Bezpośrednia stereotaktyczna infuzja białek beta amyloidu w mózgu dla modelu choroby Alzheimera

Streszczenie

Źródło: Jean, Y. Y. et al., Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film demonstruje precyzyjną stereotaktyczną infuzję beta amyloidu do zakrętu zębatego w celu stworzenia mysiego modelu choroby Alzheimera. Dokładne określenie współrzędnych i kontrolowane dostarczanie białek beta amyloidu powoduje degradację neuronów, zakłócając przetwarzanie pamięci i przyczyniając się do rozwoju choroby Alzheimera.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych i rozwiązań do operacji

1. Autoklaw wszystkich narzędzi chirurgicznych ze stali nierdzewnej.
2. Przygotuj 70% etanolu, rozcieńczając 200-procentowy etanol absolutny sterylną dejonizowaną wodą dejonizowaną klasy molekularnej.
3. Umieścić igłę 29 G w strzykawce Hamiltona. Wyczyść wnętrze strzykawki i igły Hamiltona, pobierając i wyrzucając nanoczystą wodę kilkakrotnie przez 1 minutę. Powtórz tę procedurę z 70% etanolem.
   1. Wyjąć tłok i igłę ze strzykawki Hamiltona. Wysuszyć części na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym O/N.
   2. Naświetlić igłę i strzykawkę światłem ultrafioletowym przez 30 minut przed użyciem.
4. Przygotować roztwór soli fizjologicznej, rozpuszczając chlorek sodu (NaCl) w wodzie molekularnej do końcowego stężenia wagowo-objętościowego 0,9%. Wysterylizuj roztwór, filtrując go przez filtr porowy 0,2 μm.

2. Przygotuj oligomeryczny beta-amyloid (Aβ1-42)

1. Monomeryzacja i ponowne zawieszenie rekombinowanego ludzkiego Aβ1-42 w dimetylosulfotlenku (DMSO) do 5 mM dokładnie tak, jak opisano w publikacji Fa' i innych.
2. Rozcieńczyć 5 mM Aβ1-42 sterylną (1x) solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 100 μM w dniu poprzedzającym zabieg.
3. Dobrze wymieszać roztwór przez rozcieranie.
4. Inkubować roztwór Aβ1-42 przez 12 godzin w temperaturze 4°C.
   nuta: Roztwory kontrolne, takie jak rozcieńczanie DMSO w PBS lub zaszyfrowany/odwrócony peptyd Aβ1-42, należy przygotować w taki sam sposób jak Aβ1-42.

3. Określ współrzędne iniekcji

1. Użyj atlasu mózgu dorosłej myszy, aby określić dokładne współrzędne przednio-tylne (AP), przyśrodkowo-boczne (ML) i grzbietowo-brzuszne (DV) dla interesującego nas obszaru mózgu.
   nuta: Aby zilustrować tę technikę, jako cel wybraliśmy zakręt zębaty hipokampa o następujących współrzędnych z bregmy: AP, -2,00 mm; ML, ±1,3 mm; DV, -2,2 mm. Znak ujemny poprzedzający wartość AP wskazuje, że znajduje się on 2,00 mm za bregmą. Znak ± poprzedzający wartość ML wskazuje kierunek w lewo i w prawo od środka. Wreszcie, znak ujemny poprzedzający DV wskazuje, że porusza się on brzusznie od powierzchni mózgu.

4. Stereotaktyczne ustawienie ramki

1. Noś chirurgiczną maskę na twarz, czysty fartuch laboratoryjny i sterylne rękawice chirurgiczne.
2. Przetrzyj instrument stereotaktyczny i adapter myszy 70% etanolem.
3. Połóż sterylną serwetkę chirurgiczną na blacie.
4. Umieść instrument stereotaktyczny z adapterem myszy na sterylnym serwety chirurgicznej.
5. Przetrzyj poduszkę grzewczą myszy 70% etanolem. Umieść poduszkę grzewczą nad stereotaktycznym łóżkiem ramy. Użyj uniwersalnej taśmy do etykietowania laboratoryjnego, aby przykleić poduszkę grzewczą do łóżka adaptera myszy.
   1. Przymocuj poduszkę grzewczą do pompy recyrkulacyjnej ciepłej wody zgodnie ze wskazówkami producenta.
   2. Włącz pompę recyrkulacyjną ciepłej wody, ustaw temperaturę na 37 °C i poczekaj, aż osiągnie tę temperaturę.
6. Strzykawkę Hamiltona o pojemności 50 μl z igłą 29 G przymocować do ramy stereotaktycznej, przykręcając ją do zmotoryzowanego pionowego wału wtryskowego zgodnie ze wskazówkami producenta.
7. Włącz sterylizator do koralików i poczekaj, aż osiągnie temperaturę zadaną przez producenta.
   nuta: Służy do sterylizacji narzędzi ze stali nierdzewnej między zwierzętami. Do sterylizacji narzędzia potrzebują 20 sekund kontaktu z kulkami.
8. Włącz płytę grzejną, ustaw ją na 42 °C i umieść na niej czystą, pustą klatkę.
9. Podczas gdy strzykawka Hamiltona jest zamocowana na ramie stereotaktycznej, użyj zmotoryzowanego wtryskiwacza stereotaktycznego, aby pobrać roztwór Aβ1-42.
   nuta: Pobrać więcej niż 4 μl roztworu do strzykawki, a następnie użyć wstrzykiwacza stereotaktycznego, aby ustawić objętość wstrzykiwanego roztworu. Eksploatuj wtryskiwacz zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Przygotowanie zwierząt

