Komórkowy test wapniowy do przesiewowej analizy funkcji kanałów TRP o średniej i wysokiej przepustowości z wykorzystaniem systemu FlexStation 3

Podsumowanie

Niniejszy materiał wideo przedstawia szczegółowy protokół badania profilu farmakologicznego ludzkich kanałów TRPA1 przy użyciu systemu FlexStation 3. Protokół obejmuje szczegóły dotyczące przygotowania komórek, ładowania barwnika oraz obsługi czytnika mikropłytek FlexStation 3.

Streszczenie

Urządzenie FlexStation 3 firmy Molecular Devices jest stołowym wielomodalnym czytnikiem mikropłytek, umożliwiającym zautomatyzowany pomiar fluorescencji w płytkach wielodołkowych. Jest ono idealne do badań przesiewowych o średniej i wysokiej przepustowości w środowisku akademickim. Posiada zintegrowany moduł transferu cieczy wyposażony w pipetę wielokanałową, a urządzenie odczytuje po jednej kolumnie w celu monitorowania zmian fluorescencji różnych odczynników fluorescencyjnych. Na przykład FlexStation 3 był wykorzystywany do badania funkcji kanałów jonowych przepuszczalnych dla Ca²⁺ oraz receptorów sprzężonych z białkiem G poprzez pomiar zmian wewnątrzkomórkowych poziomów wolnego Ca²⁺. Kanały potencjału przejściowego (TRP) to liczna rodzina nieselektywnych kanałów kationowych, które odgrywają istotną rolę w wielu funkcjach fizjologicznych i patofizjologicznych. Większość kanałów TRP jest przepuszczalna dla wapnia i indukuje jego napływ po aktywacji. W tym filmie demonstrujemy zastosowanie FlexStation 3 do badania profilu farmakologicznego kanału TRPA1, który jest molekularnym sensorem licznych bodźców szkodliwych. Komórki HEK293 przejściowo lub stabilnie ekspresujące ludzkie kanały TRPA1, hodowane na płytkach 96-dołkowych, są obciążone czułym na Ca²⁺ barwnikiem fluorescencyjnym Fluo-4, a zmiany fluorescencji tych komórek w czasie rzeczywistym są mierzone przed i w trakcie aplikacji agonisty TRPA1 przy użyciu trybu FLEX urządzenia FlexStation 3. Zbadano również wpływ domniemanego antagonisty TRPA1. Dane są przenoszone z oprogramowania SoftMax Pro w celu skonstruowania zależności stężenie-odpowiedź dla aktywatorów i inhibitorów TRPA1.

Protokół

1. Przygotowanie komórek w płytkach 96-dołkowych

Dla komórek HEK293 przejściowo transfektowanych ludzkim cDNA TRPA1

1. Komórki HEK293 hoduje się przez jeden do dwóch dni w minimalnym medium podstawowym Dulbecco (DMEM) zawierającym 4,5 mg/ml glukozy (Thermo Scientific, SH3002201), uzupełnionym o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (Invitrogen, 16000-044), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny (Invitrogen, 15140-163). W dniu transfekcji gęstość komórek powinna osiągnąć 70-90%.
2. Płytki 96-dołkowe należy pokryć poli-L-ornityną, pipetując 50 μl poli-L-ornityny (Sigma P3655, 20 μg/ml w sterylnej wodzie destylowanej) do każdego dołka i inkubując w temperaturze 37°C przez co najmniej 15 min. Każdy dołek należy raz przepłukać roztworem DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) bez Mg²⁺ i Ca²⁺ (Thermo Scientific, SH3002803). Płytkę można pozostawić w komorze do hodowli komórkowej na kilka godzin.
3. Dla każdego dołka płytki 96-dołkowej należy rozpuścić w 1,5-ml probówce Eppendorf 0,2 μg cDNA w 25 μl OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Ilość należy zwiększyć proporcjonalnie do liczby dołków, które mają zostać poddane transfekcji tym samym cDNA. W oddzielnej 1,5-ml probówce Eppendorf należy również rozpuścić 0,4 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) w 25 μl OPTI-MEM dla każdego dołka przeznaczonego do transfekcji. Ilość należy zwiększyć zgodnie z całkowitą liczbą dołków do transfekcji.
4. Rozcieńczone cDNA oraz Lipofectamine 2000 należy krótko wymieszać na wirówce typu vortex i pozostawić w temperaturze pokojowej na około 5 min.
5. Równą objętość rozcieńczonego Lipofectamine 2000 należy przenieść do probówki zawierającej rozcieńczone cDNA, wymieszać na vortexie i pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej od 15 min do 2 h. W tym czasie należy przenieść mieszaninę cDNA/Lipofectamine 2000 w objętości 49 μl/dołek na płytkę pokrytą poli-L-ornityną.
6. Komórki HEK293 (Krok 1.1) należy potraktować trypsyną, zmierzyć gęstość komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek Countess (Invitrogen, C10227), a następnie przenieść pożądaną liczbę komórek (zazwyczaj około ~125 000-150 000 komórek/dołek) do 15-ml sterylnej probówki wirówkowej z dnem stożkowym. Wirować przy 1000 x RPM przez 5 min. Komórki należy resuspendować w medium hodowlanym DMEM uzupełnionym o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej, ale bez antybiotyków, do stężenia ~1 250 000-1 500 000 komórek/ml.
7. Do każdego dołka zawierającego mieszaninę cDNA-Lipofectamine 2000 należy nanieść 98 μl zawiesiny komórkowej, używając pipety wielokanałowej lub dozownika do płytek mikrodołkowych MicroFill (Bio-Tek). Płytkę należy pozostawić w komorze przez co najmniej 30 min przed umieszczeniem jej w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowej. Inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO₂ przez 20-44 h.

