Suprasja immunologiczna człowieka in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu nierównowagi immunologicznej

Podsumowanie

Komórki Tregs są silnymi supresorami układu odpornościowego. Z powodu braku unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich jednoznaczną identyfikację, definicje Tregs opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro umożliwiający identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób narażonych na rozwój cukrzycy typu 1 (T1D).

Streszczenie

Regulacyjne limfocyty T (Tregs) są krytycznymi mediatorami tolerancji immunologicznej wobec autoantygenów. Ponadto stanowią kluczowe regulatory odpowiedzi immunologicznej po infekcji. Mimo wysiłków zmierzających do zidentyfikowania unikalnego markera powierzchniowego dla Tregs, jedyną ich unikalną cechą jest zdolność do supresji proliferacji i funkcji efektorowych limfocytów T. Chociaż jest oczywiste, że do oceny funkcji ludzkich Tregs można wykorzystać jedynie testy in vitro, staje się to problematyczne przy analizie wyników badań przekrojowych, w których konieczne jest porównanie komórek zdrowych z komórkami izolowanymi od pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi (takimi jak cukrzyca typu 1 – T1D). W laboratoriach występuje duża zmienność w zakresie liczby i rodzaju limfocytów T responderów, charakteru i siły stymulacji, stosunku Treg do responderów oraz liczby i rodzaju komórek prezentujących antygen (APC) wykorzystywanych w ludzkich testach supresji in vitro. Ta zmienność utrudnia porównywanie wyników badań mierzących funkcje Tregs. Dziedzina badań nad Tregs wymaga zstandaryzowanego testu supresji, który będzie skuteczny zarówno u osób zdrowych, jak i u osób z chorobami autoimmunologicznymi. Opracowaliśmy test supresji in vitro, który wykazuje bardzo niewielką zmienność wewnątrzanalityczną w stymulacji limfocytów T izolowanych od zdrowych ochotników w porównaniu do osób z rozwijającą się autoimmunologiczną destrukcją komórek β trzustki. Głównym celem niniejszego opracowania jest opis ludzkiego testu supresji in vitro, który umożliwia porównanie różnych grup badanych. Dodatkowo test ten ma potencjał do wykrywania niewielkiego spadku funkcji nTreg i przewidywania dalszego pogorszenia w przyszłości, co pozwala zidentyfikować osoby, które mogłyby odnieść korzyść z zapobiegawczej terapii immunomodulującej¹. Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis kroków zaangażowanych w tę procedurę. Mamy nadzieję przyczynić się do standaryzacji testu supresji in vitro stosowanego do pomiaru funkcji Tregs. Ponadto oferujemy ten test jako narzędzie do rozpoznawania wczesnego stanu nierównowagi immunologicznej oraz potencjalny biomarker funkcjonalny dla T1D.

Protokół

1. Przed przygotowaniem testu supresji należy pokryć kuleczki aktywowane tosylanem przeciwciałem anty-human CD3 (klon UCHT1, stężenie końcowe 1μg/ml) w celu stymulacji komórek, a następnie sprawdzić skuteczność pokrycia kuleczek, przeprowadzając test proliferacji in vitro z użyciem ludzkich limfocytów T

