Opisano tutaj model zwierzęcy Spared Nerve Injury jako mysi model obwodowego bólu neuropatycznego po częściowej denerwacji nerwu kulszowego poprzez uszkodzenie gałęzi nerwu piszczelowego i wspólnego strzałkowego, przy zachowaniu nienaruszonego nerwu podszywkowego. Modyfikację behawioralną wynikającą z allodynii mechanicznej ilościowo określono za pomocą włókien von Freya.
Artykuł metodologiczny
Model Spared Nerve Injury (SNI) indukowanej allodynii mechanicznej u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obwodowy ból neuropatyczny to ciężki stan przewlekłego bólu, który może wynikać z urazu nerwów czuciowych w obwodowym układzie nerwowym. Model uszkodzenia oszczędzonego nerwu (SNI) wywołuje objawy bólu neuropatycznego, takie jak allodynia mechaniczna, czyli ból wywołany bodźcami dotykowymi, które normalnie nie wywołują bolesnej reakcji [1].
Model mysi SNI polega na podwiązaniu dwóch z trzech gałęzi nerwu kulszowego (nerwu piszczelowego oraz wspólnego nerwu strzałkowego), podczas gdy nerw suralny pozostaje nienaruszony [2]. Uszkodzenie to prowadzi do znacznej nadwrażliwości w bocznej części łapy, która jest unerwiona zachowanym nerwem suralnym. Nieoperowana strona myszy może służyć jako kontrola. Zaletami modelu SNI są stabilność odpowiedzi oraz brak konieczności posiadania eksperckich umiejętności mikrochirurgicznych.
Próg reakcji na ból mechaniczny określa się poprzez testowanie za pomocą włókien von Frey o rosnącej sile zginania, które są wielokrotnie dociskane do bocznej części łapy [3], [4]. Pozytywną reakcję bólową definiuje się jako nagłe cofnięcie łapy, wzdrygnięcie i/lub lizanie łapy wywołane przez włókno. Próg bólu definiuje się jako wystąpienie pozytywnej odpowiedzi w trzech z pięciu powtórnych bodźców.
Jak pokazano w protokole wideo, u myszy C57BL/6 występuje głęboka allodynia już dzień po zabiegu, która utrzymuje się przez kilka tygodni.
Protokół
1. Pomiary bazowe von Frey przed operacją
W celu zapoznania się z procedurą testu von Frey, należy przejść do sekcji 5.
2. Znieczulenie/przygotowanie
- Zanurz zwierzęta w narkozie (iniekcja domięśniowa mieszaniny 100mg/kg ketaminy i 15 mg/kg ksylazyny).
- Umieść zwierzę w cichym miejscu do czasu pełnego zniesienia czucia (np. przykryte ręcznikiem papierowym).
- Sprawdź odruchy, uciśnięcie końcówki ogona i łap pęsetą. Upewnij się, że zwierzęta nie reagują przed przystąpieniem do dalszych czynności.
- Wstrzyknij podskórnie (w okolicy łopatki) 0.5ml soli izotonicznej z antybiotykiem, np. ampicyliną (aby uniknąć odwodnienia i zapobiec infekcji, mimo że jest to drobny zabieg chirurgiczny).
- Za pomocą golarki elektrycznej wygol pole operacyjne od nieco poniżej kolana aż do biodra (osobom praworęcznym zaleca się lewą kończynę tylną).
- Nanieś maść oftalmiczną na oczy za pomocą patyczka z watą.
- Połóż zwierzę na prawym boku, a lewą kończynę tylną umieść na małej platformie, aby pozostała uniesiona. Przymocuj nogę taśmą klejącą.
- Zdezynfekuj pole operacyjne, naprzemiennie przecierając miejsce nacięcia i okolicę wokół niego etanolem oraz betadyną, kierując się od środka na zewnątrz.
3. Operacja
- Zlokalizuj kolano kciukiem lewej ręki i za pomocą skalpela wykonaj nacięcie o długości ok. 1 cm w kierunku podłużnym, proksymalnie względem kolana.
