Komórkowy test wapniowy do przesiewowej analizy funkcji kanałów TRP o średniej i wysokiej przepustowości z wykorzystaniem systemu FlexStation 3

Podsumowanie

Niniejszy materiał wideo przedstawia szczegółowy protokół badania profilu farmakologicznego ludzkich kanałów TRPA1 przy użyciu systemu FlexStation 3. Protokół obejmuje szczegóły dotyczące przygotowania komórek, ładowania barwnika oraz obsługi czytnika mikropłytek FlexStation 3.

Streszczenie

Urządzenie FlexStation 3 firmy Molecular Devices jest stołowym wielomodalnym czytnikiem mikropłytek, umożliwiającym zautomatyzowany pomiar fluorescencji w płytkach wielodołkowych. Jest ono idealne do badań przesiewowych o średniej i wysokiej przepustowości w środowisku akademickim. Posiada zintegrowany moduł transferu cieczy wyposażony w pipetę wielokanałową, a urządzenie odczytuje po jednej kolumnie w celu monitorowania zmian fluorescencji różnych odczynników fluorescencyjnych. Na przykład FlexStation 3 był wykorzystywany do badania funkcji kanałów jonowych przepuszczalnych dla Ca²⁺ oraz receptorów sprzężonych z białkiem G poprzez pomiar zmian wewnątrzkomórkowych poziomów wolnego Ca²⁺. Kanały potencjału przejściowego (TRP) to liczna rodzina nieselektywnych kanałów kationowych, które odgrywają istotną rolę w wielu funkcjach fizjologicznych i patofizjologicznych. Większość kanałów TRP jest przepuszczalna dla wapnia i indukuje jego napływ po aktywacji. W tym filmie demonstrujemy zastosowanie FlexStation 3 do badania profilu farmakologicznego kanału TRPA1, który jest molekularnym sensorem licznych bodźców szkodliwych. Komórki HEK293 przejściowo lub stabilnie ekspresujące ludzkie kanały TRPA1, hodowane na płytkach 96-dołkowych, są obciążone czułym na Ca²⁺ barwnikiem fluorescencyjnym Fluo-4, a zmiany fluorescencji tych komórek w czasie rzeczywistym są mierzone przed i w trakcie aplikacji agonisty TRPA1 przy użyciu trybu FLEX urządzenia FlexStation 3. Zbadano również wpływ domniemanego antagonisty TRPA1. Dane są przenoszone z oprogramowania SoftMax Pro w celu skonstruowania zależności stężenie-odpowiedź dla aktywatorów i inhibitorów TRPA1.

Protokół

1. Przygotowanie komórek w płytkach 96-dołkowych

Dla komórek HEK293 przejściowo transfektowanych cDNA ludzkiego TRPA1

1. Komórki HEK293 hoduje się przez jeden do dwóch dni w minimalnym niezbędnym medium Dulbecco (DMEM) zawierającym 4,5 mg/ml glukozy (Thermo Scientific, SH3002201), uzupełnionym o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (Invitrogen, 16000-044), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny (Invitrogen, 15140-163). W dniu transfekcji gęstość komórek powinna wynosić 70-90%.
2. Płytki 96-dołkowe powleka się, pipetując 50 μl poli-L-ornityny (Sigma P3655, 20 μg/ml w sterylnej wodzie destylowanej) do każdego dołka i inkubując w temperaturze 37°C przez co najmniej 15 min. Każdy dołek należy przepłukać raz solą fizjologiczną z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) bez Mg²⁺ i Ca²⁺ (Thermo Scientific, SH3002803). Płytkę można pozostawić w komorze do hodowli komórkowej na kilka godzin.
3. Dla każdego dołka płytki 96-dołkowej rozcieńcza się w probówce Eppendorf 1,5 ml 0,2 μg cDNA w 25 μl OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Ilość należy zwiększyć proporcjonalnie do liczby dołków, które zostaną poddane transfekcji tym samym cDNA. W osobnej probówce Eppendorf 1,5 ml należy również rozcieńczyć 0,4 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) w 25 μl OPTI-MEM dla każdego dołka przeznaczonego do transfekcji. Ilość należy zwiększyć zgodnie z całkowitą liczbą dołków do transfekcji.
4. Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex rozcieńczone cDNA oraz Lipofectamine 2000 i pozostaw je w temperaturze pokojowej przez około 5 min.
5. Przenieś równą objętość rozcieńczonej Lipofectamine 2000 do probówki zawierającej rozcieńczone cDNA, wymieszaj na vortexie i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej od 15 min do 2 h. W tym czasie przenieś mieszaninę cDNA/Lipofectamine 2000 w ilości 49 μl/dołek na płytkę powleczoną poli-L-ornityną.
6. Poddaj komórki HEK293 (Krok 1.1) trypsynizacji, zmierz gęstość komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek Countess (Invitrogen, C10227) i przenieś pożądaną liczbę komórek (zazwyczaj około ~125 000-150 000 komórek/dołek) do sterylnej probówki wirówkowej 15 ml z okrągłym dnem. Wirować przy 1000 x RPM przez 5 min. Resuspenduj komórki w stężeniu ~1 250 000-1 500 000 komórek/ml w medium hodowlanym DMEM, uzupełnionym o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej, ale bez antybiotyków.
7. Rozdziel 98 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka zawierającego mieszaninę cDNA-Lipofectamine 2000, używając pipety wielokanałowej lub dozownika do mikropłytek MicroFill (Bio-Tek). Pozostaw płytkę w komorze przez co najmniej 30 min przed umieszczeniem jej w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowej. Inkubuj w 37°C, 5% CO₂ przez 20-44 h.