Dla komórek HEK293 stabilnie ekspresujących TRPA1

8. Postępuj zgodnie z krokiem 1.2 w celu powlekania płytek 96-dołkowych.
9. Indukowalna linia komórkowa HEK293-hTRPA1 została uprzejmie udostępniona przez dr. A. Patapoutiana (The Scripps Research Institute) i utrzymywana w tym samym medium co komórki HEK293 typu dzikiego (krok 1.1), lecz z dodatkiem 5 μg/ml blastycydyny (Invitrogen, A1113902) i 50 μg/ml hygromycyny B (Invitrogen, 10687010). Gdy gęstość komórek osiągnie około 90%, poddaj komórki trypsynizacji, zmierz gęstość komórek i odwiruj pożądaną ilość komórek przy 1000 x RPM przez 5 min. Resuspenduj komórki do gęstości ~1,000,000 komórek/ml w tym samym medium hodowlanym z dodatkiem doksycykliny (Fisher, BP26535, 0.25 μg/ml).
10. Rozdziel zawiesinę komórkową na płytki powleczone poli-L-ornityną w ilości 100 μl/dołek, używając pipety wielokanałowej lub urządzenia MicroFill (Bio-Tek). Pozostaw płytkę w komorze z laminarem na co najmniej 30 min przed umieszczeniem jej w nawilżanym inkubatorze do hodowli komórkowych. Inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 16 - 24 hr.

2. Roztwory

1. Jako roztwór zewnątrzkomórkowy stosuje się zbuforowany roztwór soli Hanksa (HBSS). Zawiera on (w mM): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,25 Na₂HPO₄, 0,44
   KH₂PO₄, 1,3 CaCl₂, 1,0 MgSO₄, 1,0 MgCl₂, 10 glukozy, 10 HEPES, z pH dostosowanym do 7,4 za pomocą 1N NaOH).
2. Bufor do analizy Fluo-4 zawiera 2 mM probenecydu w HBSS. Należy przygotować roztwór stokowy probenecydu (Sigma, P8761) o stężeniu 250 mM w 0,5 N NaOH. Rozcieńczyć w HBSS w stosunku 1:125. Ponownie dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 N HCl.

3. Obciążanie komórek barwnikiem Fluo-4 AM

1. Rozpuścić 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) w 912 μl bezwodnego DMSO, aby przygotować roztwór stokowy o stężeniu 1 mM. Roztwór stokowy Fluo-4 AM można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej miesiąc.
2. Zmieszać 10 μl 1 mM Fluo-4 AM z 10 μl Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, roztwór 20% (w/v) w DMSO), a następnie przenieść całą zawartość do 5 ml buforu do testu Fluo-4 (Krok 2.2) uzupełnionego o 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (Sigma, A9418).
3. Komórki hodowane na płytkach 96-dołkowych (Krok 1.7 lub 1.10) przemyć HBSS w ilości 80 μl/dołek 2 razy, używając myjki do mikropłytek (np. ELx405TM od Bio-Tek).
4. Dodać roztwór ładujący Fluo-4 AM (Krok 3.2) w ilości 50 μl/dołek za pomocą pipety wielokanałowej lub urządzenia MicroFill (Bio-Tek) i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 h.
5. Przemyć komórki 3 razy buforem do testu Fluo-4 (Krok 2.2), korzystając z myjki do mikropłytek ELx405TM. Po ostatnim przemyciu pozostawić 80 μl buforu do testu Fluo-4 w każdym dołku.

