Opisujemy proces izolacji wysokiej czystości DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek. Końcowe DNA odzyskane z roztworu charakteryzuje się wysokim stężeniem i czystością, co czyni je idealnym do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji w celu otrzymania nowych rekombinantów wirusowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie viralnego DNA z nukleokapsydów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wirusy są bezwzględnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi, w związku z czym badanie ich DNA wymaga odizolowania materiału wirusowego od zanieczyszczeń i DNA komórki gospodarza. Wiele zastosowań analitycznych wymaga dużych ilości czystego wirusowego DNA, co zapewnia niniejszy protokół. Zastosowania te obejmują sekwencjonowanie genomu wirusowego, w którym usunięcie DNA gospodarza jest kluczowe dla optymalizacji uzysku danych dla sekwencji wirusowych, oraz tworzenie nowych rekombinowanych szczepów wirusowych, gdzie kotransfekcja oczyszczonego plazmidu i linearnego wirusowego DNA ułatwia rekombinację.1,2,3
Niniejsza procedura wykorzystuje kombinację ekstrakcji i wirowania w gradientach gęstości w celu wyizolowania oczyszczonego liniowego DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek.4,5 Początkowe etapy oczyszczania mają na celu wyizolowanie oczyszczonych kapsydów wirusowych, które zawierają i chronią wirusowe DNA podczas etapów ekstrakcji i wirowania służących do usunięcia białek oraz DNA komórkowego. Następnie liza nukleokapsydów uwalnia wirusowe DNA, a dwa końcowe etapy ekstrakcji fenol-chloroformem usuwają pozostałe białka. Końcowe DNA odzyskano z roztworu jest wysoce skoncentrowane i czyste, ze średnim OD260/280 na poziomie 1,90. W zależności od ilości użytych zainfekowanych komórek, wydajność wirusowego DNA mieści się w zakresie 150-800 μg lub więcej. Czystość tego DNA sprawia, że jest ono stabilne podczas długotrwałego przechowywania w 4°C. Dzięki temu DNA to jest idealnie odpowiednie do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji.
Przed rozpoczęciem protokołu ważne jest określenie średniej liczby komórek na naczynie (np. średnio 8 x 106 komórek PK-15 w konfluentnej płytce 15 cm) oraz miana używanego zapasu wirusa (np. 1 x 108 jednostek tworzących plaki na ml). Dane te są niezbędne do obliczenia odpowiedniej wielokrotności infekcji (MOI) dla danego protokołu.6 Na przykład, aby zainfekować jedną płytkę 15 cm z komórkami PK-15 powyższym zapasem wirusa przy MOI wynoszącym 5, należy użyć 400 μl zapasu wirusa i rozcieńczyć go w 3,6 ml medium (całkowita objętość inokulum dla jednej płytki 15 cm wynosi 4 ml).
Jednocześnie można przygotować wiele preparatów wirusowego DNA. Liczba jednoczesnych preparacji jest ograniczona jedynie liczbą probówek mieszczących się w rotorze ultrawirówki (jedna na wirusa; patrz krok 3.9 poniżej). W niniejszej sekcji opisujemy procedurę w odniesieniu do jednego wirusa.
Protokół
1. Pierwszy dzień: Infekcja wirusowa i przygotowanie buforów
- Przygotować od 5 do 10 szalek (o średnicy 15 cm) z hodowlą komórkową do infekcji, np. komórki PK-15 dla wirusa pseudowścieklizny (PRV) lub komórki Vero dla wirusa opryszczki zwykłej (HSV).
- Gdy komórki osiągną 95–100% konfluencji, zainfekować je z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 5–10. W tym celu zaszczepić każdą płytkę, używając zapasu wirusa w całkowitej objętości 4 ml na płytkę, a następnie inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Delikatnie kołysać płytkami co 15 minut, aby zapewnić pełne pokrycie monowarstwy komórek inokulum wirusa. W międzyczasie podgrzać pożywkę do następnego etapu.
- Po jednej godzinie infekcji odessać inokulum wirusa z płytek, dodać 15 ml ciepłej pożywki i inkubować w temperaturze 37°C przez 12–20 godzin w inkubatorze z nawilżaniem.
- Przygotować bufory LCM (patrz Tabela 1) i kołysać przez noc w temperaturze 4°C w celu dokładnego wymieszania. Przygotować TNE do resuspensji wirusowego DNA (patrz Tabela 2).
