Komórkowy test wapniowy do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych funkcji kanałów TRP przy użyciu FlexStation 3

Podsumowanie

Ten film zawiera szczegółowy protokół do badania profilu farmakologicznego ludzkich kanałów TRPA1 za pomocą FlexStation 3. Protokół zawiera szczegółowe informacje na temat przygotowania komórek, ładowania barwnika i działania czytnika mikropłytek FlexStation 3.

Streszczenie

FlexStation 3 firmy Molecular Devices to stacjonarny, wielomodowy czytnik mikropłytek, zdolny do automatycznego pomiaru fluorescencji na płytkach wielodołkowych. Idealnie nadaje się do ekranów o średniej i wysokiej przepustowości w środowisku akademickim. Posiada zintegrowany moduł transferu płynów wyposażony w wielokanałowy pipeter, a maszyna odczytuje jedną kolumnę na raz w celu monitorowania zmian fluorescencji różnych odczynników fluorescencyjnych. Na przykład FlexStation 3 został wykorzystany do zbadania funkcji przepuszczalnych dla Ca²⁺ kanałów jonowych i receptorów sprzężonych z białkiem G poprzez pomiar zmian wewnątrzkomórkowych poziomów wolnego Ca²⁺. Kanały przejściowego potencjału receptorowego (TRP) to duża rodzina nieselektywnych kanałów kationowych, które odgrywają ważną rolę w wielu funkcjach fizjologicznych i patofizjologicznych. Większość kanałów TRP jest przepuszczalna dla wapnia i indukuje napływ wapnia po aktywacji. W tym filmie pokazujemy zastosowanie FlexStation 3 do badania profilu farmakologicznego kanału TRPA1, czujnika molekularnego dla wielu szkodliwych bodźców. Komórki HEK293 przejściowo lub stabilnie eksprymujące ludzkie kanały TRPA1, hodowane na 96-dołkowych płytkach, są ładowane wrażliwym na Ca^{2 +} barwnikiem fluorescencyjnym, Fluo-4, a zmiany fluorescencji w tych komórkach w czasie rzeczywistym są mierzone przed i podczas stosowania agonisty TRPA1 przy użyciu trybu FLEX FlexStation 3. Zbadano również wpływ domniemanego antagonisty TRPA1. Dane są przesyłane z oprogramowania SoftMax Pro w celu skonstruowania zależności stężenie-odpowiedź aktywatorów i inhibitorów TRPA1.

Protokół

1. Preparaty komórkowe na płytkach 96-dołkowych

Dla komórek HEK293 przejściowo zbanowanych ludzkim TRPA1 cDNA

1. Komórki HEK293 są hodowane przez jeden do dwóch dni w pożywce Minimal Essential Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 4,5 mg/ml glukozy (Thermo Scientific, SH3002201), uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (Invitrogen, 16000-044), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny (Invitrogen, 15140-163). W dniu transfekcji gęstość komórek powinna osiągnąć 70-90%.
2. Pokryj 96-dołkowe płytki, pipetując 50 μl poli-L-ornityny (Sigma P3655, 20 μg/ml w sterylnej wodzie destylowanej) do każdego dołka i inkubując w temperaturze 37°C przez co najmniej 15 minut. Przepłukać każdą studzienkę raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco (DPBS) bez Mg²⁺ i^Ca2+ (Thermo Scientific, SH3002803). Płytkę można pozostawić w kapturze do hodowli komórkowej na kilka godzin.
3. Dla każdego dołka na 96-dołkowej płytce rozcieńczyć w 1,5 ml probówce Eppendorfa 0,2 μg cDNA w 25 μl OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Skaluj proporcjonalnie w górę w zależności od liczby studzienek, które mają zostać transfekowane przez to samo cDNA. Rozcieńczyć również w oddzielnej 1,5 ml probówce Eppendorfa 0,4 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) w 25 μl OPTI-MEM dla każdej studzienki, która ma być transfekowana. Zwiększ to w zależności od całkowitej liczby dołków, które mają zostać przetransfekowane.
4. Krótko zmieszaj rozcieńczone cDNA i Lipofectamine 2000 i pozostaw je w temperaturze pokojowej na około 5 minut.
5. Przenieść równą objętość rozcieńczonej Lipofectamine 2000 do probówki zawierającej rozcieńczony cDNA, odwirować i pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 15 minut do 2 godzin. W tym czasie przenieść mieszaninę cDNA/Lipofectamine 2000 w stężeniu 49 μl/studzienkę na płytkę pokrytą poli-L-ornityną.
6. Trypsynizuj komórki HEK293 (krok 1.1), policz gęstość komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek Countess (Invitrogen, C10227) i przenieś żądaną ilość komórek (zwykle około ~ 125 000-150 000 komórek / studzienkę) do 15-ml sterylnej probówki wirówkowej ze stożkowym dnem. Wirować przy 1000 x RPM przez 5 min. Ponownie zawiesić komórki w ~ 1 250 00-1 500 000 komórek / ml w pożywce hodowlanej DMEM, uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, ale bez antybiotyków.
7. Dozować 98 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki, która zawiera mieszaninę cDNA-Lipofectamine 2000 za pomocą pipetera wielokanałowego lub dozownika MicroFill MicroPlate (Bio-Tek). Pozostaw płytkę w kapturze na co najmniej 30 minut przed umieszczeniem jej w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych. Inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO₂ przez 20-44 godziny.