1. Określ wagę myszy za pomocą wagi.
2. Znieczulić mysz koktajlem ketaminy/ksylazyny w dawce 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP). Monitoruj głębokość znieczulenia przez utratę odruchu szczypania palców u stóp.
3. Po uspokojeniu myszy weź maszynkę do strzyżenia włosów i ogol jej głowę, aby odsłonić skórę nad czaszką.
4. Umieść mysz na poduszce grzewczej na łóżku stereotaktycznym.
5. Użyj szpatułki, aby otworzyć usta i umieść siekacze wewnątrz osłony zębów. Przymocuj końcówkę do nosa na pysku myszy. Zaciśnij go delikatnie i niezbyt mocno.
6. Umieść obustronne poprzeczki uszne w przewodzie słuchowym, aby zabezpieczyć głowę. Przesuń każdą poprzeczkę, aż uderzy w czaszkę, a następnie przekręć, aby ją zablokować.
   1. Aby upewnić się, że głowa jest zabezpieczona, delikatnie dociśnij głowę palcem wskazującym. Jeśli głowica jest odpowiednio zabezpieczona, nie podda się ani nie poruszy po naciśnięciu.
7. Nałóż kroplę kremu pod oczy lub kroplę do oczu na oczy, aby utrzymać je nawilżone. Upewnij się, że oczy są wilgotne przez cały zabieg chirurgiczny.
8. Aby zdezynfekować miejsce operacji, użyj sterylnych wacików bawełnianych, aby nałożyć roztwór betadyny na skórę nad czaszką, a następnie 70% etanolu. Wykonaj naprzemienne czyszczenie betadyną i 70% etanolem jeszcze 2 razy.