1. Pobrać 1ml kulek M-450 aktywowanych tosylanem z oryginalnej fiolki, umieścić w statywie magnetycznym i utrzymać do czasu, aż wszystkie kulki przylgną do ścianki probówki. Usunąć bufor, gdy probówka wciąż znajduje się w statywie magnetycznym. Wyjąć probówkę ze statywu magnetycznego i dodać 1ml buforu 1, ponownie umieścić probówkę w statywie magnetycznym i usunąć bufor 1, gdy probówka znajduje się w statywie; resuspender kulki w 1ml buforu 1 i dodać 40μl przeciwciał anty-human CD3, mieszać w temperaturze 37°C przez 15 minut, dodać 0,1%w/v BSA i kontynuować mieszanie przez kolejne 16 godzin.
2. Przemyć kulki w buforze 2 dwukrotnie przez 5 minut w temperaturze 2-8°C oraz raz w buforze 3 przez 5 minut w temperaturze 2-8°C, korzystając ze statywu magnetycznego zgodnie z powyższym opisem; usunąć bufor i resuspender kulki w 1ml buforu 2; końcowe stężenie kulek wynosi 4x10⁸/ml i są one gotowe do użycia.
3. Rozdzielić 50 000 oraz 25 000 PBMC na dołek w trzech powtórzeniach na płytce 96-dołkowej i dodać zmienną liczbę kulek pokrytych CD3 (4x10⁸ kulek/ml, CD3 1μg/ml, na przykład 1, 2, 3, 4, 5 kulek/komórkę), aby określić optymalną liczbę kulek na komórkę. Po 72 godzinach hodowli dodać 1μCi [³H] tymidyny i kontynuować inkubację w temperaturze 37°C przez kolejne 16 godzin. Zebrać komórki do płytki zbiorczej Multiscreen (Millipore), dodać ciecz scyntylacyjną i odczytać liczbę zliczeń na minutę (cpm)/dołek za pomocą Top Count NXT (Packard, CT). Należy zastosować taki stosunek kulek/komórkę, przy którym wartości cpm są powyżej 5000, ale poniżej 15 000, aby uniknąć nadmiernej stymulacji komórek Treg, które mogłyby utracić funkcję supresyjną. Zazwyczaj stosunek 3 kulek/komórkę stymuluje zarówno komórki respondery, jak i komórki Treg we wszystkich dotychczas przebadanych grupach badanych^1-4.

2. Izolacja PBMC z krwi pełnej od zdrowych dawców, z ludzkich leukopacków lub warstwy leukocytowej (BC), zazwyczaj pobieranych od zdrowych ochotników i dostępnych bezpłatnie z lokalnych centrów transfuzjologii (Rysunek 1)

1. Rozcieńcz BC (˜50ml) w stosunku 1:6 za pomocą PBS (dodaj 250ml), tak aby całkowita objętość wynosiła 300ml. Powoli nanieś 25ml rozcieńczonego BC na warstwę 15ml Ficoll-Paque PLUS w probówkach Falcona o pojemności 50ml, uważając, aby nie zmieszać warstw. Wirować przy 800xg (1400rpm w wirówce Sorvall z rotorem z koszyczkami SH-3000) przez 30 minut w temperaturze 4°C, z wyłączonym hamulcem.
2. Ostrożnie zbierz warstwę PBMC (faza pośrednia) i przenieś ją do nowej probówki Falcona 50ml. Przemyj PBMC, dopełniając probówki do 50ml za pomocą DPBS. Zbierz 2 osady komórkowe do jednej probówki. Wirować przy 400xg przez 10 min w temperaturze 4°C. Powtórz etap płukania dwukrotnie, za każdym razem łącząc 2 osady komórkowe w jednej probówce. Połącz wszystkie osady komórkowe w jednej probówce 50ml.
3. Policz PBMC, stosując test wykluczania z błękitem Trypanu. Przygotuj rozcieńczenie 1:10 w błękicie Trypanu, dodając 20μl PBMC do 180μl barwnika Trypan Blue. Wymieszaj dokładnie i natychmiast pobierz 20μl do zliczenia w komorze countingowej (hemacytometrze). Policz wszystkie niezbarwione oraz tylko komórki zabarwione na niebiesko, znajdujące się w dwóch kwadratach, z których każdy zawiera 16 mniejszych pól. Oblicz średnią z obu wyników i pomnóż przez 10. Podziel tę liczbę przez 100, aby otrzymać liczbę PBMC/ml. Procent żywych komórek oblicz wg wzoru [1-(liczba niebieskich komórek/całkowita liczba komórek)x100]. Kontynuuj procedurę, jeśli żywotność wynosi ≥95%.

