Sól fizjologiczna utrzyma wilgotność opony twardej podczas fazy rekonwalescencji. Ponadto, jeśli piasta urazowa nie pozostaje wypełniona, będzie to wskazywać na nieszczelność połączenia piasty z czaszką i należy przymocować nową piastę. Myszy należy podać dootrzewnowo zastrzyk 0,25 ml sterylnej soli fizjologicznej, wyjąć z instrumentu do wyrównywania stereotaktycznego i umieścić w pustej klatce bez drucianej pokrywy na płycie grzewczej. Na dnie klatki należy umieścić nieco hydrożelu i pozwolić myszom na rekonwalescencję przez 1–2 godziny.

2. Indukcja uszkodzenia

1. Włącz oscyloskop (Tektronix TDS 1001B, Two Channel Digi Storage Oscilloscope 40 mHz, 500Ms.s) oraz wzmacniacz (Trauma Inducer Pressure Transducer Amplifier) podłączony do urządzenia LFP. Potwierdź, że urządzenie LFP (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University) oraz podłączone do niego przewody wysokociśnieniowe (długość 41cm, objętość 2ml, Baxter #2C5643) są wypełnione sterylną wodą i wolne od pęcherzyków powietrza. Na końcu przewodu znajduje się męski złącz Luer-lok. Przy zamkniętym końcu Luer-lok przewodu, wygeneruj impulsy testowe poprzez zwolnienie wahadła. Urządzenie należy przygotować do pracy, wykonując około 10 impulsów testowych. Potwierdź, że wahadło generuje gładki sygnał na oscyloskopie i wzmacniaczu. Zaszumiony sygnał wskazuje na obecność powietrza w układzie, które musi zostać usunięte przed podaniem impulsu urazowego. Czas trwania impulsu powinien wynosić około 20 msec. Wzmacniacz przetwornika dostarczony z urządzeniem LFP jest skalibrowany w taki sposób, że 10 mV = 1.0 pounds per square inch (PSI). Jedna atmosfera (ATM) = 14.7 PSI. Ciśnienia urazowe są zazwyczaj podawane w zakresie 0.9 - 2.1 atmosfery, aby uzyskać różny czas powrotu do pozycji wyprostowanej oraz zwiększoną śmiertelność związaną z obrzękiem płuc. Za lekki uraz uznaje się czas powrotu do pozycji wyprostowanej wynoszący 2 - 4 min oraz wskaźnik śmiertelności 0 - 5%. Za uraz umiarkowany uznaje się czas powrotu do pozycji wyprostowanej wynoszący 6 - 10 min oraz wskaźnik śmiertelności 10 - 20 %. W razie potrzeby dostosuj kąt wahadła, aby zwiększyć lub zmniejszyć intensywność impulsu. Kąt początkowy wahadła wynosi około 10 stopni. Po dostrojeniu urządzenia LFP należy pamiętać o otwarciu końcówki Luer-Lok przewodu.
2. Myszy umieszcza się w komorze anestezjologicznej z 4-5 % izofluranem (wstępnie napełnionej) aż do osiągnięcia chirurgicznego poziomu znieczulenia. Myszy umieszcza się na platformie obok urządzenia LFP, a piastę wypełnia sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Przewód urządzenia LFP z męskim złączem Luer-lok zostaje podłączony do żeńskiego złącza Luer-lok piasty. Zwierzę kładzie się na boku i gdy tylko powróci prawidłowy rytm oddechowy, ale przed całkowitym odzyskaniem przytomności przez zwierzę (~2 min), zwalnia się wahadło urządzenia LFP, aby wywołać pojedynczy impuls urazowy. Ważne jest, aby nie wywoływać urazu, gdy zwierzę jest zbyt głęboko znieczulone, ponieważ może to spowodować niewydolność oddechową i śmierć. Należy zapisać dokładne ciśnienie impulsu. Zwierzęta w grupie kontrolnej (sham), nieurazowane, przechodzą wszystkie te same procedury z wyjątkiem faktycznego impulsu cieczy wywołującego uraz.
3. Zwierzę należy niezwłocznie zdjąć z urządzenia LFP i położyć na plecach, aby monitorować czas powrotu do pozycji wyprostowanej. Po tym, jak mysz sama przyjmie pozycję wyprostowaną, zostaje ona ponownie krótko znieczulona, a cement i piasta są razem usuwane z czaszki ręcznie. Następnie skórę głowy zamyka się za pomocą kleju tkankowego Vetbond (3M), szwami lub zszywkami. Odnotowuje się wszelkie przepukliny opony twardej lub niedrożność piasty. Niedrożna piasta spowoduje złagodzenie urazu o nieznanej sile. Zwierzę umieszcza się z powrotem w klatce na podgrzewającej macie aż do odzyskania zdolności poruszania się, a następnie przenosi do swojej klatki domowej.