Dla komórek HEK293 stabilnie wyrażających TRPA1

8. Wykonaj krok 1.2, aby pokryć płytki 96-dołkowe.
9. Indukowalna linia komórkowa HEK293-hTRPA1 została obficie dostarczona przez dr A. Patapoutiana (The Scripps Research Institute) i utrzymywana w tym samym pożywce, co komórki HEK293 typu dzikiego (krok 1.1), ale uzupełniona o 5 μg/ml blasticydyny (Invitrogen, A1113902) i 50 μg/ml higromycyny B (Invitrogen, 10687010). Gdy gęstość komórek osiągnie około 90%, trypsynizuj komórki, policz gęstość komórek i odwiruj żądaną ilość komórek przy 1000 x RPM przez 5 minut. Zawiesić komórki o gęstości ~ 1 000 000 komórek/ml w tej samej pożywce hodowlanej uzupełnionej doksycykliną (Fisher, BP26535, 0,25 μg/ml).
10. Dozować zawiesinę komórek na płytki pokryte poli-L-ornityną w stężeniu 100 μl/studzienkę za pomocą pipetera wielokanałowego lub MicroFill (Bio-Tek). Pozostaw płytkę w kapturze na co najmniej 30 minut przed umieszczeniem jej w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 16 - 24 godziny.

2. Rozwiązania

1. Bufor soli Hanka (HBSS) jest używany jako roztwór zewnątrzkomórkowy. Zawiera (w mM): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,25 Na₂HPO₄, 0,44
   KH₂PO₄, 1,3 CaCl₂, 1,0 MgSO₄, 1,0 MgCl₂, 10 glukozy, 10 HEPES, o pH dostosowanym do 7,4 za pomocą 1N NaOH).
2. Bufor do oznaczania fluo-4 zawiera 2 mM probenecydu w HBSS. Zrobić 250 mM zapasowego probenecydu (Sigma, P8761) w 0,5 N NaOH. Rozcieńczyć do HBSS w stosunku 1:125. Ponownie dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 N HCl.

3. Ładowanie komórek za pomocą Fluo-4 AM

1. Rozpuścić 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) w 912 μl bezwodnego DMSO, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mM. Roztwór podstawowy Fluo-4 AM może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez co najmniej jeden miesiąc.
2. Zmieszać 10 μl 1 mM Fluo-4 AM z 10 μl Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w/v) roztwór w DMSO), a następnie przenieść całą zawartość do 5 ml buforu do oznaczania Fluo-4 (krok 2.2) uzupełnionego 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (Sigma, A9418).
3. Umyj komórki wyhodowane na płytkach 96-dołkowych (krok 1.7 lub 1.10) HBSS w temperaturze 80 μl/basenik 2 razy za pomocą myjki do mikropłytek (takiej jak ELx405TM firmy Bio-Tek).
4. Dodać roztwór nasycający Fluo-4 AM (krok 3.2) przy 50 μl/studzienkę za pomocą pipetera wielokanałowego lub MicroFill (Bio-Tek) i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
5. Umyć komórki 3 razy buforem testowym Fluo-4 (krok 2.2.) za pomocą myjki do mikropłytek ELx405TM. Po ostatnim przepłukaniu pozostawić 80 μl buforu do oznaczania Fluo-4 w każdym dołku.