2. Drugi dzień, faza 1: Lizy komórek i ultrawirowanie
- Wizualnie potwierdź, że infekcja komórek wywołała jednolity efekt cytopatyczny (CPE). Pozostaw infekcję do czasu, aż wszystkie komórki przybiorą okrągły kształt, ale nie oddzielą się jeszcze od płytki.
- Zeskrob zainfekowane komórki do medium, a następnie przelej komórki wraz z medium do probówek stożkowych o pojemności 50 ml. Liczba probótek stożkowych potrzebnych na tym etapie zależy od liczby naczyń użytych do infekcji w kroku 1.2 powyżej, np. jedna probówka stożkowa 50 ml może służyć do wirowania osadu z maksymalnie 3 naczyń zawierających po 15 ml medium. Opcjonalnie: Przepłucz płytki 10 ml PBS i połącz ten płyn z komórkami i medium.
- Wiruj komórki i medium przez 10 minut przy sile względnej 2000 rcf w temperaturze pokojowej, następnie odessaj nadsącz i resuspenduj każdy osad w 10 ml PBS. Jeśli osad z jednej infekcji wirusowej został rozdzielony do wielu probótek stożkowych w kroku 2.2, można je na tym etapie połączyć w jednej probówce. Powtórz wirowanie i odsysanie. Opcjonalnie: Osad ten można przechowywać w temperaturze -20°C i kontynuować protokół w późniejszym terminie.
3. Drugi dzień, faza 2: Ultracentryfugacja
Podczas następnych etapów należy w miarę możliwości przechowywać osad komórkowy oraz bufory LCM w lodzie.
- Dodać β-merkaptoetanol do buforu LCM z 0% glicerolu. Rozpocząć chłodzenie ultrawirówki (do kroku 3.9 poniżej), ustawiając temperaturę 4°C i włączając pompę próżniową.
- Resuspendować osad komórkowy w 5 ml buforu LCM z 0% glicerolu, aż przestanie być grudkowaty. W razie potrzeby wymieszać probówkę na wirówce vortex, aby rozbić nierozpuszczony osad komórkowy.
- Przeprowadzić ekstrakcję, dodając 1,5 ml Freonu (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroetan) i intensywnie mieszając na vortexie. Natychmiast wirować przez 10 min przy 2000 rcf w temperaturze 4°C. Zebrać górną warstwę za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze (unikając warstwy granicznej) i przenieść do nowej probówki. Opcjonalnie: Jeśli osad ma postać żelowatej substancji stałej, można szybko przelać górną warstwę do nowej probówki.
- Powtórzyć ekstrakcję Freonem i ponownie wirować.
- Zebrać górną warstwę (~5 ml) i przenieść do nowej probówki do ultrawirówki wykonanej z polialomeru. Dodać β-merkaptoetanol do dwóch pozostałych buforów LCM z glicerolem.
- Przygotować gradient w polialomerowej probówce do wirowania, nakładając pod ekstrakt z Freonu (warstwa górna) 3 ml buforu LCM z 5% glicerolu (warstwa środkowa), a następnie pod nią 2,5 ml buforu LCM z 45% glicerolu (warstwa dolna). Użyć cienkiej pipety, aby uniknąć przelania zawartości probówki.
- W razie potrzeby przygotować równoważącą probówkę balansową, stosując te same proporcje buforów LCM.
- Przenieść probówki do koszyków ultrawirówki. Zrównoważyć masę koszyków z dokładnością do 0,1 g, delikatnie dodając dodatkowy bufor LCM z 0% glicerolu do warstwy górnej (~50-100 μl na raz).
- Używając schłodzonej ultrawirówki z rotorem z koszykami poziomymi lub wahadłowymi, wirować zrównoważone próbki przez 1 godzinę przy 77 000 rcf (np. 25 000 rpm dla rotora SW41Ti) w temperaturze 4°C.
- Podczas ultrawirowania wykonać szklany haczyk do wyłapania pływającego DNA na etapie precypitacji etanolem (4.6 poniżej). Trzymając oba końce szklanej pipety Pasteura, zawiesić środkową sekcję nad płomieniem. Gdy fragment szkła będzie niemal stopiony, delikatnie pociągnąć, aby rozciągnąć szkło, ostrożnie wygiąć, tworząc ostry haczyk (<90 stopni) i gwałtownie pociągnąć, aby odciąć koniec. Jeśli końcówka szklanego haczyka pozostanie otwarta, trzymać ją nad płomieniem, aż szkło stopi się na tyle, by ją zamknąć.
