Opisujemy proces izolacji wysokiej czystości DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek. Końcowe DNA odzyskane z roztworu charakteryzuje się wysokim stężeniem i czystością, co czyni je idealnym do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji w celu otrzymania nowych rekombinantów wirusowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie viralnego DNA z nukleokapsydów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wirusy są bezwzględnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi, w związku z czym badanie ich DNA wymaga odizolowania materiału wirusowego od zanieczyszczeń i DNA komórki gospodarza. Wiele zastosowań analitycznych wymaga dużych ilości czystego wirusowego DNA, co zapewnia niniejszy protokół. Zastosowania te obejmują sekwencjonowanie genomu wirusowego, w którym usunięcie DNA gospodarza jest kluczowe dla optymalizacji uzysku danych dla sekwencji wirusowych, oraz tworzenie nowych rekombinowanych szczepów wirusowych, gdzie kotransfekcja oczyszczonego plazmidu i linearnego wirusowego DNA ułatwia rekombinację.1,2,3
Niniejsza procedura wykorzystuje kombinację ekstrakcji i wirowania w gradientach gęstości w celu wyizolowania oczyszczonego liniowego DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek.4,5 Początkowe etapy oczyszczania mają na celu wyizolowanie oczyszczonych kapsydów wirusowych, które zawierają i chronią wirusowe DNA podczas etapów ekstrakcji i wirowania służących do usunięcia białek oraz DNA komórkowego. Następnie liza nukleokapsydów uwalnia wirusowe DNA, a dwa końcowe etapy ekstrakcji fenol-chloroformem usuwają pozostałe białka. Końcowe DNA odzyskano z roztworu jest wysoce skoncentrowane i czyste, ze średnim OD260/280 na poziomie 1,90. W zależności od ilości użytych zainfekowanych komórek, wydajność wirusowego DNA mieści się w zakresie 150-800 μg lub więcej. Czystość tego DNA sprawia, że jest ono stabilne podczas długotrwałego przechowywania w 4°C. Dzięki temu DNA to jest idealnie odpowiednie do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji.
Przed rozpoczęciem protokołu ważne jest określenie średniej liczby komórek na naczynie (np. średnio 8 x 106 komórek PK-15 w konfluentnej płytce 15 cm) oraz miana używanego zapasu wirusa (np. 1 x 108 jednostek tworzących plaki na ml). Dane te są niezbędne do obliczenia odpowiedniej wielokrotności infekcji (MOI) dla danego protokołu.6 Na przykład, aby zainfekować jedną płytkę 15 cm z komórkami PK-15 powyższym zapasem wirusa przy MOI wynoszącym 5, należy użyć 400 μl zapasu wirusa i rozcieńczyć go w 3,6 ml medium (całkowita objętość inokulum dla jednej płytki 15 cm wynosi 4 ml).
Jednocześnie można przygotować wiele preparatów wirusowego DNA. Liczba jednoczesnych preparacji jest ograniczona jedynie liczbą probówek mieszczących się w rotorze ultrawirówki (jedna na wirusa; patrz krok 3.9 poniżej). W niniejszej sekcji opisujemy procedurę w odniesieniu do jednego wirusa.
Protokół
1. Pierwszy dzień: Infekcja wirusowa i przygotowanie buforów
- Przygotować od 5 do 10 szalek (o średnicy 15 cm) z hodowlą komórkową do infekcji, np. komórki PK-15 dla wirusa pseudowścieklizny (PRV) lub komórki Vero dla wirusa opryszczki zwykłej (HSV).
- Gdy komórki osiągną 95–100% konfluencji, zainfekować je z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 5–10. W tym celu zaszczepić każdą płytkę, używając zapasu wirusa w całkowitej objętości 4 ml na płytkę, a następnie inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Delikatnie kołysać płytkami co 15 minut, aby zapewnić pełne pokrycie monowarstwy komórek inokulum wirusa. W międzyczasie podgrzać pożyw....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Część tego protokołu została pierwotnie opracowana do izolacji wirusowego DNA w warunkach BSL4, jednak równie dobrze sprawdza się on w warunkach spoza BSL.4 Zazwyczaj stosujemy ten protokół do izolacji DNA z alfaherpeswirusów PRV i HSV-1, których genomy DNA są zamknięte w białkowej kapsydzie i otoczone lipidową otoczką.7,8 Jest on jednak prawdopodobnie bezpośrednio możliwy do zaadaptowania do innych dużych wirusów DNA, w tym beta- i gammaherpeswirusów oraz adenowirusów. Podobne ekstrakcje są powszec.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni za wkład Grega Smitha, Lisy Pomeranz, Matta Lymana, Marlies Eldridge, Haliny Staniszewskiej Goraczniak oraz członków laboratorium Enquista w dopracowanie niniejszego protokołu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluor–etan) | Fisher Scientific | T178-4 | Skontaktuj się ze swoją instytucją w celu uzyskania wytycznych dotyczących właściwej utylizacji odpadów zawierających Freon lub zapoznaj się z publikacją Mendez i in. w celu znalezienia potencjalnych alternatyw dla Freonu.9 |
| Probówki z żelem separującym (Phase lock), wzmocnione, pojemność 15ml | 5 PRIME | 2302850 | Opcjonalnie |
| Probówki do ultrawirówki z poliallomeru | Beckman Coulter Inc. | 331372* | *Wybierz probówki odpowiednie dla Twojej ultrawirówki; te zostały podane wyłącznie jako przykład |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma-Aldrich | I-3021 | |
| Komórki PK-15 | ATCC | CCL-33 | |
| Komórki Vero | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | Hyclone | SH30028.03 |
Bibliografia
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