Dla komórek HEK293 stabilnie wykazujących ekspresję TRPA1

8. Postępuj zgodnie z krokiem 1.2 w celu pokrycia płytek 96-dołkowych.
9. Indukowalna linia komórkowa HEK293-hTRPA1 została hojnie udostępniona przez dr A. Patapoutiana (The Scripps Research Institute) i hodowana w tym samym medium co komórki HEK293 typu dzikiego (Krok 1.1), lecz z dodatkiem 5 μg/ml blastycydyny (Invitrogen, A1113902) i 50 μg/ml hygromycyny B (Invitrogen, 10687010). Gdy gęstość komórek osiągnie około 90%, poddaj komórki trypsynizacji, policz gęstość komórek i odwiruj pożądaną ilość komórek przy 1000 x RPM przez 5 min. Resuspenduj komórki do gęstości ~1 000 000 komórek/ml w tym samym medium hodowlanym z dodatkiem doksycykliny (Fisher, BP26535, 0,25 μg/ml).
10. Rozdziel zawiesinę komórkową na płytki pokryte poli-L-ornityną w ilości 100 μl/dołek, używając pipety wielokanałowej lub urządzenia MicroFill (Bio-Tek). Pozostaw płytkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza na co najmniej 30 min przed umieszczeniem jej w inkubatorze do hodowli komórkowych z nawilżeniem. Inkubuj w 37 °C, 5% CO₂ przez 16 – 24 h.

2. Roztwory

1. W charakterze roztworu zewnątrzkomórkowego stosuje się buforowany roztwór soli Hanksa (HBSS). Zawiera on (w mM): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,25 Na₂HPO₄, 0,44
   KH₂PO₄, 1,3 CaCl₂, 1,0 MgSO₄, 1,0 MgCl₂, 10 glukozy, 10 HEPES, z pH dostrojonym do 7,4 przy użyciu 1N NaOH).
2. Bufor do analizy Fluo-4 zawiera 2 mM probenecydu w HBSS. Należy przygotować roztwór zapasowy probenecydu (Sigma, P8761) o stężeniu 250 mM w 0,5 N NaOH. Następnie rozcieńczyć go w HBSS w stosunku 1:125. Ponownie dostroić pH do 7,4 przy użyciu 1 N HCl.

3. Obciążanie komórek barwnikiem Fluo-4 AM

1. Rozpuścić 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) w 912 μl bezwodnego DMSO, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 1 mM. Roztwór zapasowy Fluo-4 AM można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej miesiąc.
2. Zmieszać 10 μl 1 mM Fluo-4 AM z 10 μl Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, roztwór 20% (w/v) w DMSO), a następnie przenieść całą zawartość do 5 ml buforu do analizy Fluo-4 (Krok 2.2) uzupełnionego o 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (Sigma, A9418).
3. Przemyć komórki hodowane na płytkach 96-dołkowych (Krok 1.7 lub 1.10) za pomocą HBSS w objętości 80 μl/dołek, powtarzając czynność 2 razy przy użyciu myjki do mikropłytek (np. ELx405TM od Bio-Tek).
4. Dodać roztwór ładujący Fluo-4 AM (Krok 3.2) w objętości 50 μl/dołek, używając pipety wielokanałowej lub urządzenia MicroFill (Bio-Tek), a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 h.
5. Przemyć komórki 3 razy buforem do analizy Fluo-4 (Krok 2.2) za pomocą myjki do mikropłytek ELx405TM. Po ostatnim płukaniu pozostawić 80 μl buforu do analizy Fluo-4 w każdym dołku.