3. Wstępna sortowanie komórek T CD4 metodą MACS

1. Przed przystąpieniem do dalszych działań, przenieś 1ml PBMC do nowej probówki i dodaj 4ml pożywki, aby przygotować komórki do napromieniowania dawką 5000rad – będą one pełnić rolę komórek prezentujących antygen (APC).
2. Pozostałe komórki odwiruj przy 250xg w buforze PBS/2mM EDTA/0,5%BSA przez 10min w temperaturze 4°C. Odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 4ml buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA.
3. Dodaj 200μl mikrokulek MACS anty-CD4 i inkubuj w temperaturze 4°C przez 20 minut.
4. Przemyj komórki, dodając 40ml buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA, a następnie odwiruj przy 250xg przez 10min w temperaturze 4°C. Odlej nadsącz i resuspenduj w 8ml odgazowanego buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA w temperaturze pokojowej.
5. Przefiltruj zawiesinę komórkową, używając filtrów do wstępnej separacji, przed nałożeniem jej na kolumnę LS.
6. Podziel zawiesinę komórkową i nanieś po 4ml na każdą z kalibrowanych kolumn LS (zawierających 3ml odgazowanego buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA). Kolumna LS jest zamocowana w separatorze MidiMACS. Zanim zawiesina komórkowa całkowicie spłynie, ponownie przepuść przełom lub dodaj 3ml odgazowanego buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA w temperaturze pokojowej i poczekaj, aż bufor przepłynie. Dodawaj bufor do momentu, aż przełom stanie się klarowny.
7. Pipetą nanieś 5ml odgazowanego buforu na kolumnę LS, wyjmij kolumnę LS z separatora MidiMACS i umieść ją w nowej sterylnej probówce zbierającej o pojemności 15ml, pozwalając na spłynięcie ˜1,0ml. Włóż tłok do kolumny i powoli wypchnij pozostałą objętość.
8. Powtórz tę procedurę dla obu kolumn LS i połącz obie frakcje CD4+. Uzupełnij objętość do 50ml buforem PBS i policz komórki. Przewidywana wydajność wynosi do 5x10⁸ komórek. Odwiruj przy 400xg przez 10 minut i dokładnie resuspenduj komórki w 2ml buforu PBS/2mM EDTA/0,5%BSA.

4. Izolacja metodą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) (Rysunek 2)

1. Przygotować koktajl przeciwciał przeciwko markerom CD dla następujących markerów powierzchniowych komórek (przechowywać w ciemności): 20 μl przeciwciał anty-ludzkich CD8-FITC (klon RPA-T8), 20 μl przeciwciał anty-ludzkich CD14-FITC (klon M5E2; receptor LPS), 20 μl przeciwciał anty-ludzkich CD32-FITC (klon FLI8.26; FcγR typu II) oraz 6 μl przeciwciał anty-ludzkich CD116-FITC (klon M5D12; łańcuch α GM-CSFR) i opcjonalnie dodać 40 μl przeciwciał anty-ludzkich CD4-APCCy7 (klon RPA-T4).
2. Odebrać 5 μl z 2 ml zawiesiny komórkowej i barwić 2 μl koktajlu barwiącego; jest to probówka do wyznaczenia progu (Fluorochrome Minus One-FMO)⁵.
3. Do koktajlu barwiącego dodać 50 μl przeciwciał anty-ludzkich CD25-PE (klon M-A251; IL-2Rα), dodać koktajl do zawiesiny komórkowej i inkubować w temperaturze 4°C przez 30 minut. Przemyć komórki w buforze PBS, odwirować przy 400xg przez 10 minut i ponownie zawiesić komórki do stężenia 10⁷/ml.
4. Przygotować niebarwione komórki oraz komórki lub koraliki barwione pojedynczym fluorochromem, aby posłużyły jako kontrola kompensacji podczas sortowania komórek na urządzeniu FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ).
5. Nabyć dane z probówki FMO, co pozwoli użytkownikowi na ustawienie progu sortowania komórek T CD25+ (Rysunek 2a). Ustawić bramkę wokół komórek FITC-ujemnych, aby wykluczyć komórki FITC-dodatnie obejmujące monocyty, makrofagi i wszystkie pozostałe komórki CD4+ niebędące limfocytami T (Rysunek 2b).
6. Na oddzielnym wykresie wyznaczyć bramki dla limfocytów T CD25-, CD25low oraz CD25high-Tregs (górne 1% komórek wykazujących najwyższą ekspresję CD25) (Rysunek 2c). Subpopulacje komórek zazwyczaj wykazują wysoką czystość (Rysunek 2d, 2e i 2f).
7. Odwirować probówki z komórkami przy 400xg przez 10 minut i przechowywać je na lodzie do czasu wysiania.