6. Chirurgia i infuzja

1. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie 2-3 mm w linii środkowej skóry głowy, a następnie użyj prostych cienkich nożyczek, aby przedłużyć linię nacięcia do 1,0-1,5 cm, aby odsłonić szew strzałkowy, bregmę i lambdę czaszki, punkty orientacyjne, na których oparte są współrzędne stereotaktyczne. Użyj mikro zacisków, aby utrzymać skórę z dala od siebie.
   nuta: Pozycje bregma i lambda są wyjaśnione w atlasie mózgu myszy "The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates".
2. Weź bawełniany wacik, namocz go w sterylnym roztworze soli fizjologicznej i użyj go do oczyszczenia czaszki. Następnie użyj czystego, suchego bawełnianego wacika, aby wysuszyć czaszkę.
3. Użyj sterylnego cienkiego pisaka, aby zaznaczyć kropkę na bregmie. Użyj stereotaktycznego mikromanipulatora, aby ustawić strzykawkę Hamiltona tak, aby końcówka igły dotykała kropki na bregmie.
   1. Zapisz współrzędną DV.
   2. Aby sprawdzić, czy oś AP czaszki jest wypoziomowana, przesuń strzykawkę Hamiltona do tyłu, tak aby końcówka igły dotykała punktu lambda.
   3. Zapisz pozycję DV. Upewnij się, że współrzędne DV dla bregmy i lambdy mieszczą się w zakresie 0.5 mm.
      nuta: Celem jest zminimalizowanie różnicy DV między bregmą a lambdą.
4. Użyj mikromanipulatora, aby przywrócić końcówkę igły strzykawki Hamilton z powrotem do kropki bregma.
5. Zapisz początkową pozycję AP.
6. Oblicz końcową pozycję AP, odejmując 2,00 mm od początkowej współrzędnej AP.
7. Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć igłę strzykawki Hamiltona na ostateczną współrzędną AP.
8. Zapisz bieżącą współrzędną uczenia maszynowego.
9. Oblicz lewą i prawą końcową współrzędną ML, dodając lub odejmując 1.3 mm od początkowej współrzędnej ML.
10. Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć igłę strzykawki Hamiltona do końcowej współrzędnej ML.
    1. Przyłóż końcówkę igły do powierzchni czaszki na obu końcowych współrzędnych ML i zapisz współrzędne DV i upewnij się, że wartości mieszczą się w granicach 0.5 mm.
       UWAGA: Celem jest zminimalizowanie różnicy DV między dwiema końcowymi współrzędnymi ML.
    2. Będąc na współrzędnej końcowej, pociągnij igłę w górę 0,5-1 cm nad czaszką. Weź sterylny cienki długopis, aby zaznaczyć kropkę na powierzchni czaszki. Powtórz ten krok dla przeciwległej strony czaszki.
11. Odsuń strzykawkę Hamiltona na bok.
12. Przymocuj głowicę wiertarską 0.8 mm do wiertła. Weź wiertło obiema rękami, ustaw łokcie na powierzchni stołu, aby zapewnić stabilność, i umieść głowicę wiertarską nieco powyżej kropki sharpie na lewej lub prawej współrzędnej ML. Aktywuj wiertło, opuść końcówkę wiertła na powierzchnię czaszki, aby wprowadzić otwór w czaszce. Powtórz ten krok dla strony przeciwnej.
    nuta: Z nowo wprowadzonych otworów może wystąpić pewne krwawienie. Jeśli wystąpi krwawienie, użyj czystego, suchego bawełnianego wacika, aby przetrzeć krew.
13. Przesunąć strzykawkę Hamiltona z powrotem na miejsce nad jednym z nowo wprowadzonych otworów ML. Opuść igłę Hamiltona tuż za czaszką. W tym momencie należy uważać, aby nie przebić mózgu. Aby upewnić się, że igła przeszła przez czaszkę, weź palec wskazujący i delikatnie dociśnij igłę do czaszki, aby upewnić się, że igła nie wyjdzie z otworu.
14. Zapisz początkową współrzędną DV.
15. Oblicz końcową współrzędną DV, odejmując 2,2 mm od początkowej współrzędnej DV.
16. Opuść wskazówkę w dół do końcowej współrzędnej DV.
17. Aktywuj stereotaktyczną pompę wtryskiwacza, aby wpompować 4 μl Aβ1-42 do zakrętu zębatego z szybkością 0,5 μl/min.
18. Po zakończeniu infuzji pozostaw igłę na miejscu przez dodatkowy 1 minutę, aby zminimalizować cofanie się roztworu z miejsca wstrzyknięcia.
19. Przesuń igłę na drugą stronę mózgu i powtórz kroki 6.13-6.18.