4. Przygotowanie płytki z związkami

1. Podczas godzinnego okresu ładowania komórek przygotować serię rozcieńczeń 3x agonistów (lub antagonistów) w stężeniu 3x pożądanego stężenia końcowego w buforze do testu Fluo-4.
2. Pipetować 250-300 μl rozcieńczonych roztworów związków do płytki 96-dołkowej na związki. W miarę możliwości rozmieścić rozcieńczenia seryjne danego związku oraz odpowiadające im kontrole pozytywną i negatywną w tej samej kolumnie płytki, ponieważ FlexStation 3 odczytuje jedną kolumnę na raz.

5. Odczyt płytek w systemie FlexStation 3

1. Włącz system (FlexStation 3, komputer oraz oprogramowanie SoftMax Pro 5.2)
2. Zapisz eksperyment pod nową nazwą pliku. W ustawieniach wybierz tryb FLEX i wprowadź następujące wartości:

Protokół nr 1, efekt agonisty

Protokół nr 2, efekt antagonisty

3. Umieść nowe pudełko z końcówkami, płytkę z połączeniami oraz płytkę do odczytu w odpowiednich tackach urządzenia FlexStation 3 i kliknij przycisk „read”. FlexStation 3 odczyta jedną kolumnę na raz i doda związki w zaprogramowanych punktach czasowych, nie przerywając procesu odczytu. Odczyt jednej kolumny trwa około 3 min (5 min dla Protokołu nr 2), a urządzenie będzie kontynuować odczyt kolejnych kolumn, wykonując dodawanie związków zgodnie z zaprogramowanym przez użytkownika w kroku 5.2 schematem, aż do odczytania wszystkich kolumn.

6. Analiza danych

1. Dane eksperymentalne można przetwarzać bezpośrednio za pomocą oprogramowania SoftMax Pro 5.2 lub skopiować i wkleić do dowolnego programu arkusza kalkulacyjnego, takiego jak Microsoft Excel. Krzywą koncentracja-odpowiedź dla agonisty TRPA1, kwasu flufenamowego (FFA), konstruuje się przy użyciu następnego algorytmu dopasowania metodą najmniejszych kwadratów: , gdzie Y to obserwowana odpowiedź, Y_max to znormalizowana odpowiedź maksymalna, C to odpowiadające stężenie leku, EC₅₀ to stężenie wywołujące odpowiedź połowiczną, a n_H to pozorny współczynnik Hilla. Krzywą koncentracja-hamowanie dla domniemanego antagonisty TRPA1, związku A, uzyskuje się stosując stałe stężenie FFA (100 μM) i stopniowo zwiększając stężenie związku A. Wartość IC₅₀ związku A oblicza się poprzez dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów do następującego równania: , gdzie Y to obserwowana odpowiedź, Y_max to znormalizowany szczyt odpowiedzi, [Ant] to odpowiadające stężenie związku A, IC₅₀ to stężenie antagonisty wywołujące połowiczne hamowanie odpowiedzi wywołanej przez FFA, a n_H to pozorny współczynnik Hilla.