5. Przygotowanie hodowli komórkowej na płytce 96-dołkowej (schemat zamieszczony w Tabeli 1) w objętości 200μl/dołek

1. Do studni 96-dołkowych płytek z dnem w kształcie litery U nanieś 50 μl kulek pokrytych CD3 (1 μg/ml), w ilości obliczonej na 3 kulki na komórkę respondenta w studni, resuspendowanych w pełnej pożywce z dodatkiem 10% puli ludzkiego serum AB. (Na przykład, aby przygotować 2 ml pożywki z kulkami pokrytymi CD3, pobierz 7,5 μl z zapasu kulek pokrytych CD3 – stężenie końcowe 4x10⁸/ml i rozcieńczyć w 2 ml pożywki; każda objętość 50 μl będzie zawierać 75 000 kuleczek (3 kuleczki/komórkę).
2. Rozcieńczyć napromieniowane APC do stężenia 5x10⁵koncentracja komórek na ml i dodać 50 μl (będzie zawierać 2,5 x 10⁴ komórki) do każdej studzienki z wcześniej dodaną stymulacją, w tym do studzienek oznaczonych jako „Tregs only”, „APC only” oraz „media only” w Tabeli 1.
3. Dodać 2,5 x 10⁴/do studzienki komórki T CD4+CD25- lub CD4+CD25low w trzech powtórzeniach zgodnie z projektem w Tabeli 1.
4. Dodaj komórki Treg do kokultur (wiersz B, tabela 1) w stosunku 1:10 (2500 komórek Treg) oraz do studzienek oznaczonych jako „Tregs only”, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37°C w CO2₂ inkubator z 5% CO2₂, w nasyconej wilgotności przez 72 godziny.
5. Dodaj do studzienek impuls 1 μCi [³tymidynę i kontynuować inkubację w temperaturze 37°C przez kolejne 16 godzin.

6. Zbieranie i liczenie

1. Zebrać komórki z wielokanałowej płytki do zbioru, używając systemu Packard Filtermate lub systemu alternatywnego.
2. Dodać płyn scyntylacyjny (Microscint 20), a następnie przykryć płytkę przezroczystą plastikową pokrywą w przygotowaniu do ostatniego etapu.
3. Odczytać liczbę zliczeń na minutę (cpm) na studnię, korzystając z Top Count NXT (Packard, CT) lub systemu alternatywnego.

7. Obliczanie procentu supresji

1. Ponieważ komórki hodowano w trzech powtórzeniach, dla każdego warunku obliczano wartość średnią. Jeśli współczynnik zmienności wynosił >30%, wartość odstająca była usuwana, a średnią cpm obliczano tylko dla dwóch studzienek. Procent supresji wyznaczano według wzoru [(s-c)/s] x 100%, gdzie s=cpm w hodowli pojedynczej, a c=cpm w hodowli współczynnikowej.
2. Ponieważ naiwne (CD25-) oraz aktywowane in vivo (CD25low) efektorowe limfocyty T wysiano jako limfocyty T odpowiadające, rejestrowano różnicę w zdolności Tregs do supresji każdej z tych subpopulacji i wykorzystywano ją jako potencjalny funkcjonalny wskaźnik prognostyczny, opierając się na założeniu, że komórki aktywowane są trudniejsze do supresji.