- Otwórz skórę poprzez rozwarstwienie tępe za pomocą czubka sterylnych nożyczek.
- Oddziel warstwę mięśniową poprzez rozwarstwienie tępe bezpośrednio obok wyraźnie widocznego naczynia krwionośnego, blisko kości udowej (femur). Jeśli czynność zostanie wykonana prawidłowo, warstwy mięśni łatwo się rozdzielą bez krwawienia, odsłaniając nerw kulszowy bezpośrednio pod mięśniami.
W przypadku wystąpienia krwawienia, np. wskutek uszkodzenia naczynia krwionośnego w pobliżu kolana, użyj sterylnych patyczków z watą lub kawałków gazy, aby wchłonąć krew. Uciskaj do czasu ustąpienia krwawienia. - Umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym i ostrożnie rozsuń mięśnie sterylną pęsetą (nr 2), aby uwidocznić nerw kulszowy. Można również zastosować rozieracze.
- Zidentyfikuj miejsce, w którym nerw łydkowy odgałęzia się od nerwu kulszowego. Nerw łydkowy jest najmniejszym z trzech odgałęzień; w lewej nodze odgałęzia się w prawo.
- Załóż szew (nici 6-0) wokół dwóch pozostałych gałęzi, które nadal biegną równolegle (nerwu piszczelowego i wspólnego nerwu strzałkowego), uważając, aby nie dotknąć gałęzi łydkowej. Jest to krytyczny etap, ponieważ nerw łydkowy musi pozostać całkowicie nienaruszony.
- Zwiąż ciasny węzeł chirurgiczny. Jeśli pierwszy węzeł zostanie zaciśnięty mocno, zaobserwowane zostaną skurcze kończyny.
- Chwyć nerwy przeznaczone do przecięcia poniżej szwu pęsetą (nr 5) i przetnij nerwy powyżej oraz poniżej pęsety małymi nożyczkami. Dzięki wykonaniu najpierw cięcia powyżej pęsety, unika się pociągania za nerwy.
- Odetnij końce nici mikro-nożyczkami i delikatnie zamknij warstwę mięśniową. Dodaj kroplę lidokainy do rany i zaszyj ją węzłami chirurgicznymi.
4. Po operacji
- Sprawdzić, czy ilość maści do oczu jest nadal wystarczająca.
- Umieścić mysz w czystej klatce na ręczniku papierowym w wygodnej pozycji. Jeśli w pomieszczeniu jest zimno, umieścić podgrzewacz pod częścią klatki (tylko pod częścią klatki, aby zwierzę mogło przenieść się w chłodniejsze miejsce, jeśli będzie tego potrzebować).
- Zapewnić łatwy dostęp do wody i karmy.
5. Test von Frey (poziom bazowy oraz od dnia następującego po operacji)
- Na dwa oraz jeden dzień przed operacją umieścić myszy w czerwonych plastikowych cylindrach ustawionych na stole z drucianej siatki. Przed rozpoczęciem testów poddać myszy 15-minutowej habituacji w cylindrach. Czerwony kolor cylindrów pomaga myszom szybciej się zrelaksować, ponieważ nie widzą one siebie nawzajem i znajdują się w ciemniejszym otoczeniu.
- Upewnić się, że myszy są spokojne, a następnie przyłożyć włókna von Frey do bocznej części łapy: zaczynając od włókna 0.02 g, przyłożyć siłę do lewej łapy pięć razy w całkowitym czasie 30 sekund (około 2 sekund na bodziec) i ocenić reakcję myszy po każdym przyłożeniu. Powtórzyć czynność z tym samym włóknem dla lewej łapy pozostałych myszy, a następnie rozpocząć procedurę od nowa dla prawej łapy pierwszej myszy przed przejściem do kolejnego włókna, np.:
- Mysz 1: lewa łapa 5 razy włóknem 0.02 g
- Mysz 2: lewa łapa 5 razy włóknem 0.02 g itd.
- Mysz 1: prawa łapa 5 razy włóknem 0.02 g
- Mysz 2: prawa łapa 5 razy włóknem 0.02 g itd.
