Opisano metodę umożliwiającą bezpośrednią manipulację farmakologiczną embrionów myszy podczas neurulacji z pominięciem metabolizmu matczynego. Technikę tę można dostosować do badania różnych aspektów neurulacji poprzez zmianę punktu czasowego oraz zastosowanego czynnika farmakologicznego.
Artykuł metodologiczny
Zamykanie rurki neuralnej w kulturze całych embrionów myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Genetyczne modele mysie stanowią istotne narzędzie w badaniu zamykania rurki nerwowej u ssaków (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). Jednakże badanie embrionów myszy in utero jest ograniczone przez brak możliwości bezpośredniej manipulacji farmakologicznej embrionów w izolacji od wpływu metabolizmu matki na badany odczynnik. Niezależnie od tego, czy stosowana jest mała cząsteczka, białko rekombinowane czy siRNA, dostarczanie tych substancji matce – poprzez dietę lub wstrzyknięcie – naraża te niestabilne związki na szereg mechanizmów obronnych organizmu, co może uniemożliwić ich dotarcie do embrionu. Badania w kulturach całych embrionów mogą być wykorzystane do oddzielenia efektów macierzyńskich od wewnętrznych efektów płodowych w rozwoju.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę hodowli embrionów myszy z wykorzystaniem wysoko wzbogaconych mediów w inkubatorze obrotowym, która umożliwia prawidłowe zamknięcie rurki neuralnej po sekcji (Crockett, 1990). Po przeniesieniu do hodowli embriony mogą być manipulowane przy użyciu konwencjonalnych technik in vitro, co nie byłoby możliwe, gdyby embriony znajdowały się nadal in utero. Embriony z jednego miotu można pobierać w różnych punktach czasowych, aby badać różne aspekty neurulacji, zachodzącej od E7-7.5 (formowanie płytki neuralnej, tuż przed rozpoczęciem neurulacji) do E9.5-10 (po zakończeniu zamknięcia fałdów czaszkowych i neuroporu tylnego, Kaufman, 1992). W niniejszym protokole demonstrujemy metodę sekcji embrionów w punktach czasowych optymalnych dla badania neurulacji czaszkowej. Embriony zostaną wypreparowane w stadium E8.5 (ok. 10-12 somytów), po rozpoczęciu zamykania rurki neuralnej, ale przed obrotem embrionu i zamknięciem fałdów neuralnych czaszkowych, a następnie utrzymywane w hodowli do E10 (26-28 somytów), kiedy neurulacja czaszkowa powinna być zakończona.
Protokół
1. Przygotowanie pośrodków hodowlanych - wszystkie odczynniki wymieniono w Tabeli 1
- Rozmrozić surowicę szczura samca w temperaturze 37°C.
- Wyłączyć aktywność cieplną surowicy szczura przez 30 min w temperaturze 55°C.
- Odwirować surowicę szczura przy 10K przez 5 min w temperaturze pokojowej.
- Zebrać supernatant i zmieszać w stosunku 50:50 z DMEM w wysokim stężeniu glukozy bez czerwieni fenolowej.
- Zsterylizować medium za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 µm.
- Należy przygotować co najmniej 1 ml medium na jeden embrion.
