Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Podsumowanie

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Streszczenie

Migracja komórek jest fundamentalna dla wielu aspektów biologii, w tym dla rozwoju, gojenia ran, odpowiedzi komórkowych układu odpornościowego oraz przerzutowania komórek nowotworowych. Migrację badano na szklanych pokrywkach, aby dynamika komórkowa była podatna na analizę za pomocą mikroskopii świetlnej. Stało się jednak jasne, że wiele aspektów migracji komórek zależy od cech lokalnego środowiska, takich jak jego elastyczność, skład białkowy i rozmiar porów, które nie są wiernie reprezentowane przez sztywne podłoża dwuwymiarowe, takie jak szkło i plastik ¹. Co więcej, wykazano, że oddziaływanie z innymi typami komórek, w tym z fibroblastami zrębowymi ² i komórkami odpornościowymi ³, odgrywa krytyczną rolę w promowaniu inwazji komórek rakowych. Badania na poziomie molekularnym coraz częściej wykazują, że dynamika molekularna, w tym odpowiedź na leczenie farmakologiczne, identycznych komórek różni się znacząco w porównaniu in vitro i in vivo ⁴.

W idealnym przypadku najlepiej byłoby badać migrację komórek w ich naturalnym kontekście w żywych organizmach, jednak nie zawsze jest to możliwe. Dlatego istotnymi pośrednikami eksperymentalnymi są systemy hodowli tkankowych, takie jak macierz pochodzenia komórkowego, matrigel, hodowle organotypowe (opisane w niniejszym materiale), eksplanty tkankowe, organoidy oraz ksenoprzeszczepy. Systemy te przybliżają pewne aspekty środowiska in vivo, ale są bardziej podatne na manipulacje eksperymentalne, takie jak wykorzystanie stabilnie transfektowanych linii komórkowych, schematy leczenia lekami oraz długoterminowe obrazowanie o wysokiej rozdzielczości. Takie systemy pośrednie są szczególnie użyteczne jako pola testowe do walidacji sond i ustalania parametrów niezbędnych do obrazowania dynamicznej odpowiedzi komórek i reporterów fluorescencyjnych przed przystąpieniem do obrazowania in vivo ⁵. W związku z tym mogą one odgrywać istotną rolę w ograniczaniu zapotrzebowania na eksperymenty na żywych zwierzętach.

Protokół

1. Ustanowienie kultur fibroblastów z eksplantów skóry

1. Biopsjey wycinane o średnicy 4 mm pobrane z przedramienia człowieka umieszcza się w pożywce MEM uzupełnionej o 100 units / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny oraz 0,25 μg / ml Fungizone.
2. Należy odciąć tkankę tłuszczową podskórną i drobno posiekać biopsjat na małe kawałki, przesuwając ostrze skalpela nr 24 o dnie szalki Petriego.
3. Zawiesinę tkankową przenosi się do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm² z dodatkiem pożywki do wzrostu pierwotnych fibroblastów (MEM uzupełnione o 10% FCS, 100 units / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny oraz 25 μg / ml Fungizone) w ilości takiej, aby powierzchnia kolby była pokryta, lecz głębokość cieczy była niewystarczająca, by tkanka mogła pływać.
4. Po 3 dniach inkubacji w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO₂ należy dodać 3 ml pożywki do wzrostu pierwotnych fibroblastów.
5. Po kolejnych 3 dniach inkubacji należy wymienić pożywkę na świeżą pożywkę do wzrostu pierwotnych fibroblastów; jeśli komórki są niemal konfluentne, można je przesiać w stosunku 1:4 do świeżej pożywki. (Od tego momentu można pominąć dodawanie Fungizone).