8. Reprezentatywne wyniki:

Znaczna zmienność metod oraz wyników uzyskiwanych w testach supresji ludzkich komórek in vitro skłoniła nas do przeprowadzenia kompleksowego badania warunków wpływających na ten test¹. Opracowaliśmy test, który bada nie tylko funkcję Treg, ale również ich czystość, biorąc pod uwagę niski stosunek Treg:Teff (1:10), który ustaliliśmy we wcześniejszych badaniach⁶. Ponadto komórki Treg różnią się zdolnością do skutecznej supresji naiwnych i aktywowanych in vivo limfocytów T nawet u zdrowych osób, co pokazano na Rysunku 3 oraz w naszych poprzednich pracach^2,4; różnica ta staje się bardziej wyraźna w przypadku zaburzenia równowagi immunologicznej, np. u osób zagrożonych rozwojem T1D. Test ten sprawdził się bardzo dobrze w badaniu, w którym porównywaliśmy funkcję supresyjną naturalnych (nTregs), indukowanych (iTregs) i namnożonych in vitro nTregs, co pozwoliło nam porównać ich funkcję u zdrowych osób kontrolnych oraz u pacjentów z T1D w fazie wczesnej (RO) i późnej (LS). Wyciągnęliśmy wniosek, że pacjenci z RO T1D wykazują lepszą zdolność do generowania funkcjonalnych iTregs oraz namnożonych nTregs w porównaniu do pacjentów z LS T1D i zdrowej grupy kontrolnej⁷. Zatem test ten może służyć jako doskonałe narzędzie do rozpoznawania zarówno wczesnego, jak i późnego stanu nierównowagi immunologicznej.

Schemat 1 Schematyczne przedstawienie etapów analizy supresji in vitro

Rysunek 1. Etapy testu supresji in vitro przedstawione na fotografiach

Rysunek 2. Strategia bramkowania w izolacji komórek metodą FACS. a) próg CD25+ został dostosowany zgodnie z kontrolą Fluorochrome Minus One (FMO), b) komórki zostały bramkowane jako FITC-ujemne, c) komórki FITC-ujemne zostały dalej bramkowane i zebrane jako CD+CD25-, CD+CD25low oraz CD+CD25high (Tregs), przedstawione wraz z wartościami procentowymi, d) komórki Tregs posortowane metodą FACS po sortowaniu, e) komórki CD+CD25low posortowane metodą FACS po sortowaniu oraz f) limfocyty T CD4+CD25- posortowane metodą FACS po sortowaniu

Rycina 3. Reprezentatywne wyniki zdrowych ochotników a) Reprezentatywne wyniki liczby impulsów na minutę (cpm) zdrowych ochotników przedstawione jako monokultury dla wszystkich zaangażowanych subpopulacji komórek (naiwne-CD25-, aktywowane in vivo-CD25low, komórki prezentujące antygen-APC i regulacyjne limfocyty T-Treg), a także kokultury limfocytów T respondujących (CD25- lub CD25low) i Tregów. b) Procent supresji poszczególnych limfocytów T respondujących CD25- i CD25low przez autologiczne Tregi przedstawiony dla zdrowych osób kontrolnych (n=4). Supresję obliczono jako [(s-c)/s] x 100%, gdzie s=cpm w monokulturze, a c=cpm w kokulturze. Chociaż zauważono niewielką różnicę w zdolności Tregów do supresji limfocytów T respondujących, nie była ona istotna (test t dla prób zależnych p=0,08). c) Przedstawiono cpm osób z grupy ryzyka dla każdej monokultury, w tym CD25- i CD25low jako limfocyty T respondujące, a także APC i Tregi, oraz kokultury, w których każda subpopulacja limfocytów T respondujących została zasiana z Tregami (CD25-/Tregi i CD25low/Tregi). d) Procent supresji poszczególnych limfocytów T respondujących CD25- i CD25low przez autologiczne Tregi przedstawiony dla osób z grupy ryzyka (n=4). Różnica w zdolności Tregów do supresji limfocytów T respondujących CD25- w porównaniu do CD25low była istotna (test t dla prób zależnych p=0,04).