- Po ultrawirowaniu powinien być widoczny cienki, nieprzezroczysty osad z ciemną plamką w środku. Ostrożnie odessać ciecz z probówki, w tym krople spływające po ściankach, unikając naruszenia osadu na dnie probówki.
- Dodać 0,5 ml TNE w temperaturze pokojowej.
- Pozostawić osad na co najmniej 10 minut, aby umożliwić jego hydratację. Opcjonalnie: Osad można również resuspendować w TNE przez noc, przechowując go w temperaturze 4°C.
4. Trzeci dzień: Wytrącanie „duchowego” DNA
- Rozbić osad poprzez pipetowanie za pomocą końcówki o małej średnicy (np. końcówki do pipety p200). Na tym etapie nie należy obawiać się ścinania, ponieważ DNA wirusowe jest wciąż zamknięte w kapsydach. W temperaturze pokojowej dodać do probówki z osadem wirusowym następujące odczynniki w celu zniszczenia kapsydów:
- 4,25 ml TNE
- 0,25 ml 10% SDS
- 2 mg Proteinazy K
Od tego momentu należy unikać sił ścinających, np. stosować pipety o dużej średnicy otworu i nie mieszać materiału wirusowego w wirówce typu vortex
- Wyekstrahować białka wirusowe, dodając 5 ml fenolu i chloroformu, a następnie niezwłocznie rozpocząć odwracanie probówki lub mieszanie w wstrząsaczu vórteksowym w celu utrzymania emulsji. Mieszać przez 10 sekund, a następnie odwirować emulsję przez 5 minut przy 2000 rcf w temperaturze pokojowej. Zebrać górną warstwę za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze, unikając warstwy granicznej, i przenieść do nowej probówki. Opcjonalnie: na tym etapie można zastosować probówki z żelem fazowym (PLG), aby uniknąć zanieczyszczeń z warstwy granicznej.
- Powtórzyć ekstrakcję fenol-chloroformową i ponownie odwirować.
- Po drugiej ekstrakcji fenol-chloroformowej zebrać górną warstwę do szklanej probówki Corex o pojemności 30 ml i schłodzić probówkę w temperaturze -20°C przez 10-15 minut, dbając o to, aby próbka nie zamarzła.
- Dodać 10 ml lodowatego etanolu, zakryć probówkę (np. naciągając kawałek folii Parafilm M na wierzchu) i natychmiast odwrócić, aby wymieszać. Obserwować pojawienie się „ducha” DNA, który ma postać cienkiego, sznurowatego osadu. Delikatnie odwracać probówkę, aby dalej mieszać i doprowadzić do skupienia się lepkich osadów DNA.
- Użyć szklanego haczyka, aby uchwycić „ducha” (lub „duchy”) DNA. Ostrożnie osuszyć DNA, aby usunąć nadmiar cieczy, następnie umieścić haczyk (końcem w dół) w probówce 1,5 ml i pozostawić do wyschnięcia. Dodać 0,25 - 0,5 ml buforu TE, aby rozpuścić „ducha” DNA. Pozostawić DNA do resuspensji przez co najmniej jedną godzinę. Przechowywać DNA w temperaturze 4°C. Opcjonalnie: aby zmaksymalizować wydajność DNA, można odłamać szklany haczyk do probówki 1,5 ml, tak aby resuspensja z fragmentów szkła mogła trwać w czasie.
5. Reprezentatywne wyniki
Przy wystarczająco wysokim MOI komórki powinny osiągnąć pełny efekt cytopatyczny (CPE) w ciągu około 18 godzin po infekcji (hpi) w przypadku szczepów PRV typu dzikiego oraz około 24 hpi dla szczepów HSV-1 typu dzikiego (Rycina 1). Po zebraniu osadu z zainfekowanych komórek pozostałe kroki protokołu można zrealizować w ciągu jednego długiego dnia lub rozłożyć na dwa dni (Rycina 2).
Podczas przygotowywania szklanych haczyków do wychwytywania „ducha DNA”, ważne jest, aby kąt haczyka był mniejszy niż 90 stopni, tak aby mógł on później zmieścić się w podstawie probówki 1.5 ml (Rycina 3). Uszczelnienie końcówki tego haczyka zapobiega utracie DNA wewnątrz pipety.