7. Reprezentatywne wyniki:

TRPA1 jest przepuszczalnym dla Ca²⁺ kanałem kationowym, którego aktywacja prowadzi do napływu wapnia, który można wykryć za pomocą barwnika wrażliwego na Ca²⁺, Fluo-4 (1-2). Do badania zależności koncentracyjno-odpowiedzi agonistów i antagonistów TRPA1 wykorzystano stabilną linię komórkową HEK293-hTRPA1. Komórki załadowano barwnikiem Fluo-4 AM, umieszczono w 80 μl buforu do analizy i odczytano za pomocą systemu FlexStation 3. Po zarejestrowaniu fluorescencji bazowej przez 30 s, do komórek dodano za pomocą pipety wielokanałowej, stanowiącej część modułu płynowego FlexStation 3, 40 μl rozcieńczenia seryjnego agonisty TRPA1, FFA, w stężeniu 3x pożądanego stężenia końcowego. Zmiany fluorescencji monitorowano przez kolejne 180 s. Względne zmiany fluorescencji Fluo-4 dla każdej studzienki wyrażono jako ΔF= (F - F₀), gdzie F i F₀ to odpowiednio wartości fluorescencji w badanym czasie oraz na początku odczytu. Reprezentatywne przebiegi czasowe zmian fluorescencji w odpowiedzi na szereg stężeń FFA przedstawiono na Ryc. 1. Należy zauważyć, że dla ostatnich czterech stężeń FFA, choć maksymalne poziomy odpowiedzi są podobne, kinetyka aktywacji jest wyraźnie szybsza przy wyższych niż przy niższych stężeniach FFA. Dlatego, aby rozróżnić te różnice, zależność koncentracyjno-odpowiedź skonstruowano poprzez pomiar początkowych szybkości (nachylenia krzywej) wzrostu fluorescencji po dodaniu różnych stężeń FFA (Ryc. 2). Połowiczna maksymalna stężenie efektywne (EC₅₀) FFA określono na 55,4 μM (n=3). Aby przetestować domniemanego antagonistę TRPA1, związek A, przeprowadzono podobny eksperyment zgodnie z protokołem nr 2 (Krok 2). W tym przypadku szereg rozcieńczeń antagonisty dodano w 30 s (40 μl stężeń 3x pożądanej wartości końcowej), a FFA dodano 180 s później (60 μl w stężeniu 300 μM dla końcowego stężenia 100 μM). Związek A w sposób zależny od dawki redukował odpowiedź komórek TRPA1 na FFA, a jego połowiczne maksymalne stężenie hamujące (IC₅₀) wyniosło 4,3 μM (n=3) (Ryc. 2).

Rycina 1. Zależna od stężenia aktywacja ludzkiego TRPA1 przez FFA. Krzywe przedstawiają wywołany przez FFA wzrost fluorescencji w czasie (pokazano jedynie odpowiedzi w ciągu pierwszych 60 s, aby lepiej zobrazować szybką kinetykę odpowiedzi wywołanych przez FFA). Należy zauważyć, że przy wyższych stężeniach FFA wywołał wzrost fluorescencji z znacznie szybszą kinetyką niż przy niższych stężeniach, mimo że maksymalne poziomy fluorescencji były podobne.

Rysunek 2. Zależności stężenie-odpowiedź dla zmiany fluorescencji indukowanej przez FFA oraz hamowania odpowiedzi na FFA indukowanego przez związek A w ludzkich kanałach TRPA1 stabilnie eksprymowanych w komórkach HEK293. Δ, zależność stężenie-odpowiedź dla FFA została wyznaczona poprzez pomiar początkowych szybkości (nachylenia) znormalizowanego wzrostu fluorescencji po dodaniu różnych stężeń FFA. O, zależność stężenie-odpowiedź dla hamowania odpowiedzi wapniowej wywołanej przez FFA przez domniemany antagonista TRPA1, związek A.

Dyskusja

Wewnątrzkomórkowy Ca²⁺ odgrywa istotną rolę w wielu stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak uwalnianie neuroprzekaźników (3), potencjał czynnościowy serca (4), skurcz komórek mięśniowych (5), transdukcja sygnałów komórkowych (6-7) oraz ekscytotoksyczna śmierć komórek (8). Pomiar poziomu wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ pomaga wyjaśnić zmiany funkcjonalne kanałów przepuszczalnych dla Ca²⁺ w błonie komórkowej lub organellach wewnątrzkomórkowych oraz wkład
Ca²⁺ w powyżs...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
FlexStation 3	Molecular Devices	FLEX3
Końcówki do pipet FlexStation, 96-dołkowe	Molecular Devices	9000-0912
Płytki 96-dołkowe	Greiner Bio-One	655090
Przezroczyste płytki 96-dołkowe z płaskim dnem	Costar	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14202
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Poly-L-ornityna	Sigma-Aldrich	P36551
probenecyd	Sigma-Aldrich	P8761
Seryjna albumina wołowa	Sigma-Aldrich	A9418