- Mysz 1: lewa łapa 5 razy włóknem 0.04 g
- Mysz 2: lewa łapa 5 razy włóknem 0.04 g itd.
- Reakcję w trzech z pięciu bodźców uznaje się za wynik pozytywny. W celu weryfikacji poziomu progu można zastosować włókna o wartościach powyżej progu.
Reakcja = gwałtowne cofnięcie łapy, nagłe drgnięcie, gwałtowne lizanie łapy.
6. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Test Von Frey u myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni przeprowadzono 1 dzień przed operacją oraz wielokrotnie po zabiegu. W każdej grupie uwzględniono 4-8 zwierząt. Test Von Frey na stronie operowanej reprezentuje strona ipsilateralna, a nieoperowana strona kontrolna reprezentuje strona kontralateralna. Dzień po operacji u zwierząt rozwija się znaczna nadwrażliwość na operowanej łapie, podczas gdy strona nieoperowana jest jedynie lekko dotknięta w porównaniu z myszami po operacji pozorowanej. (* <0,05, **<0,01, ***<0,001, strona ipsilateralna względem kontralateralnej).
Dyskusja
Kluczowe etapy
Należy unikać uszkodzenia nerwu łydkowego, aby móc badać zmiany patologiczne w nienaruszonym nerwie łydkowym po urazie nerwu piszczelowego i wspólnego nerwu strzałkowego. Uboczne uszkodzenie nerwu łydkowego może prowadzić do paraliżu, co objawia się wleczeniem operowanej kończyny tylnej.
Tylko boczna strona łapy jest unerwiona przez zachowany nerw suralny, w związku z czym tylko ten obszar rozwija neuropatię. Badanie innych obszarów, unerwionych przez przecięte nerwy, może znacząco zaburzyć ocenę zmiany progu mechanicznego.
Możliwe modyfikacje
W badaniu patologicznych stanów bólowych po uszkodzeniu nerwów obwodowych uzupełniająco można zastosować inne rodzaje ligacji, takie jak przewlekłe uszkodzenie uciskowe (chronic constriction injury) [5] lub częściowa ligacja nerwu [6]. Każda procedura eksperymentalna prowadzi do odmiennych zmian fenotypowych, które należy uwzględnić przed przeprowadzeniem testów pooperacyjnych.
Ponadto można zastosować inne testy sensoryczne, takie jak hiperalgezja termiczna [7], choć fenotyp ten jest mniej wyraźny po SNI.
Przyszłe zastosowania
Tę technikę można wykorzystać do testowania leków modyfikujących rozwój lub utrzymywanie się allodynii mechanicznej [8]. Analiza nerwu kulszowego, zwojów korzeni grzbietowych (DRG) oraz/lub odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego pozwala na badanie mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za indukowany fenotyp.
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej, w pełnej zgodności z przepisami duńskimi i europejskimi. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez duński Inspektorat Doświadczeń na Zwierzętach przy Ministerstwie Sprawiedliwości (numer pozwolenia 2006/561-1206).
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez Lundbeck Foundation, Carlsberg Foundation oraz Dagmar Marshall Foundation.
Bibliografia
- Costigan, M., Scholz, J., Woolf, C. J. Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage. Annu. Rev. Neurosci. 32, 1-32 (2009).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87, 149-158 (2000).
- Bourquin, A. -F., Süveges, M., Pertin, M., Gilliar, N., Sardy, S., Davidson, A. C., Spahn, D. R., Decosterd, I. Assessment and analysis of mechanical allodynia-like behavior induced by spared nerve injury (SNI) in the mouse. Pain. 122, 14.e1-14.e14 (2006).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J. Neurosci. Methods. 53, 55-63 (1994).
- Bennett, G. J., Xie, Y. -K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33, 87-107 (1988).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43, 205-218 (1990).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutanous hyperalgesia. Pain. 32, 77-88 (1988).
- Erichsen, H. K., Blackburn-Munro, G. Pharmacological characterization of the spared nerve injury model of neuropathic pain. Pain. 98, 151-161 (2002).
Przedruki i uprawnienia