2. Izolacja macicy od ciężarnej samicy
- Zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), ciężarną samicę najpierw znieczula się, a następnie uśmierca poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych
- Sterylizujemy brzuch za pomocą 70% EtOH
- Za pomocą dużych pęsety chwytamy niewielki fragment skóry wzdłuż linii środkowej, tuż nad linią sutków, i otwieramy jamę brzuszną pod pęsetą za pomocą dużych nożyczek. Należy uważać, aby nie uszkodzić struktur wewnętrznych
- Używając nożyczek, wykonujemy cięcia boczne od początkowego otworu w stronę każdej z stron ciała myszy, tak aby cały brzuch był otwarty
- Jelitka i nadmiar tkanki tłuszczowej mogą często zasłaniać macicę; należy je odsunąć, aby górna część macicy i jajniki były widoczne po obu stronach
- Chwytamy górną część macicy poniżej jajników i za pomocą nożyczek oddzielamy macicę od tkanki tłuszczowej, przecinając ją od jednego końca macicy do drugiego jajnika
- Wyjmujemy macicę pęsetą i umieszczamy ją w czarce Petriego z solą fizjologiczną
3. Usuwanie zarodków z macicy
- Przepłucz macicę solą fizjologiczną, aby usunąć nadmiar krwi, a następnie odetnij nadmiar tłuszczu z zewnętrznej strony
- Przenieś preparat do czystego naczynia z roztworem Tyrodesa o temperaturze pokojowej w celu poprawy widoczności
- Używając stereomikroskopu, odseparuj każdy embrion za pomocą małych nożyczek lub, jeśli jest to konieczne, precyzyjnej pęsety (rozmiar #5), aby ostrożnie rozdzielić ścianę macicy
- Wsuń precyzyjną pęsetę w przestrzeń między ścianą macicy a błoną decydualną i odsunąć ścianę macicy, uważając, aby nie przebić embrionu
4. Usuwanie błony podstawnej z embrionów
- Ustaw deciduę tak, aby ciemniejsza część (łożysko) była odwrócona od Ciebie
- Za pomocą pincety wykonaj nacięcie wzdłuż linii oddzielającej ciemną część decidui od części jaśniejszej, uważając, aby nie naciąć tkanki zbyt głęboko
- Dokończ oddzielenie łożyska od górnej części pęcherzyka żółtkowego, uważając, aby nie przerwać stożka ektoplacentalnego (EPC). Na tym etapie powinna być widoczna błona Reicherta na pęcherzyku żółtkowym
- Kontynuuj usuwanie całej decidui (części jaśniejszej), uważając, aby nie przebić pęcherzyka żółtkowego
- Delikatnie chwyć i usuń błonę Reicherta, odrywając ją od EPC. Jeśli EPC zostanie uszkodzone lub oddzielone od pęcherzyka żółtkowego, zarodki nie obrócą się prawidłowo w okresie E8.5-E9.5
- Po usunięciu błony Reicherta zarodek powinien być łatwo widoczny przez pęcherzyk żółtkowy; jego stadium można określić poprzez policzenie somytów.
5. Konfiguracja systemu hodowli
- Odciąć końcówkę plastikowej pipety transferowej nożyczkami, aby zwiększyć średnicę otworu, co umożliwi pobranie zarodka bez uszkodzenia pęcherzyka żółtkowego
- Napełnić czyste butelki walcowe 1 ml pożywki na jeden zarodek. W zależności od rodzaju użytych butelek walcowych, do każdej butelki można wprowadzić maksymalnie 3-6 zarodków.
- Przenieść zarodki za pomocą przyciętej pipety do butelki walcowej wypełnionej pożywką, przenosząc jak najmniejszą ilość roztworu Tyrodes, aby nie rozcieńczać pożywki
- Zamknąć szklaną butelkę walcową od góry gumowym korkiem
- Włożyć butelki walcowe do bębna inkubatora walcowego w taki sposób, aby między korkiem a bębnem wytworzyła się szczelna społeczność
- Po umieszczeniu wszystkich butelek i zabezpieczeniu pustych miejsc w bębnie gumowymi zatyczkami, uruchomić urządzenie walcujące
- Otworzyć butle z CO2 i O2 i ustawić ciśnienie na około 2 psi, tak aby zawór wylotowy uwalniał jedną bańkę na sekundę. Dla zarodków w stadiach E8.5-E10 należy zastosować 20% O2 i 5% CO2.
- Upewnić się, że inkubator jest ustawiony na 37°C, a następnie przykryć lub zamknąć inkubator, aby osłonić zarodki przed światłem.
- Należy okresowo sprawdzać zarodki, aby ocenić ich rozwój na podstawie liczby somytów, postępu obracania oraz stopnia zamknięcia rurki neuralnej
- Po 2-3 godzinach hodowli do pożywki można dodać inhibitory farmakologiczne lub inne czynniki
- Projekt badania powinien obejmować grupy kontrolne, takie jak grupa z samym nośnikiem lub nieaktywnymi analogami odczynnika badawczego.