2. Etap I - Przygotowanie kolagenu I z ogonów szczura

Uwaga: Protokół dla około 12-14 ogonów szczurów młodzieńczych (świeżych lub mrożonych)

1. Przygotuj ogon szczura, myjąc go w 70% etanolu, a następnie usuń ścięgna w następujący sposób:
2. Usuń skórę z ogona szczura, nacinając go skalpelem w połowie długości od góry do dołu i ściągając skórę wzdłuż ogona.
3. Oddziel ścięgno od rdzenia w części proksymalnej ogona.
4. Usuń ścięgno w kierunku części dystalnej ogona, unikając uszkodzenia pochewki, używając pęsety ząbkowej.
5. Ekstrahuj 1 g ścięgna w 250 ml 0,5 M kwasu octowego, mieszając przy 4°C przez 48 h.
6. Odwiruj ekstrakt (7 500 x g) przez 30 min i odrzuć osad.
7. Dodaj do supernatantu równą objętość 10% (w/v) NaCl i mieszaj przez 30-60 min.
8. Odwiruj (10 000 x g) przez 30 min, odrzuć supernatant i ponownie rozpuść osad w 0,25 M kwasie octowym w stosunku ok. 1:1, mieszając przez 24 h przy 4°C.
9. Dializuj roztwór kolagenu przeciwko 6-8 zmianom 6 L ok. 17,5 mM kwasu octowego (1 ml octanu lodowatego na litr zimnej wody, zmieniać 2 x dziennie).
10. Odwiruj zdializowany kolagen przy 30 000 x g przez 1,5 h.
11. Usuń supernatant i przelej do sterylnej kolby.
12. Dostosuj stężenie kolagenu I do poziomu ok. 2 mg/ml, używając 0,5 mM kwasu octowego przy 4°C.

3. Etap II - Przygotowanie macierzy 3D z zatopionymi fibroblastami (pozostawienie do kurczenia przez 8 dni).

1. Przygotować mieszaninę, używając zimnych odczynników w temperaturze 4°C w uprzednio schłodzonej butelce. Kolagen I przechowywać w lodzie.
2. Dla jednej kolby T75 z konfluentnymi pierwotnymi fibroblastami (liczba komórek ok. 1 x 10⁶) użyć:
   • 25 ml kolagenu z ogona szczura (stężenie ok. 2mg/ml)
   • 3 ml 10xMEM
   • 0.22 M NaOH: najpierw dodać 2ml, następnie dodawać kroplowo podczas mieszania, aż kolagen zmieni kolor na pomarańczowy,
   • ale nie na różowy (zazwyczaj do 3 ml). Przybliżone p^H = 7.2.
   • Uwaga: Ważne jest, aby upewnić się, że medium/żel pozostaje obojętny lub lekko kwaśny, ponieważ fibroblasty nie spowodują skurczu żelu w warunkach nawet lekko zasadowych.
3. Poddać fibroblasty trypsynizacji, wirować przy 400 x g przez 5 min i usunąć nadsącz.
4. Podczas powyższego 5-minutowego wirowania: przygotować 12 plastikowych szalek o średnicy 35 mm – zazwyczaj z jednej kolby fibroblastów i mieszaniny kolagenu otrzymuje się 12 szalek.
5. Resuspendować fibroblasty w 3 ml FCS, natychmiast dodać do mieszaniny kolagenu i wymieszać.
6. Nanieść jak najszybciej około 2.5 ml kolagenu z fibroblastami na każdą szalkę. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza i przedwczesnego żelowania kolagenu.
7. Pozostawić kolagen do stężenia w temperaturze 37°C w uwilgotnionej atmosferze z 5% CO₂ w powietrzu przez 10 min.
8. Dodać 1ml pożywki do wzrostu fibroblastów (DMEM+ 10% FCS).
9. Odczepić macierz kolagenowo-fibroblastyczną od ścianek szalki za pomocą pipety.
10. Następnego dnia: dodać 1ml pożywki do wzrostu fibroblastów (DMEM + 10% FCS).
11. Wymieniać pożywkę co drugi dzień. Pozostawić macierz kolagenowo-fibroblastyczną do skurczenia się przez około 8 dni, aż zmieści się w płytce 24-dołkowej (skurczenie z ok. 3.5 cm do 1.5 cm średnicy, patrz Rycina 1).