„Duchy” DNA powstają podczas etapu precypitacji i przybierają postać białych, sznurowatych nici (Rysunek 4). Agregują one i przylegają do siebie i/lub do szklanego haczyka używanego do wyłapywania DNA. Dzięki temu ten sam szklany haczyk może posłużyć do zebrania wielu nici DNA z roztworu precypitacyjnego.
| Wybierz kolumnę na podstawie pożądanej objętości: | 10 ml | 15 ml | 20 ml | 40 ml |
| 1M KCl | 1,3 ml | 1,9 ml | 2,5 ml | 5 ml |
| 1M Tris (pH 7,4) | 300 μl | 450 μl | 600 μl | 1,2 ml |
| 1M MgCl22 | 50 μl | 75 μl | 100 μl | 200 μl |
| 0,5 EDTA | 10 μl | 15 μl | 20 μl | 40 μl |
| NP40/IGEPAL | 50 μl | 75 μl | 100 μl | 200 μl |
| β-merkaptoetanol (dodać bezpośrednio przed użyciem) | 4.3 μl | 6.5 μl | 8.6 μl | 17.2 μl |
| Zastosuj proporcje dla pożądanej zawartości glicerolu w procentach (0, 5 lub 45%) | ||||
| 0% glicerolu | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. | Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. |
| woda | 8,3 ml | 12,5 ml | 16,7 ml | 33,4 ml |
| 5% glicerolu | 0,5 ml | 0,8 ml | 1,0 ml | 2,0 ml |
| woda | 7,8 ml | 11,7 ml | 15,7 ml | 31,4 ml |
| 45% glicerolu | 4,5 ml | 6,8 ml | 9,0 ml | 18,0 ml |
| woda | 3,8 ml | 5,7 ml | 7,7 ml | 15,4 ml |
Tabela 1. Składy buforów do LCM
| Dla objętości 50 ml |
| 5 ml 1M NaCl |
| 2,5 ml 1M Tris, pH 7,5 |
| 1 ml 0,5 EDTA |
| 41,5 ml H2O |
Tabela 2. Przygotowanie TNE (0.1 M NaCl; 50 mM Tris, pH 7.5; 10 mM EDTA)
| Dla objętości 1 L |
| 0,2 g KCl |
| 0,2 g KH2PO4 |
| 8 g NaCl |
| 1,15 g Na2HPO4 |
| H2O to 1L |
Tabela 3. Przygotowanie PBS (2.7 mM KCl; 1.5 mM KH2PO4; 137 mM NaCl; 8.1 mM Na2HPO4; pH 7.0)
Rycina 1. Komórki PK15 (A) przed infekcją, (B) w połowie procesu infekcji oraz (C) w fazie efektu cytopatycznego (CPE), po zastosowaniu wysokiej wielokrotności infekcji.
Rycina 2. Przegląd protokołu.
Rycina 3. Trzy reprezentatywne przykłady szklanych haczyków używanych do zbierania pustych kapsydów viralnego DNA.
Rysunek 4. Reprezentatywny przykład dobrze uformowanego i obfitego „ducha” DNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Część tego protokołu została pierwotnie opracowana do izolacji wirusowego DNA w warunkach BSL4, jednak równie dobrze sprawdza się on w warunkach spoza BSL.4 Zazwyczaj stosujemy ten protokół do izolacji DNA z alfaherpeswirusów PRV i HSV-1, których genomy DNA są zamknięte w białkowej kapsydzie i otoczone lipidową otoczką.7,8 Jest on jednak prawdopodobnie bezpośrednio możliwy do zaadaptowania do innych dużych wirusów DNA, w tym beta- i gammaherpeswirusów oraz adenowirusów. Podobne ekstrakcje są powszec...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni za wkład Grega Smitha, Lisy Pomeranz, Matta Lymana, Marlies Eldridge, Haliny Staniszewskiej Goraczniak oraz członków laboratorium Enquista w dopracowanie niniejszego protokołu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluor–etan) | Fisher Scientific | T178-4 | Skontaktuj się ze swoją instytucją w celu uzyskania wytycznych dotyczących właściwej utylizacji odpadów zawierających Freon lub zapoznaj się z publikacją Mendez i in. w celu znalezienia potencjalnych alternatyw dla Freonu.9 |
| Probówki z żelem separującym (Phase lock), wzmocnione, pojemność 15ml | 5 PRIME | 2302850 | Opcjonalnie |
| Probówki do ultrawirówki z poliallomeru | Beckman Coulter Inc. | 331372* | *Wybierz probówki odpowiednie dla Twojej ultrawirówki; te zostały podane wyłącznie jako przykład |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
| Komórki PK-15 | ATCC | CCL-33 | |
| Komórki Vero | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | Hyclone | SH30028.03 |
Bibliografia
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