6. Ocena rozwoju po hodowli całego zarodka
- Wyłączyć gaz, zatrzymać wałki i wyjąć fiolki z inkubatora
- Przenieść zarodki z powrotem do roztworu Tyrodes lub PBS do szalki Petriego w celu oceny pod stereomikroskopem
- Worek żółtkowy powinien przypominać balon, widoczne powinno być bicie serca z częstotliwością >120 uderzeń na minutę oraz widoczny powinien być krwiobieg
- W razie potrzeby sfotografować zarodki przed usunięciem worka żółtkowego
- Usunąć worek żółtkowy z zarodka, wycinając otwór w pobliżu EPC i przekładając worek żółtkowy oraz błonę owodniową nad głową i tylną częścią zarodka
- Można przeciąć pępowinę, aby oddzielić worek żółtkowy od zarodka; worek żółtkowy można wykorzystać do genotypowania zarodka, jeśli jest to konieczne
- Zbadać zarodek pod kątem liczby somytów i wad cewy nerwowej, takich jak otwarte fałdy czaszkowe, niepełne zamknięcie twarzy i/lub otwarty tylny neuropor. Zarodki można klasyfikować zgodnie z klasyfikacją Theilera opartą na wielokrotnych zmianach morfogenetycznych (http://www.emouseatlas.org/ emap/home.html). Ponownie, przydatne jest sporządzenie dokumentacji fotograficznej rozwoju zarodka
7. Uwagi
- Wysoka jakość sekcji jest kluczowa, ponieważ każde nacięcie lub rozdarcia pęcherzyka żółtkowego uniemożliwią pomyślne odwrócenie i zahamują prawidłowy rozwój. EPC może zostać również uszkodzone podczas usuwania błony Reicherta (RM), a jeśli EPC zostanie choćby częściowo oddzielone od pęcherzyka żółtkowego, embriony nie będą rozwijać się prawidłowo. Z kolei niepełne usunięcie RM może spowodować zlepianie się embrionów i/lub nadmierny rozrost komórek RM w kulturze, co ograniczy ekspansję pęcherzyka żółtkowego; oba te czynniki uniemożliwią prawidłowy rozwój.
- Kluczem do dobrej sekcji są czyste i ostre pęsety, ponieważ tępe lub wygięte narzędzia znacząco utrudniają procedurę. Osady białkowe na instrumentach prowadzą do uszkodzenia tkanek.
- Czyste, sterylne szklane butelki są również niezbędne, aby zapobiec przywieraniu embrionów do ścianek i ich uszkadzaniu. Przed rozpoczęciem eksperymentu butelki należy wyszorować wodą z mydłem, wypłukać w dH2O i podgrzać w kuchence mikrofalowej z niewielką ilością wody w każdej z nich, aż do zagotowania wody. Następnie butelki płucze się 70% EtOH i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu.
- Należy pracować tak szybko, jak to możliwe, ponieważ im szybciej embrion zostanie przeniesiony do pożywki hodowlanej i rozgrzany do 37°C, tym większa jest przeżywalność.
- Należy zakończyć sekcję całego miotu przed przeniesieniem jakichkolwiek embrionów do butelek z wałkami, aby każdy embrion pozostawał w temperaturze pokojowej przez ten sam czas, co pozwoli uniknąć rozbieżności w tempie wzrostu embrionów.
- Należy utrzymać sterylne środowisko, aby zapobiec kontaminacji bakteryjnej kultur. Nasze eksperymenty hodowlane były przeprowadzane bez użycia antybiotyków, jednak wiele laboratoriów dodaje antybiotyki do pożywek w celu zapobiegania wzrostowi bakterii. Pożywka pod koniec eksperymentu powinna być tak samo przejrzysta, jak na jego początku. Jeśli pożywka stała się mętna lub widoczny jest osad, prawdopodobnie doszło do kontaminacji kultury.
- Nieefektywna wymiana gazowa może również opóźnić rozwój embrionów, dlatego należy upewnić się, że dysponuje się niezawodnym regulatorem, który zapewni ciągłość dostaw.
- Embriony rozwijają się w kulturze ex vivo około 50% wolniej, dlatego niezbędne jest liczenie somytów, aby upewnić się, że osiągnięto odpowiedni etap rozwoju dla ukończenia eksperymentu.
8. Reprezentatywne wyniki:
Wygląd embrionów przed i po hodowli w rolce przedstawiono na Ryc. 1. W momencie sekcji embriony powinny znajdować się w konfiguracji przed obrotem (Ryc. 1A,D), w której ogon znajduje się za fałdami głowymi. Po 36 h hodowli embriony powinny zakończyć obrót, przyjmując pozycję płodową w kształcie litery C, gdzie ogon znajduje się przed głową (Ryc. 1B,C,E,F). Manipulacja farmakologiczna z użyciem inhibitora kinazy RhoA (Y-27632), znanego inhibitora konwergentnego wydłużania podczas neurulacji (Ybot-Gonzalez, 2007), prowadzi do skrócenia embrionów wzdłuż osi rostralno-kaudalnej (Ryc. 1E,F) i hamuje zamknięcie przednich fałdów neuronalnych. Nasze dane pokazują, że zwiększające się dawki Y-27632 progresywnie upośledzają zamykanie fałdów przednich (Ryc. 2A) i skracają oś ciała (Ryc. 2B), co jest zgodne z rolą sygnalizacji RhoA w neurulacji przedniej i konwergentnym wydłużaniu.