Uwaga: Stężenie kolagenu powinno zostać dostosowane do konkretnego zastosowania. Im bardziej rozcieńczony jest roztwór kolagenu, tym szybciej zostanie on obkurczony przez fibroblasty. W przypadku różnych partii kolagenu o tym samym stężeniu mogą wystąpić niewielkie różnice w tempie obkurczania. Podobnie, różne hodowle fibroblastów będą obkurczać żele kolagenowe z różną prędkością, a im więcej fibroblastów będzie obecnych, tym szybciej będzie przebiegał proces obkurczania. Z tego powodu stężenie kolagenu oraz gęstość fibroblastów można dostosować w celu modyfikacji tempa obkurczania oraz końcowej gęstości żelu kolagenowego.

4. Etap II - Wysiewanie interesujących komórek na macierz

Uwaga: Przed użyciem wysterylizuj wszystkie pęsety i sprzęt etanolem.

1. Używając pęsety tępej, ostrożnie przenieś skurczoną macierz do płytki 24-dołkowej. Upewnij się, że nie uległa ona złożeniu.
2. Przygotuj zawiesinę wybranych komórek o stężeniu około 4 x 10⁴ /ml i nanieś 1ml (po trypsynizacji odwiruj komórki, aby usunąć trypsynę) na powierzchnię macierzy. Rzeczywista liczba potrzebnych komórek będzie różnić się w zależności od użytego typu komórek. Pożywka komórkowa powinna być standardową pożywką wzrostową dla badanych komórek.
3. Pozostaw komórki do czasu osiągnięcia konfluencji na powierzchni macierzy, co trwa zazwyczaj około 3-5 dni.

5. Etap III - Przenoszenie macierzy na siatkę w celu inwazji (około 0-21 dni)

1. Dotnij stalowe siatki, aby stworzyć statyw, a następnie wysterylizuj je w autoklawie przed użyciem (patrz Rysunek 2).
2. Umieść sterylną siatkę w szalce 6 cm, dodaj pożywkę do poziomu powyżej siatki (ok. 10,5 ml). Połóż macierz na siatce i delikatnie odessaj pożywkę tak, aby spód macierzy stykał się z cieczą, ale nie był w niej zanurzony. Jest to tzw. interfejs powietrze/ciecz, który tworzy gradient sprzyjający inwazji. Wymieniaj pożywkę co dwa dni (patrz Rysunek 2).
3. Obrazowanie kontekstowe żywych komórek z użyciem komórek fluorescencyjnych można przeprowadzić na tym etapie lub wcześniej. Skurczony lub włóknisty kolagen I można obrazować z wykorzystaniem generacji drugiej harmonicznej (SHG, patrz Rysunek 3). Stosując wzbudzenie wielofotonowe w połączeniu z detekcją szerokopolową, ustalono, że SHG można obrazować na głębokości co najmniej 100 μm w macierzy, podczas gdy komórki wykazujące ekspresję cytoplazmatycznego GFP można obrazować na głębokości co najmniej 200 μm.

Uwaga: W odniesieniu do ilościowej oceny inwazji, dzień umieszczenia macierzy na siatkach definiuje jako Dzień 0. Umieszczenie na siatkach generuje gradient pożywki hodowlanej, który sprzyja inwazji do macierzy. Próbki mogą być obrazowane w ciągu kolejnych 1 - 21 dni (lub dłużej), aby ocenić procesy biologiczne, takie jak inwazja, proliferacja, przeżywalność lub różnicowanie (Patrz lista referencyjna).

6. Etap IV - Fixacja

1. Do probówki typu Falcon należy dodać 5 ml 4% PFA.
2. Przenieść macierz na płaską powierzchnię. Przeciąć macierz na pół za pomocą nowego, czystego skalpela (ponieważ barwienie będzie wykonywane w przekroju poprzecznym), podnieść macierz skalpelem i przenieść do 4% PFA, pozostawiając do utrwalenia na noc.
3. Macierze organotypowe są teraz gotowe do barwienia wybranym przeciwciałem lub barwnikiem (patrz Rycina 3).

7. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1 Przykład kurczenia kolagenu typu I przez fibroblasty. Mieszanina fibroblastów i kolagenu z ogona szczura, oddzielona od płytki Petriego i pozostawiona do skurczenia w ciągu 6-8 dni.