4. Przygotowanie płytki złożonej

1. Podczas 1-godzinnego okresu ładowania komórek należy przygotować serię 3-krotnych rozcieńczeń agonistów (lub antagonistów) 3-krotności pożądanych stężeń końcowych w buforze testowym Fluo-4.
2. Odpipetować pipetą 250-300 μl rozcieńczonych roztworów związków na 96-dołkową płytkę złożoną. Ułożyć się tak, aby seryjne rozcieńczenia związku i odpowiadające im kontrole dodatnie i ujemne znajdowały się w tej samej kolumnie płytki złożonej, gdy tylko jest to możliwe, ponieważ FlexStation 3 odczytuje pojedynczą kolumnę na raz.

5. Odczyt tabliczki w FlexStation 3

1. Włącz system (FlexStation 3, komputer i oprogramowanie SoftMax Pro 5.2)
2. Zapisz eksperyment z nową nazwą pliku. Podczas konfiguracji wybierz tryb FLEX i wprowadź następujące wartości:

Protokół #1, efekt agonisty

Protokół #2, efekt antagonisty

3. Umieść nowe pudełko na końcówki, płytkę złożoną i płytkę odczytu w odpowiednich tacach w FlexStation 3 i kliknij przycisk "przeczytaj". FlexStation 3 odczytuje jedną kolumnę na raz i dodaje związki w zaprogramowanych punktach czasowych bez przerywania odczytu. Zakończenie odczytywania jednej kolumny zajmuje około 3 minut (5 minut w przypadku protokołu #2), a maszyna będzie kontynuować odczytywanie następnej kolumny z dodawaniem złożonym wykonywanym zgodnie z programowaniem użytkownika w kroku 5.2, aż wszystkie kolumny zostaną odczytane.

6. Analiza danych

1. Dane eksperymentalne mogą być przetwarzane bezpośrednio za pomocą oprogramowania SoftMax Pro 5.2 lub kopiowane i wklejane do dowolnego programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych, takich jak Microsoft Excel. Krzywa stężenie-odpowiedź agonisty TRPA1 kwasu flufenamowego (FFA) jest konstruowana przy użyciu następującej procedury dopasowania metodą najmniejszych kwadratów. , gdzie Y to obserwowana reakcja, Y_max to znormalizowana maksymalna odpowiedź, C to odpowiednie stężenie leku, EC₅₀ to stężenie, które wywołało połowę maksymalnej reakcji, a n_H to pozorny współczynnik Hilla. Krzywą zahamowania stężenia dla przypuszczalnego antagonisty TRPA1 związku A uzyskuje się przy użyciu stałego stężenia FFA (100 μM) i stopniowo zwiększając stężenie związku A. Wartość IC₅₀ związku A oblicza się za pomocą najmniejszych kwadratów pasujących do poniższego równania. , gdzie Y to obserwowana odpowiedź, a Y_max to znormalizowana odpowiedź szczytowa, [Ant] to odpowiednie stężenie związku A, IC₅₀ to stężenie antagonistyczne, które powoduje połowiczne maksymalne zahamowanie odpowiedzi wywołanej FFA, a n_H to pozorny współczynnik Hilla.