3. Ocena wyników motorycznych, poznawczych i histologicznych

1. Deficyty motoryczne spowodowane LFP można określić za pomocą testu rotarod, który jest wskaźnikiem zintegrowanej funkcji przedsionkowo-motorycznej i sensoryczno-motorycznej ²¹. Wszystkie zwierzęta muszą zostać poddane badaniu przed urazem w celu ustalenia wartości bazowej oraz aklimatyzacji myszy do schematu badania. Myszy są trenowane na urządzeniu rotarod 3 razy dziennie z 1-godzinnymi odstępami między próbami przez dwa dni poprzedzające uraz. Mierzy się czas utrzymania równowagi na obracającym się pręcie o średnicy zewnętrznej 36 mm z gumową powierzchnią. Prędkość wzrasta od 4 do 40 rpm w ciągu 180 s. Każda próba kończy się w momencie spadnięcia zwierzęcia z rotarod.
2. W różnych punktach czasowych po urazie (zazwyczaj 1, 7 i 21 dni) myszy są ponownie badane na urządzeniu rotarod. Ocena testów rotarod po urazie opiera się na indywidualnych wynikach w stosunku do ich bazowych czasów utrzymania równowagi ²². Średni czas spadnięcia myszy z urazem jest porównywany z czasem spadnięcia myszy z grupy sham.
3. Funkcje poznawcze po LFP można zbadać na oddzielnej grupie myszy, korzystając z labiryntu wodnego Morrisa (MWM), który jest czułą miarą potraumatycznej przestrzennej nauki i pamięci operacyjnej u gryzoni ²³. Myszy są aklimatyzowane do schematu badania i badane pod kątem reakcji bazowej za pomocą testu z widoczną platformą 4 dni przed urazem. Biały okrągły basen (1 m średnicy) jest napełniany wodą z dodatkiem nietoksycznej białej farby. Platforma jest czyniona widoczną za pomocą flagi lub znacznika, a na ścianach nie znajdują się żadne wskazówki wizualne. W ciągu 4 prób mysz jest umieszczana w kwadrancie przeciwległym do widocznej platformy i mierzy się czas dotarcia do platformy. Maksymalny czas próby wynosi 60 s, a mysz pozostaje lub jest umieszczana na platformie przez 15 s na koniec każdej próby. Odstęp między próbami wynosi 5 min, podczas których mysz jest ogrzewana na podkładce grzewczej. Platforma jest przenoszona do innego kwadrantu w każdej próbie i wykonuje się cztery próby.
4. Aby ocenić proces uczenia się, myszy są trenowane w MWM przy użyciu ukrytej platformy przymocowanej w jednym z 4 kwadrantów w różnych punktach czasowych po urazie (zazwyczaj 1, 7 i 21 dni). Na ścianach umieszcza się czarno-białe wskazówki. Kwadrant, w którym umieszczana jest mysz, jest zmieniany pseudolosowo podczas treningu, a czas zlokalizowania platformy jest rejestrowany. Maksymalny czas próby wynosi 60 s, mysz pozostaje lub jest umieszczana na platformie przez 15 s i ogrzewana przez 5 min między próbami. Myszy są poddawane 8 próbom dziennie przez 3 kolejne dni. Aby ocenić retencję pamięci, zwierzęta są poddawane 60-sekundowej próbie sondującej (probe trial) w dniu następującym po ostatnim treningu. Podczas próby sondującej platforma jest usuwana, aby określić czas spędzony i dystans przepłynięty w kwadrancie, w którym wcześniej znajdowała się platforma. Na koniec wykonuje się test z widoczną platformą, aby wykluczyć możliwe deficyty motoryczne i wzrokowe, które mogły rozwinąć się po urazie.
5. W celu określenia histologicznych następstw urazu LFP, tkanki są utrwalane poprzez perfuzję wewnątrzsercową 0,9% NaCl, a następnie 4% paraformaldehydem w wybranych punktach czasowych po urazie. Tkanki są dotrwalane przez noc w temperaturze 4°C, a następnie krioprotektowane w 10% i 30% sacharozie oraz roztworze do zatapiania. Zamrożone seria skrawków są wycinane na kriotomie i przetwarzane przy użyciu różnych technik immunohistochemicznych i histologicznych.

4. Reprezentatywne wyniki:

Uraz wywołany przez urządzenie LFP jest powtarzalny u różnych zwierząt, szczególnie przy odpowiednim przeszkoleniu chirurgicznym. Aby zachować spójność urazu, monitorowany jest poziom ciśnienia wywieranego przez urządzenie na oponę twardą. Wahadło uderza w wypełniony wodą cylinder akrylowy z przewodami wysokociśnieniowymi i złączem Luer-lok, które jest połączone z adapterem urazowym przymocowanym do miejsca kraniotomii u zwierzęcia (Rycina 1A). W przypadku urazu lekkiego do umiarkowanego kąt kąt nachylenia wahadła jest ustawiony tak, aby wytworzyć ciśnienie w zakresie 0,9 - 2,1 atm, a oscyloskop podłączony do wzmacniacza służy do wizualizacji impulsu ciśnienia (Rycina 1B). Uraz powoduje zróżnicowanie czasu powrotu do prawidłowej postawy ciała oraz wzrost śmiertelności związany z obrzękiem płuc. Za uraz lekki uznaje się czas powrotu do prawidłowej postawy wynoszący 2 - 4 min oraz wskaźnik śmiertelności 0 - 5%. Za uraz umiarkowany uznaje się czas powrotu do prawidłowej postawy wynoszący 6 - 10 min oraz wskaźnik śmiertelności 10 - 20%. Ponadto u myszy poddanych LFP może wystąpić postawa toniczna, która może wskazywać na napad drgawkowy. Napady drgawkowe są często związane z uszkodzeniem opony twardej. Wspólnie wyniki te sugerują, że uraz powoduje uszkodzenia neurologiczne. Zwierzęta w grupie kontrolnej (sham) są podłączone do urządzenia LFP, ale wahadło nie zostaje zwolnione.

Aby zwizualizować uszkodzenia wywołane przez LFP, przeprowadzono immunocytochemię z użyciem przeciwciał rozpoznających astrocyty i makrofagi, które są typami komórek związanych z odpowiedzią na uraz. Barwienie na białko kwaśne włókienkowe gleju (GFAP) ujawnia zwiększoną gliozę w całej korze w obszarze urazu, podczas gdy u myszy z grupy sham nie obserwuje się zwiększonej astrocytozy w odpowiadającym miejscu poniżej kraniektomii (Rycina 2A, B). Podobnie, barwienie MAC1 wykazuje większą liczbę makrofagów otaczających miejsce urazu w porównaniu z myszami poddanymi operacji sham. Dodatkowo u myszy poddanych LFP często widoczne są fizyczne uszkodzenia tkanki korowej, których nie stwierdzono u myszy z grupy sham (Rycina 2C, D).

Testy behawioralne po łagodnym LFP mogą być wykorzystane do oceny wyników zarówno poznawczych, jak i motorycznych. MWM służy do określenia wpływu na uczenie się i pamięć. Dzięki wskazówkom wizualnym w pomieszczeniu testowym, myszy z grupy sham z każdym kolejnym dniem treningu w labiryncie wodnym stawały się coraz sprawniejsze w lokalizowaniu platformy. Myszy poddane łagodnemu LFP potrzebują więcej czasu na zlokalizowanie ukrytej platformy w ciągu pierwszych dwóch dni testów w porównaniu z myszami sham, ale następnie zdają się opanować zadanie do trzeciego dnia (Ryc. 3A). Wyniki te sugerują, że uraz zmniejsza tempo, w jakim myszy mogą nabywać zdolność uczenia się przestrzennego. Aby określić wpływ urazu na utrwalanie pamięci, 1 dzień po ostatniej sesji treningowej przeprowadza się próbę sondującą (probe trial). Myszy sham spędzają więcej czasu w kwadrancie docelowym w porównaniu z myszami poddanymi łagodnemu LFP, co sugeruje, że uraz wpłynął na zdolność myszy do przypomnienia sobie miejsca, w którym znajdowała się platforma (Ryc. 3B). W celu oceny funkcji lokomocyjnych myszy testuje się na urządzeniu rotarod. Myszy poddane łagodnemu LFP wykazują krótszy średni czas do spadnięcia w porównaniu z myszami sham w 1, 7 i 21 dniach po urazie (dpi) (Ryc. 3C). Dane te sugerują, że u myszy z urazem występuje upośledzenie zintegrowanej funkcji przedsionkowo-motorycznej i sensoryczno-motorycznej.

Rysunek 1. Urządzenie LFP oraz reprezentatywny zapis z oscyloskopu uzyskany podczas urazu. A) Komponenty urządzenia LFP to: wahadło przymocowane do statywu i ustawione pod kątem określonym w celu przyłożenia pożądanej siły, wypełniony wodą cylinder akrylowy z przymocowaną rurką wysokociśnieniową i złączem Luer-lok, wzmacniacz oraz oscyloskop. B) Reprezentatywny zapis impulsu ciśnienia z oscyloskopu. Wartość szczyt-szczyt wynosi 2.16 V, co wskazuje na ciśnienie 1.47 atm.

Rycina 2. Zwiększona gliosis i odpowiedź zapalna po LFP wykazują zakres uszkodzenia. Zamrożone przekroje poprzeczne (20μm) przez mózg myszy poddanej operacji pozorowanej (A, C) lub urazowi LFP (B, D) 7 dni po urazie (dpi). Obrazy kory pobrano z epicentrum kraniektomii. (A, B) Tkankę zabarwiono przeciwciałem w celu identyfikacji astrocytów. Przeciwciało przeciwko kwaśnemu białku włókienstwa gliaльного (GFAP) (MAB360, Chemicon, 1:400) ujawnia większą liczbę astrocytów w całej korze myszy poddanej urazowi LFP (strzałki) w porównaniu do operacji pozorowanej. Przeciwciało wtórne to kozi anty-mysi 594 (1:1000). (C, D) Tkankę zabarwiono przeciwciałem w celu identyfikacji makrofagów. Przeciwciało MAC1 (MAC1-łańcuch alfa CD11b, BD Biosciences, 1:50) ujawnia więcej makrofagów i/lub aktywowanej mikroglei wokół miejsca urazu w korze (strzałki) w porównaniu do operacji pozorowanej. Przeciwciało wtórne to kozi anty-szczurzy CY3 (1:50). Pasek skali = 200μm w A i B, 100μm w C i D.

Rysunek 3. Testy behawioralne po łagodnym LFP wykazują deficyty u myszy z urazem w porównaniu do myszy z grupy sham. A) Myszy poddane łagodnemu LFP potrzebują więcej czasu na naukę zadania polegającego na znalezieniu platformy w MWM niż myszy z grupy sham. Sham vs LFP (średnie sekundy ± SEM) dzień 1: 34.21 ± 3.02 vs 38.64 ± 2.63; dzień 2: 24.52 ± 2.84 vs 27.21 ± 2.11; dzień 3: 22.47 ± 2.00 vs 22.08 ± 2.52 (1 dpi, n = 9 sham, 10 LFP). B) Myszy poddane łagodnemu LFP spędzają mniej czasu w kwadrancie docelowym podczas próby sondażowej 24 h po ostatnim treningu w MWM w porównaniu do myszy z grupy sham (21 dpi, n = 10). C) Myszy poddane łagodnemu LFP spadają z urządzenia rotarod szybciej niż myszy z grupy sham (1, 7 i 21 dpi, n = 5 sham, 8 LFP). Słupki błędów reprezentują SE.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda LFP modeluje wiele neuropatologicznych i behawioralnych skutków lekkiego do umiarkowanego urazu czaszkowo-mózgowego, co sprawia, że stała się ona powszechnie stosowanym modelem zwierzęcym TBI. Aby zwiększyć trafność i niezawodność tej techniki, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Na przykład ważne jest, aby procedurze LFP poddać i uwzględnić w badaniu tylko te zwierzęta, u których podczas kraniektomii nie naruszono ciągłości opony twardej. Ponadto, jeśli miejsce kraniektomii zostanie zasłonięte przez klej lub cement w taki sposób, że część opony twardej pod kraniektomią nie jest wystawiona na działanie siły ciśnienia cieczy, zwierzę powinno zostać wykluczone z badania. Wreszcie, jeśli czas odruchu prostowania lub wskaźnik śmiertelności nie mieści się w pożądanym zakresie, zwierzę nie powinno zostać włączone do badania. Intensywność impulsu ciśnienia można zwiększyć, aby wywołać poważniejsze urazy.