Tabela 1. Schematyczny układ testu supresji in vitro

	1-3	4-6	7-9	10-12
A	CD4CD25-	CD4CD25low	wyłącznie multimedia	wyłącznie multimedia
B	CD4+CD25- / Tregi	CD4CD25low /Tregs	wyłącznie limfocyty Treg	wyłącznie APC
C
D
E
F
G
H

Dyskusja

Ponieważ funkcja supresyjna jest jedyną unikalną cechą Tregs, powinna być ona badana w sposób wiarygodny i jednolity u pacjentów w różnych fazach rozwoju choroby, zarówno w obrębie jednego badania, jak i pomiędzy różnymi badaniami. W ramach naszego wkładu w standaryzację tego testu przedstawiamy szczegóły analizy supresji opracowanej w naszym laboratorium. W rozległym badaniu optymalizacyjnym ustaliliśmy, że stymulacja limfocytów T za pomocą kulek powlekanych przeciwciałami anty-human CD3 (klon UCHT1, w stężeniu 1μg/ml (...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ficoll-Paque PLUS	Amersham	17-1440-03
DPBS-1X	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Błękit trypanowy	Invitrogen	15250-061
mikrokuleczki anty-CD4	Miltenyi Biotec	130-045-101
Filtry do separacji wstępnej	Miltenyi Biotec	130-041-407
Kolumna LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
EDTA	Invitrogen	15575-020
BSA	Sigma-Aldrich	B4287
Przeciwciało anty-CD4 przeciwko ludzkim antygenom (klon RPA-T4)	BD Biosciences	557852
Przeciwciało anty-CD25-PE przeciwko ludzkim antygenom (klon M-A251; IL-2Rα)	BD Biosciences	555432
Przeciwciało anty-CD8-FITC przeciwko ludzkim antygenom (klon RPA-T8)	BD Biosciences	555366
Przeciwciało anty-CD14-FITC przeciwko ludzkim antygenom (klon M5E2; receptor LPS)	BD Biosciences	555397
Przeciwciało anty-CD32-FITC przeciwko ludzkim antygenom (klon FLI8.26; FcγR typu II)	BD Biosciences	555448
Przeciwciało anty-CD116-FITC przeciwko ludzkim antygenom (klon M5D12; łańcuch α GM-CSFR)	BD Biosciences	554532
Dynalbeads M-450 aktywowane tosylowo	Invitrogen	140-13
Przeciwciało anty-CD3 przeciwko ludzkim antygenom	Ancell	144-024
Bufor 1	Własny		0,1 M Na2B4O7 pH 7,6
Bufor 2	Własny		PBS/2 mM EDTA/ 0,1% BSA pH 7,4
Bufor 3	Własny		0,2 M Tris/0,1% BSA pH 8,5
Kompletna pożywka RPMI	Własny		pożywka RPMI 1640, 2 mM L-glutaminy, 5 mM HEPES, 100 U/μg/ml penicyliny/streptomycyny, 0,5 mM pirogronianu sodu
[3H] tymidyna	PerkinElmer, Inc.	NET027Z005MC
połączone ludzkie surowice AB	Atlanta Biologicals	S40110
Płyta do zbioru Multiscreen	EMD Millipore	MAHFC1H60
Microscint 20	PerkinElmer, Inc.	6013621