7. Reprezentatywne wyniki:

TRPA1 to przepuszczalny dla Ca²⁺ kanał kationowy, którego aktywacja prowadzi do napływu wapnia, który może być wykryty przez wrażliwy na Ca²⁺ barwnik, Fluo-4 (1-2). Stabilną linię komórkową HEK293-hTRPA1 wykorzystano do zbadania zależności stężenie-odpowiedź agonistów i antagonistów TRPA1. Komórki załadowano Fluo-4 AM, umieszczono w 80 μl buforu testowego i odczytano za pomocą FlexStation 3. Po zarejestrowaniu podstawowej fluorescencji przez 30 s, 40 μl seryjnego rozcieńczenia agonisty TRPA1, FFA, każdy przy 3x pożądanym stężeniu końcowym, dodano do komórek za pomocą wielokanałowego pipetera dołączonego jako część modułu fluidyki FlexStation 3. Zmiany fluorescencji monitorowano przez dodatkowe 180 sekund. Względne zmiany fluorescencji Fluo-4 dla każdej studzienki wyrażono jako ΔF= (F - F₀), gdzie F i F₀ są wartościami fluorescencji odpowiednio w czasie zainteresowania i na początku odczytu. Reprezentatywne ślady przebiegu czasu do zmian fluorescencji w odpowiedzi na szereg stężeń FFA przedstawiono na rys. 1. Uwaga dla ostatnich czterech stężeń FFA, chociaż maksymalne poziomy odpowiedzi są podobne, kinetyka aktywacji jest wyraźnie szybsza przy wyższych niż przy niższych stężeniach FFA. Dlatego, aby rozróżnić te różnice, skonstruowano zależność stężenie - odpowiedź, mierząc początkowe tempo (nachylenie) wzrostu fluorescencji po dodaniu różnych stężeń FFA (ryc. 2). Połowę maksymalnego stężenia skutecznego (EC₅₀) FFA określono na 55,4 μM (n=3). Aby przetestować domniemanego antagonistę TRPA1, związek A, przeprowadziliśmy podobny eksperyment przy użyciu protokołu #2 (Krok 2). W tym przypadku dodano serię rozcieńczeń antagonisty po 30 s (40 μl 3x pożądanych stężeń końcowych), a FFA dodano 180 s później (60 μl przy 300 μM dla końcowego stężenia 100 μM). Związek A, zależny od dawki, zmniejszał odpowiedź komórek TRPA1 na FFA przy połowie maksymalnego stężenia hamującego (IC₅₀) wynoszącym 4,3 μM (n = 3) (ryc. 2).

Rysunek 1. Zależna od stężenia aktywacja ludzkiego TRPA1 przez FFA. Ślady to wywołany przez FFA wzrost fluorescencji w czasie (pokazano tylko odpowiedzi w pierwszych 60 s, aby lepiej zilustrować szybką kinetykę odpowiedzi wywołanych przez FFA). Należy pamiętać, że przy wyższych stężeniach FFA wywoływał wzrost fluorescencji ze znacznie szybszym kinetykiem niż przy niższych stężeniach, mimo że szczytowe poziomy fluorescencji były podobne.

Rysunek 2. Zależności między stężeniem a odpowiedzią na indukowaną przez FFA zmianę fluorescencji i indukowane przez związek A hamowanie odpowiedzi FFA w ludzkim TRPA1 stabilnie eksprymowanym w komórkach HEK293. Δ,Zależność stężenie - odpowiedź FFA została określona przez pomiar początkowych szybkości (nachylenia) znormalizowanego wzrostu fluorescencji po dodaniu różnych stężeń FFA. O, Zależność stężenie-odpowiedź hamowania odpowiedzi wapniowej wywołanej przez FFA przez domniemanego antagonistę TRPA1, związek A.

Dyskusja

Wewnątrzkomórkowy Ca^{2 +} odgrywa ważną rolę w wielu stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak uwalnianie neuroprzekaźników (3), potencjał czynnościowy serca (4), skurcz komórek mięśniowych (5), transdukcja sygnału komórkowego (6-7) i ekscytotoksyczna śmierć komórki (8). Pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów Ca²⁺ pomaga wyjaśnić zmiany funkcjonalne kanałów przepuszczalnych Ca²⁺ w błonie komórkowej lub organellach wewnątrzkomórkowych oraz udział
Ca²⁺ do powyższych p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Urządzenia molekularne	FlexStation 3
, końcówki do pipet FlexStation	Urządzenia molekularne	9000-0912
96-dołkowe płytki	Greiner Bio-One	655090
96-dołkowe przezroczyste płytki z płaskim dnem	Costar	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14202
PluronicF-127	Invitrogen	P3000MP
Poly-L-ornityna	Sigma-Aldrich	P36551
probenecyd	Sigma-Aldrich	P8761
Surowica bydlęca albumina	Sigma-Aldrich	A9418