Jak pokazano na Ryc. 1, konfiguracja urządzenia LFP jest stosunkowo prosta, a powtarzalność stopnia urazu jest zapewniana poprzez monitorowanie atmosfery ciśnienia na oscyloskopie. Gładki kształt krzywej na śladzie oscyloskopu wskazuje na brak pęcherzyków powietrza w cieczy, które mogłyby zakłócić indukcję urazu LFP. Przed indukcją urazu należy podać impuls testowy; jeśli ślad na oscyloskopie nie wykazuje gładkiej krzywej, należy usunąć pęcherzyki powietrza. Czas trwania impulsu wynosi około 20 msec, co odpowiada czasowi indukcji pomierzonemu w symulacjach testów zderzeniowych. Impulsy o krótszym czasie trwania prawdopodobnie wywołają urazy bardziej ogniskowe. Dlatego taki czas trwania impulsu modeluje ludzkie TBI.

Zmiany morfologiczne i komórkowe następujące po LFP obejmują fizyczne uszkodzenie tkanki, a także zwiększoną liczbę astrocytów i makrofagów, co przedstawiono na Rysunku 2. Dobrze wiadomo, że jednym z charakterystycznych objawów urazu jest hiperplazja astrocytów i tworzenie się blizny glejowej. Wykazano, że blizna glejowa wywołuje zarówno korzystne, jak i niekorzystne efekty ²⁴. Podobnie makrofagi gromadzą się w różnych tkankach w fazie następującej po urazie, gdy rozpoczyna się proces gojenia ²⁵. Zatem zwiększona liczba komórek dodatnich pod kątem GFAP i MAC1 w próbkach LFP w porównaniu z kontrolami pozorowanymi świadczy o indukcji urazu. Brak ekspresji tych specyficznych markerów komórkowych w kontrolach pozorowanych wskazuje, że same manipulacje chirurgiczne nie mają negatywnych konsekwencji dla zdrowia tkanki mózgowej i że zmiany w ekspresji białek są specyficzne dla zastosowanego modelu urazu.

Konsekwencje behawioralne łagodnego LFP przedstawione na Rysunku 3 obejmują deficyty poznawcze i motoryczne. Wyniki MWM wskazują, że myszy z LFP ostatecznie uczą się zadania, ale w wolniejszym tempie niż myszy z grupy sham, a ich zdolność zapamiętywania zadania jeden dzień po treningu jest słabsza. Zatem nawet lekko uszkodzone myszy są mniej efektywne niż myszy z grupy sham w wykorzystywaniu wskazówek zewnętrznych do przetwarzania, konsolidacji i przechowywania informacji przestrzennych, które muszą zostać przywołane podczas kolejnych testów. Wykazano, że inne zadania poznawcze zależne od hipokampa, takie jak warunkowa reakcja strachu, są upośledzone u myszy poddanych LFP ²⁶. Wreszcie krótszy czas do upadku myszy z LFP w stosunku do myszy z grupy sham w paradygmacie rotarod do 3 tygodni po łagodnym urazie jest wskaźnikiem deficytów w zintegrowanej funkcji vestibulomotorycznej i sensorymotorycznej. Bardziej umiarkowany uraz ujawniłby bardziej uderzające zmiany w funkcjach poznawczych i motorycznych, co zostało wykazane przez inne grupy ^27-30.