4. Przygotowanie płytki z substancjami

1. W ciągu godziny ładowania komórek przygotować szereg 3-krotnych rozcieńczeń agonistów (lub antagonistów) o stężeniach 3-krotnie wyższych od pożądanych stężeń końcowych w buforze do testu Fluo-4.
2. Pipetować 250-300 μl rozcieńczonych roztworów związków do płytki 96-dołkowej. W miarę możliwości rozmieścić szeregi rozcieńczeń danego związku oraz odpowiadające im kontrole pozytywne i negatywne w tej samej kolumnie płytki, ponieważ aparat FlexStation 3 odczytuje jedną kolumnę na raz.

5. Odczyt płytek w systemie FlexStation 3

1. Włącz system (FlexStation 3, komputer oraz oprogramowanie SoftMax Pro 5.2)
2. Zapisz eksperyment pod nową nazwą pliku. W ustawieniach wybierz tryb FLEX i wprowadź następujące wartości:

Protokół nr 1, efekt agonisty

Protokół nr 2, efekt antagonisty*

3. Umieść nowe pudełko z końcówkami, płytkę z substancjami oraz płytkę do odczytu w odpowiednich tacałach urządzenia FlexStation 3 i kliknij przycisk „read”. FlexStation 3 będzie odczytywać jedną kolumnę naraz i dodawać substancje w zaprogramowanych punktach czasowych bez przerywania odczytu. Odczyt jednej kolumny trwa około 3 min (5 min w przypadku Protokołu nr 2), a urządzenie będzie kontynuować odczyt kolejnych kolumn, wykonując dodawanie substancji zgodnie z programem ustalonym przez użytkownika w kroku 5.2, aż wszystkie kolumny zostaną odczytane.

6. Analiza danych

1. Dane eksperymentalne można przetwarzać bezpośrednio przy użyciu oprogramowania SoftMax Pro 5.2 lub skopiować i wkleić do dowolnego programu arkuszy kalkulacyjnych, takiego jak Microsoft Excel. Krzywą zależności odpowiedzi od stężenia dla agonisty TRPA1, kwasu flufenamowego (FFA), konstruuje się, stosując następującą procedurę dopasowania metodą najmniejszych kwadratów: , gdzie Y to obserwowana odpowiedź, Y_max to znormalizowana odpowiedź maksymalna, C to odpowiadające stężenie leku, EC₅₀ to stężenie wywołujące połowę odpowiedzi maksymalnej, a n_H to pozorny współczynnik Hilla. Krzywą inhibicji zależną od stężenia dla domniemanego antagonisty TRPA1, związku A, uzyskuje się, stosując stałe stężenie FFA (100 μM) i stopniowo zwiększając stężenie związku A. Wartość IC₅₀ związku A oblicza się poprzez dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów do następującego równania: , gdzie Y to obserwowana odpowiedź, Y_max to znormalizowana odpowiedź szczytowa, [Ant] to odpowiadające stężenie związku A, IC₅₀ to stężenie antagonisty wywołujące połowę maksymalnej inhibicji odpowiedzi wywołanej przez FFA, a n_H to pozorny współczynnik Hilla.