7. Usuwanie zwierząt i opieka pooperacyjna

1. Odkręć nauszniki i osłonę twarzy/nosa. Wyjmij mysz z urządzenia.
2. Użyj standardowych kleszczyków studenckich, aby zbliżyć skórę głowy, a następnie uszczelnić ranę szwem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ketamina HCl (100mg/ml)	Henry Schein Medycyna	1049007	100 mg ketaminy na 1 kg zwierzęcia
Ksylazyna (20 mg / ml)	Henry Schein Medycyna	niedostępne	10 mg ksylazyny na 1 kg zwierzęcia
Aβ1-42	David Teplow/Uniwersytet Kalifornijski w Los Angeles	niedostępne	100 μM; Ten amyloid został wykorzystany w pracy
Aβ1-42	Bachem	H-1368	Może być stosowany zamiast amyloidu z laboratorium Teplow
Aβ1-42	Peptyd amerykański	62-0-80B	Może być stosowany zamiast amyloidu z laboratorium Teplow
Zaszyfrowany Aβ1-42	Peptyd amerykański	62-0-46 mld	Może być stosowany jako peptyd kontrolny do porównywania Aβ1-42
GenTeal Lubricant Żel pod oczy	Novartis	niedostępne	Do utrzymywania wilgotności oczu myszy podczas operacji; można je znaleźć w lokalnych aptekach
Krople do oczu Refresh Optive Lubricant	Alergik	niedostępne	Do utrzymywania wilgoci w oczach myszy podczas operacji; można je znaleźć w lokalnych aptekach; Może być stosowany zamiast GenTeal
Betadine (Betadyna)	Stoelting (Stoelting)	Numer katalogowy: 50998	Do odkażania i dezynfekcji
Szpatułka okrągła/stożkowa	Firma VWR	Numer katalogowy: 82027-490	Do otwierania pyska zwierzęcia
Zaciski Bulldog Serrefines (wymiary szczęk 9X1,6mm; Długość 28mm)	Narzędzia naukowe	Lata 18050-28	fakultatywny; Do utrzymywania skóry głowy w rozkroku podczas wstrzykiwania
Proste cienkie nożyczki (krawędź tnąca 25mm; Długość 11,5cm)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14060-11	Do strzyżenia skóry głowy
#3 Rękojeść skalpela	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 10003-12
#11 Ostrze chirurgiczne	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 10011-00	Do wykonywania nacięć skóry głowy
Kleszczyk studencki o standardowym wzorze (końcówka wym. 2,5x1,5mm; Długość 11,5cm)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 91100-12	Do przytrzymywania zamkniętej skóry głowy podczas szycia
Zestaw trymera Combo	Naukowy Kent	CL9990-1201	Do golenia włosów
Recyrkulator ciepłej wody T / Pump	Naukowy Kent	TP-700	Do ogrzewania zwierzęcia podczas operacji
Podkładka do wydobywania wojennego wielokrotnego użytku (5" x 10")	Naukowy Kent	TPZ-0510MES	Do podłączenia go do recyrkulatora ciepłej wody T/Pump w celu ogrzania zwierzęcia podczas operacji
Akumulatorowa mikrowiertarko-wkrętarka	Stoelting (Stoelting)	Numer katalogowy: 58610	Użyj stalowych zadziorów o średnicy 0,8 mm, aby wywiercić otwory w czaszce
Standardowy laboratoryjny instrument stereotaktyczny z adapterem myszy i szczura noworodkowego	Stoelting (Stoelting)	Numer katalogowy: 51615
Tylko dla instrumentu stereotaktycznego myszy	Stoelting (Stoelting)	Numer katalogowy: 51730	Można go użyć zamiast Stoelting Cat. #51615
Kwintesencja wtryskiwacza stereotaktycznego	Stoelting (Stoelting)	Numer katalogowy: 53311
Sterylizator suchych szklanych kulek	Stoelting (Stoelting)	Numer katalogowy: 50287	Do sterylizacji narzędzi ze stali nierdzewnej
Sterylna serweta chirurgiczna (18" x 26")	Stoelting (Stoelting)	Numer katalogowy: 50981
Strzykawka Hamilton 50 ml, model 705 RN SYR, NDL	Firma Hamilton	7637-01	Do wstrzykiwania mózgu należy używać różnych strzykawek do różnych roztworów
Igła o rozmiarze 29, mała piasta RN NDL	Firma Hamilton	Zobacz materiał 7803-06	Do podłączenia do strzykawki Hamilton do wstrzykiwania mózgu
1 ml strzykawki tuberkulinowe BD	Firma VWR	BD309659	Do podawania znieczulenia i soli fizjologicznej
Igła o rozmiarze 30 (0,5 cala)	Firma VWR	BD305106	Do podawania znieczulenia i soli fizjologicznej
Przenośna elektroniczna waga serii CS (Ohaus)	Firma VWR	Nr kat. 65500-202	Do ważenia zwierząt w celu ustalenia dawki znieczulenia
Płyta grzejna (płyta górna przyciemniona 7,25 x 7,25 cala)	Firma VWR	Numer telefonu 47751-148	Do rozgrzewania zwierząt po operacji
Sofsilk Jedwab Szew C-1 Cięcie 3/8, 12 mm	Wirus Covidien	Zobacz materiał S1173	Do zamykania rany
Klej do tkanek Vetbond (3M)	Biotechnologia Santa Cruz	SC-361931	Opcjonalnie: do pomocy w zamykaniu ran; Stosować ze szwem.
Sterylne aplikatory z drewnianą końcówką z bawełnianą końcówką	Fisher naukowy	22-029-488	Do oczyszczania i suszenia ran pooperacyjnych
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus	Fisher Naukowy	Numer katalogowy 12-550-15	Do zbierania skrawków mózgu
Szklana szklana osłona VWR Micro 24 x 50 mm	Firma VWR	48393241	Do montażu szkiełek mikroskopowych
Filtr strzykawkowy Thermo Scientific Nalgene 0,2 μm	Fisher Naukowy	194-2520	Do sterylizacji roztworu soli fizjologicznej
Sterylne markery do skóry z podwójną końcówką firmy Viscot Medical	Linia medline	VIS1422SRL91	Do oznaczania współrzędnych na czaszce

powiedział: TGL powiedział: