Tworzenie dwuwymiarowych wzorzystych substratów do uwięzienia białek i komórek

Summary

Samoorganizujące się monowarstwy (SAM) utworzone z długołańcuchowych tioli alkanowych na złocie dostarczają dobrze zdefiniowanych substratów do tworzenia wzorców białkowych i uwięzienia komórek. Mikrokontaktowe drukowanie heksadekanetiolu za pomocą stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnianie monomerem alkanowo-tiolowym zakończonym glikolem tworzy wzór, w którym białko i komórki adsorbują się tylko w wytłoczonym regionie heksadekanetiolu.

Abstract

Druk mikrokontaktowy zapewnia szybką, wysoce powtarzalną metodę tworzenia dobrze zdefiniowanych podłoży wzorcowych. ¹ Podczas gdy druk mikrokontaktowy może być stosowany do bezpośredniego drukowania dużej liczby cząsteczek, w tym białek,2 ^DNA,3 i silanów,4 tworzenie samoorganizujących się monowarstw (SAM) z długołańcuchowych tioli alkanowych na złocie zapewnia prosty sposób na ograniczenie białek i komórek do określonych wzorów zawierających adhezyjne i oporne regiony. To ograniczenie może być używane do kontrolowania morfologii komórek i jest przydatne do badania różnych pytań z zakresu biologii białek i komórek. W tym miejscu opisujemy ogólną metodę tworzenia dobrze zdefiniowanych wzorców białkowych do badań komórkowych. ⁵ Proces ten składa się z trzech etapów: produkcji wzorzystego wzorca za pomocą fotolitografii, stworzenia stempla PDMS oraz druku mikrokontaktowego na podłożu pokrytym złotem. Po utworzeniu wzoru, te substraty do hodowli komórkowych są zdolne do ograniczania białek i/lub komórek (pierwotnych komórek lub linii komórkowych) do wzorca.

Użycie samodzielnie składającej się jednowarstwowej chemii pozwala na precyzyjną kontrolę nad wzorcowymi regionami kleju białek/komórek i regionami nieadhezyjnymi; nie można tego osiągnąć za pomocą bezpośredniego tłoczenia białek. Heksadekanetiol, długołańcuchowy tiol alkanowy stosowany na etapie drukowania mikrokontaktowego, wytwarza hydrofobową powierzchnię, która łatwo adsorbuje białko z roztworu. Tiol zakończony glikolem, używany do wypełniania niezadrukowanych obszarów podłoża, tworzy monowarstwę, która jest odporna na adsorpcję białek, a tym samym na wzrost komórek. ⁶ Te monomery tiolowe wytwarzają monowarstwy o wysokiej strukturze, które precyzyjnie definiują regiony substratu, które mogą wspierać adsorpcję białek i wzrost komórek. W rezultacie, substraty te są przydatne w wielu różnych zastosowaniach, od badania zachowań międzykomórkowych⁷ po tworzenie mikroelektroniki. ⁸

Podczas gdy inne rodzaje chemii jednowarstwowej były używane do badań nad kulturami komórkowymi, w tym praca naszej grupy wykorzystująca trichlorosilany do tworzenia wzorów bezpośrednio na podłożach ^szklanych,9 wzorzyste monowarstwy utworzone z alkanowych tioli na złocie są proste do przygotowania. Ponadto monomery stosowane do przygotowania monowarstw są dostępne w handlu, stabilne i nie wymagają przechowywania ani obchodzenia się w atmosferze obojętnej. Wzorzyste podłoża przygotowane z tioli alkanowych można również poddać recyklingowi i ponownie wykorzystać, utrzymując uwięzienie komórek. ¹⁰

Protocol

1. Przygotowanie wzorca (Rysunek 1)

1. Wyśrodkować płytkę krzemową na wirowniku i przepłukać płytkę acetonem podczas początkowego etapu dwucyklowego programu wirowania w tabeli 1. Aceton odparuje podczas drugiego etapu programu wirowania, pozostawiając czystą, suchą płytkę.
2. Nałożyć około 1 ml fotorezystu AZ9245 na cal (średnicy) na płytkę i odwirować, stosując warunki opisane w Tabeli 1.
3. Miękkie pieczenie płytki pokrytej fotorezystem w temperaturze 110°C przez 2 m przy użyciu płyty grzejnej o wysokiej jednorodności.
4. Fotowzór podłoża za pomocą systemu fotolitografii do bezpośredniego zapisu lub systemu wyrównywania maski i odpowiedni....

Discussion

W produkcji litograficznej wzorca używanego do tworzenia pieczęci PDMS może pojawić się szereg problemów. Niedoświetlenie płytki pokrytej rezystancją powoduje zamglone i niewyraźne wzory, a prześwietlenie płytki pokrytej rezystancją powoduje powiększenie lub brak cech. Ogólnie rzecz biorąc, wzorce o dużych rozmiarach cech (>10 μm) są stosunkowo łatwe do modelowania i wywoływania, podczas gdy wzorce z mniejszymi cechami mogą wymagać rozległej optymalizacji parametrów fotowzorca i wywoływania (poza parametrami zalecanymi p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	odzyskiwania wafli	krzemowych	2-calowa
powlekarka wirowa / płyta grzejna	Brewer Science, Inc.	Cee 200CB Spin-Bake System
AZ9245 Photoresist	Mays Chemical Company	105880034-1160
System fotolitografii bezpośredniego zapisu	Microtech s.r.l.	LW325 System
Nakładka do masek	HTG	3HR
AZ 400K Developer	Mays Chemical Company	105880018-1160
Sylgard 182 Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning
25 mm nr 1 okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe	VWR international	16004-310
Utleniacz plazmowy	Diener	Femto
Elementy tytanuKamis	Incorporated Granulki		czystości 99,95
	Kamis Incorporated		czystości 99,999%
Parownik wiązki elektronów	Kurt J. Lesker	System osadzania cienkowarstwowego PVD 75	z akcesorium wiązki elektronów
Hexadecanethiol	Alfa	Aesar A11362
1-mercaptoundec-11-yl)tetra(glikol etylenowy)	Sigma-Aldrich	674508
Etanol	Pharmco-AAPER	111000200	200 proof, absolutny
Parafilm	VWR international	52858-000
DPBS	VWR international	4500-434	Bez wapnia i magnezu
Mysz Laminin I	VWR international	95036-762
Fibronektyna z ludzkiego osocza	Invitrogen	33016-015
AlexaFluor® 647 kwas karboksylowy, ester sukcynimidylu	Invitrogen	A-20006
MitoTracker Red 580	Invitrogen	M22425
AlexaFluor® 350 kwas karboksylowy, ester sukcynimidylu	Invitrogen	A-10168
Przeciwciało anty-lamininowe	Fisher Scientific	AB2034MI