Podsumowując, LFP jest wiarygodnym modelem ludzkiego TBI, ponieważ spełnia wiele oczekiwanych kryteriów. LFP zapewnia trafność teoretyczną (construct validity), odtwarzając procesy etiologiczne, które indukują TBI u ludzi. W szczególności wielkość siły oraz wskaźnik śmiertelności są zbliżone do tych występujących przy łagodnych i umiarkowanych urazach sportowych oraz samochodowych, z zastrzeżeniem, że interwencje chirurgiczne poprzedzające uraz są specyficzne dla modelu zwierzęcego. LFP wykazuje również trafność zewnętrzną (face validity), gdyż odtwarza wiele anatomicznych, biochemicznych, neuropatologicznych i behawioralnych efektów obserwowanych przy ludzkim TBI. Po LFP wykrywa się zmiany zarówno ogniskowe, jak i rozlane, a lateralizacja uderzenia pozwala na porównanie uszkodzeń morfologicznych po stronie ipsilateralnej w stosunku do strony kontralateralnej. Pewnym zastrzeżeniem jest fakt, że efekty poznawcze i motoryczne mogą być subtelniejsze w wyniku uszkodzenia tylko jednej półkuli. Wreszcie, LFP wykazuje trafność prognostyczną, a niezawodność techniki LFP umożliwia ocenę różnych manipulacji farmakologicznych i genetycznych przed lub po indukcji urazu ²⁰. Zmienne fizjologiczne, takie jak ciśnienie krwi, pH krwi i gazy krwi, będą wymagały pomiaru w obecności i przy braku badanego leku, aby określić mechanizm działania czynnika terapeutycznego. Jednakże, ze względu na złożony charakter pierwotnych i wtórnych następstw TBI, zidentyfikowanie pojedynczej interwencji zdolnej złagodzić wszystkie objawy jest zadaniem trudnym.

Jednym z przyszłych rozważań w odniesieniu do techniki LFP może być zastosowanie mikrofluidycznego uderzenia (micro-fluid percussion), w którym wykorzystuje się instrument sterowany mikroprocesorem i napędzany pneumatycznie, aby wyeliminować konieczność kalibrowania siły dostarczanej przez wahadło oraz uniknąć zmiennych operacyjnych, takich jak pęcherzyki powietrza w cieczy ¹⁵. Niemniej jednak standardowe podejście LFP zostało uznane przez wielu badaczy za niezawodną i prostą technikę badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uszkodzeń i regeneracji po TBI, co pozwoli na opracowanie lepszych interwencji i metod terapeutycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aparat do ustawiania stereotaktycznego dla myszy (Kopf Instruments) Uchwyt do głowy myszy do znieczulenia gazowego (Kopf Instruments) Aparat do znieczulenia z O22 przepłukać (Parkland Scientific) Aparat do znieczulenia z funkcją szybkiego przepływu O2 (Parkland Scientific) Buprenorfina (Webster Animal Supply) Odświeżyć maść do oczu Lacri Lube (Fisher) Bupiwakaina/Marcaine (Webster Animal Supply) Roztwór powidon-jodu (Fisher) 20 g 1 ½” igły (Becton Dickinson) Ostrze skalpela (nr 15) i uchwyt (Becton Dickinson) Klemami typu bulldog (Fine Science Tools) Narzędzie stomatologiczne lub skrobaczka do kości (Fine Science Tools) Pęseta boczna Dumont #6 (Fine Science Tools) trepan o średnicy zewnętrznej 3 mm (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania) Solidna linka nylonowa (średnica 1,7 mm, np. linka do podkaszarki) Żelowy klej super glue klej cyjanoakrylowy Loctite (Loctite 444 Tak Pak) (Henkel Corporation) Płyn akrylowy Jet (Butler Schein) Żywica do podłożenia i naprawy protez Perm Reline/Repair Resin (Butler Schein) Oscyloskop cyfrowy TDS 1001B, 40 mHz, 500MS/s (Tektronix) Wzmacniacz przetwornika ciśnienia induktora urazów (projekt i wykonanie własne, Virginia Commonwealth University) urządzenie do pomiaru LFP (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University) Przewód wysokociśnieniowy, długość 41 cm, objętość 2 ml (Baxter) Klej tkankowy 3M Vetbond (Fisher)