7. Reprezentatywne wyniki:

TRPA1 jest przepuszczalnym dla Ca²⁺ kanałem kationowym, którego aktywacja prowadzi do napływu wapnia, który można wykryć za pomocą barwnika wrażliwego na Ca²⁺, Fluo-4 (1-2). Do badania zależności stężenie-odpowiedź agonistów i antagonistów TRPA1 wykorzystano stabilną linię komórkową HEK293-hTRPA1. Komórki obciążono Fluo-4 AM, umieszczono w 80 μl buforu do analizy i odczytano za pomocą FlexStation 3. Po zarejestrowaniu fluorescencji bazowej przez 30 s, do komórek dodano za pomocą pipety wielokanałowej, będącej częścią modułu płynowego FlexStation 3, 40 μl rozcieńczeń szeregowych agonisty TRPA1, FFA, każdy w 3-krotnym stężeniu względem pożądanego stężenia końcowego. Zmiany fluorescencji monitorowano przez kolejne 180 s. Względne zmiany fluorescencji Fluo-4 dla każdej studzienki wyrażono jako ΔF= (F - F₀), gdzie F i F₀ to odpowiednio wartości fluorescencji w badanym czasie oraz na początku odczytu. Reprezentatywne przebiegi zmian fluorescencji w czasie w odpowiedzi na szereg stężeń FFA przedstawiono na Rys. 1. Należy zauważyć, że dla czterech ostatnich stężeń FFA, mimo podobnych maksymalnych poziomów odpowiedzi, kinetyka aktywacji jest wyraźnie szybsza przy wyższych niż przy niższych stężeniach FFA. Dlatego, aby rozróżnić te różnice, zależność stężenie-odpowiedź opracowano poprzez pomiar początkowych szybkości (nachylenia krzywej) wzrostu fluorescencji po dodaniu różnych stężeń FFA (Rys. 2). Połowiczne maksymalne stężenie efektywne (EC₅₀) dla FFA określono na 55,4 μM (n=3). Aby przetestować domniemany antagonista TRPA1, związek A, przeprowadzono podobny eksperyment zgodnie z protokołem nr 2 (Krok 2). W tym przypadku serię rozcieńczeń antagonisty dodano w 30 s (40 μl w 3-krotnych pożądanych stężeniach końcowych), a FFA dodano 180 s później (60 μl w stężeniu 300 μM dla końcowego stężenia 100 μM). Związek A w sposób zależny od dawki redukował odpowiedź komórek TRPA1 na FFA, przy połowicznym maksymalnym stężeniu hamującym (IC₅₀) wynoszącym 4,3 μM (n=3) (Rys. 2).

Rycina 1. Zależna od stężenia aktywacja ludzkiego TRPA1 przez FFA. Krzywe przedstawiają wywołany przez FFA wzrost fluorescencji w czasie (pokazano jedynie odpowiedzi z pierwszych 60 s, aby lepiej zilustrować szybką kinetykę odpowiedzi wywołanych przez FFA). Należy zauważyć, że przy wyższych stężeniach FFA wywoływał wzrost fluorescencji z znacznie szybszą kinetyką niż przy niższych stężeniach, mimo że szczytowe poziomy fluorescencji były podobne.

Rysunek 2. Zależności stężenie-odpowiedź dla zmiany fluorescencji indukowanej przez FFA oraz hamowania odpowiedzi na FFA indukowanego związkiem A w ludzkim TRPA1 stabilnie ekspresjonowanym w komórkach HEK293. Δ, Zależność stężenie-odpowiedź dla FFA określono poprzez pomiar początkowych szybkości (nachylenia) znormalizowanego wzrostu fluorescencji po dodaniu różnych stężeń FFA. O, Zależność stężenie-odpowiedź dla hamowania wywołanej przez FFA odpowiedzi wapniowej przez domniemany antagonista TRPA1, związek A.

Dyskusja

Wewnątrzkomórkowy Ca²⁺ odgrywa istotną rolę w wielu stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak uwalnianie neuroprzekaźników (3), potencjał czynnościowy serca (4), skurcz komórek mięśniowych (5), transdukcja sygnałów komórkowych (6-7) oraz ekscytotoksyczna śmierć komórek (8). Pomiar poziomu wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ pomaga wyjaśnić zmiany funkcjonalne kanałów przepuszczalnych dla Ca²⁺ w błonie komórkowej lub organellach wewnątrzkomórkowych oraz wkład
Ca²⁺ w powyżs...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
FlexStation 3	Molecular Devices	FLEX3
Końcówki do pipet FlexStation, 96-dołkowe	Molecular Devices	9000-0912
Płytki 96-dołkowe	Greiner Bio-One	655090
Przezroczyste płytki 96-dołkowe z płaskim dnem	Costar	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14202
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Poly-L-ornityna	Sigma-Aldrich	P36551
probenecyd	Sigma-Aldrich	P8761
Seryjna albumina wołowa	Sigma-Aldrich	A9418