Rycina 1. Wygląd hodowli zarodków i manipulacja z użyciem inhibitora farmakologicznego Y-27632. (A,D) Wypreparowane zarodki w stadium E8.5 przed rozpoczęciem hodowli całych zarodków. (B,E) Zarodki w stadium E10 z nienaruszoną jamą żółtkową po 36h hodowli w rotatorze. (C,F) Usunięto jamę żółtkową, aby zilustrować prawidłowe obrócenie i zamknięcie rurki neuralnej. Zarodki poddane działaniu inhibitora kinazy Rho Y-27632 (E,F) nie przeszły prawidłowej konwergentnej elongacji, co objawia się skróceniem osi ciała.
Rycina 2. Wpływ inhibitora kinazy RhoA na zamknięcie przedniej części rurki neuralnej oraz wydłużenie osi ciała. (A) Procent zarodków, które pomyślnie zamknęły fałdy przedniej części rurki neuralnej (%NTC = procent zamknięcia rurki neuralnej) w zależności od dawki Y-27632 dodanej do pożywki hodowlanej. (B) Odległość między pęcherzykiem słuchowym a przednią kończyną była istotnie zredukowana przy zwiększających się dawkach Y-27632 (p<.05).
Dyskusja
Zdolność do oddzielenia czynników macierzystych, wewnątrzmacicznych, od czynników wewnątrzpochodnych dla embrionu podczas jego rozwoju, stanowi istotne narzędzie w badaniu wszystkich etapów embriogenezy. W niniejszej pracy przeanalizowano wpływ małocząsteczkowego inhibitora kinazy RhoA na neurulację czaszki ex utero, co pozwoliło wyeliminować zmienną w postaci macierzystego metabolizmu leku. Ta manipulacja farmakologiczna wywiera głęboki wpływ na neurulację czaszki oraz konwergentną elongację. Wrażliwość na ten związek można porównywać pomiędzy różnymi genetycznymi mutantami myszy. Przedstawiona tutaj metoda może być również zastosowana w badaniach nad innymi szlakami molekularnymi w rozwoju, umożliwiając bezpośrednią manipulację funkcjami komórkowymi w embrionach przy użyciu różnych odczynników.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Pragniemy podziękować laboratorium A. Hadjantonakisa (Sloan-Kettering Institute) oraz laboratorium L. Niswander (U of Colorado-Denver) za pomocne wskazówki dotyczące technik sekcji i hodowli. Praca ta była wspierana przez granty NRSA NS059562 dla JDG oraz RO1NS05897 dla MER we współpracy z L. Niswander i J. Nadeau (Institute for Systems Biology).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stereomikroskop do sekcji | Leica Microsystems | M165 | |
| Precyzyjny inkubator | BTC Engineering | BTC 001 | |
| Urządzenie do rotujących kultur w butelkach | BTC Engineering | BTC 003 | |
| Szklane butelki do urządzenia rotacyjnego | BTC Engineering | BTC 005 | |
| Silikonowy korek gumowy (bung) | BTC Engineering | BTC 007 | |
| Silikonowy korek gumowy | BTC Engineering | BTC 008 | |
| Wlot do przepłukiwacza gazowego | BTC Engineering | BTC 012 | |
| Pułapka wlotowa przepłukiwacza gazowego | BTC Engineering | BTC 013 | |
| Wylot z przepłukiwacza gazowego | BTC Engineering | BTC 014 | |
| Butla z gazem | Tech Air | 20% O2, 5% CO2 | |
| Regulator gazu | Tech Air | ||
| Surowica szczura samca | Harlan Laboratories | 4520 | |
| DMEM bez czerwieni fenolowej | Invitrogen | 31053 | |
| Strzykawka 10 mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Filtr strzykawkowy | Nalge Nunc international | 190-2545 | |
| Duże nożyczki sekcyjne (tępe końce) | VWR international | 82027-594 | |
| Ekstra precyzyjne nożyczki Bonn | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Pinceta Dumot #5 | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Sól fizjologiczna Tyrodeo’s | Opisana w Cockroft 1990 | ||
| Jednorazowa płytka Petri 10 cm | BD Biosciences | 351029 |
Bibliografia
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).
- Gray, J. D., Ross, M. E. Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice. Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).
- Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure. Development. 134, 789-799 (2007).
- Ross, M. E. Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).
Przedruki i uprawnienia