Rycina 2 Przebieg analizy organotypowej. A, schemat układu i przebiegu hodowli organotypowej. BPrzykład matrycy kolagenowej/fibroblastycznej na sterylnym sitku ze stali nierdzewnej w celu stworzenia interfejsu powietrze-ciecz.

Rysunek 3 Zastosowania testu organotypowego. A, B nieinwazyjne i inwazyjne komórki gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) naciekające w czasie w macierzy organotypowej. C żywy ekwiwalent skóry wykazujący warstwową strukturę naskórka na włóknistym, skurczonym przez fibroblasty komponencie dermy kolagenowej. D komórki czerniaka C8161 naciekające włóknisty, skurczony przez fibroblasty ekwiwalent dermy kolagenowej. E inwazyjne komórki PDAC (zielone) oddziałujące i naciekające fibroblasty (czerwone) w macierzy organotypowej. F inwazyjne komórki PDAC (zielone) oddziałujące z degradującą otaczającą macierzą zewnątrzkomórkową (fioletową) zwizualizowaną przy użyciu wielofotonowej generacji drugiej harmonicznej.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę wytwarzania macierzy trójwymiarowej odpowiedniej do badań migracji komórek inwazyjnych ^6-8. Macierz składa się z włókien kolagenu typu 1, które są kurczone przez kilka dni przez pierwotne ludzkie fibroblasty naskórkowe. Kolagen jest przygotowywany poprzez ekstrakcję kwasową, a nie trawienie enzymatyczne, co pozwala zachować reaktywność na końcach polipeptydowych i sprzyja sieciowaniu włókien kolagenowych w większe agregaty po neutralizacji warunków buforu ⁹. Wynikiem jest zrekonstytuowany żel, który dokładniej naśladuje cechy kolagenu in vivo, co ma istotne znaczenie dla właściwości inwazyjnych komórek hodowanych w tych żelach. Nie ma znaczenia, czy użyty zostanie świeży, czy zamrożony materiał wyjściowy, jednak istotne jest wykorzystanie ogonów szczurów młodzieńczych, ponieważ sieciowanie kolagenu u młodszych zwierząt jest bardziej labilne. Kolagen I z młodszych zwierząt jest zatem łatwiejszy do ekstrakcji i rekonstytuuje się z większą wiernością.

Macierz kolagenową można utrwalić i barwić przeciwciałami skierowanymi przeciwko inwazyjnym komórkom nowotworowym lub fibroblastom zrazowym ^2,10, co jest niezwykle przydatne przy badaniu skuteczności leków, które mogą hamować inwazję ^5,6.

Choć niniejszy protokół sugeruje użycie pierwotnych ludzkich fibroblastów skóry, możliwe jest zastosowanie pierwotnych fibroblastów z innych typów tkanek, w zależności od rodzaju badanej tkanki. Możliwe jest również tworzenie kultur z użyciem fibroblastów unieśmiertelnionych, w tym komórek stabilnie transfekowanych koniugatami białek fluorescencyjnych. W ten sposób można znakować zarówno komórki zialne, jak i nowotworowe, aby zwizualizować interakcje międzykomórkowe podczas inwazji ¹¹.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x MEM	GIBCO, by Life Technologies	21430	-
NaOH	Sigma-Aldrich	367176-500G	Przygotować roztwór zapasowy 0,22 M w wodzie
FCS	PAA Laboratories	A15-101	-
Szkiełka 35 mm	Falcon BD	353001	Do etapu 3.4
Szkiełka 60 mm	Falcon BD	353004	Do etapu 5.2
Pinceta sprężynowa tępa	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	E003/02	Ząbkowana, nie gładka
16% paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	15710	Rozcieńczyć do 4% w PBS przed użyciem
Sita do cd-1, rozmiar 40 mesh	Sigma-Aldrich	S07707-5EA	Siatki ze stali nierdzewnej, 5 szt. w opakowaniu
Rurki do dializy	Medicell International	7607 2295	12 - 14 kD
PBS	Oxford Labware	BR0014G	-
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	242853	-
Płytka 24-dołkowa	Falcon BD	353047	Do etapu 4.1
Fungizone	Invitrogen	15290018	-