Przezczaszkowa stymulacja elektryczna kory ruchowej u obudzonego szczura

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Procedura chirurgiczna: Implantacja elektrody klatki piersiowej

UWAGA: Ten krok można pominąć, gdy przeciwelektroda jest umieszczona zewnętrznie na ogolonej klatce piersiowej za pomocą kamizelki.

1. Położyć gryzonia na brzuchu (na klatce piersiowej) na stole operacyjnym.
   UWAGA: W przypadku znieczulenia wziewnego trzymaj pysk szczura umieszczony w dyszy znieczulającej, dodatkowo zmniejszając stężenie izofluranu do 1,5-2%.
2. Zdezynfekuj ogoloną skórę głowy sprayem dezynfekującym lub wacikiem nasączonym środkiem antyseptycznym (np. etanolem 70%) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Powtórz dwa razy.
3. Przetnij skórę skalpelem w jednej linii od poziomu oczu rostralnych do poziomu ucha środkowego.
   UWAGA: Pozwala to na tunelowanie połączeniowego od wszczepionej elektrody klatki piersiowej w kierunku czubka głowy, a także jest pożądanym cięciem dla umieszczenia elektrody do stymulacji prądem stałym (DCS).
4. Obróć szczura do pozycji leżącej, tak aby klatka piersiowa była odsłonięta.
5. Zdezynfekować skórę klatki piersiowej zgodnie z opisem w kroku 1.2.
6. Podnieś boczną skórę prawej klatki piersiowej za pomocą kleszczy tkankowych i wytnij dziurkę na guzik małymi nożyczkami około 0,5 cm przyśrodkowo od prawej pachy. Następnie wykonaj nożyczkami proste cięcie strzałkowe w orientacji czaszkowej.
7. Uformuj torebkę podskórną, atraumatycznie odłączając skórę od lewego głównego mięśnia piersiowego. Zrób to, kilkakrotnie otwierając małe nożyczki (lub wacik nasączony solą fizjologiczną).
8. Obróć zwierzę na prawy bok, aby tunelować ścieżkę kablową od lewego potylicznego rogu otwartej skóry głowy wzdłuż szyi, aby wyjść do torby piersiowej, penetrując powięź powierzchowną za pomocą kleszczy homeostatycznych.
9. Ostrożnie otwórz kleszcze homeostatyczne, aby chwycić koniec elektrody przymocowanego do elektrody platynowej, nie pozwalając na zbłądzenie ostrych drutów. Przeciągnij przez tunel, aż elektroda wejdzie do woreczka, zorientowana punktem lutowniczym w kierunku lewej tylnej kończyny gryzonia. Obróć gryzonia z powrotem do pozycji leżącej.
10. Przymocuj platynową płytkę sterylnym syntetycznym, plecionym, niewchłanialnym szwem do powięzi piersiowej w dwóch przeciwległych otworach narożnych (dla stabilności zaleca się 4-5 węzłów).
11. Podobnie przymocuj do powięzi za pomocą luźnego węzła, tworząc lekką pętlę przed wejściem do tunelu tkankowego.
12. Zamknij skórę 3-4 szwami skórnymi, w zależności od wielkości nacięcia (ten sam materiał szwów może być użyty do elektrody i).

2. Zabieg chirurgiczny: Umieszczenie panewki przezczaszkowej elektrycznej stymulacji mózgu (tES) Umieść

1. zwierzę w ramce stereotaktycznej.
   UWAGA: W przypadku stosowania znieczulenia wziewnego należy obniżyć stężenie środka znieczulającego do podtrzymującego przepływu izofluranu ~ 1,5-1%, dostosowanego do odruchu szczypania palców u nóg i wzorca oddychania.
2. Zdezynfekuj ogoloną skórę głowy zgodnie z opisem w kroku 1.2.
3. Przeciąć skórę skalpelem w jednej linii od poziomu oczu rostralnych do poziomu ucha środkowego.
   UWAGA: Jeśli elektroda na klatkę piersiową została wykonana, kroki 2.2 i 2.3 zostały już wykonane.
4. Zeskrob okostną (tkankę łączną na czaszce) na boki skalpelem i dokładnie zetrzyj bawełnianymi wacikami. Przymocuj tkankę łączną w 4 rogach nacięcia za pomocą zacisków buldoga i pozwól im zwisać na boki, aby pole operacyjne było otwarte.
5. Nałóż 0,9% soli fizjologicznej, aby oczyścić powierzchnię kości i tkankę za pomocą bawełnianych wacików. Następnie oczyść powierzchnię kości za pomocą 3% H₂O₂ . Unikać kontaktu z tkanką. W ten sposób kość zostanie dokładniej oczyszczona, a drobne krwawienie z kości zostanie zatrzymane. Widoczne stają się również resztki okostnej. Usuń te pozostałości bawełnianym wacikiem, wywierając umiarkowany nacisk.
   UWAGA: Usunięcie resztek okostnej zwiększy przyczepność i trwałość panewki tES przyklejonej do kości.
   1. W przypadku niepowstrzymanego krwawienia, użyj wiertła do kości i dotykaj go przez 1-3 sekundy, lekko naciskając na kość. Ta mechaniczna procedura w większości przypadków zatrzyma krwawienie bez znacznego podgrzania. Nigdy nie używaj elektrokoagulacji na kości; Nawet krótka aplikacja spowoduje uszkodzenie tkanki mózgowej (elektrokoagulacja powinna być stosowana wyłącznie w przypadku krwawienia z tkanki rany).
6. Ponieważ mocujące poprawią przyczepność do ustawienia, wybierz wiertło pasujące do rozmiaru. Umieść dwa otwory na zadziory na dwóch różnych płytkach kostnych, wstępnie nawiercając wiertarką ręczną, a następnie lekko wywierając nacisk pionowy za pomocą wiertła do kości. Unikaj bliskiej odległości od żądanego położenia gniazda tES, ponieważ może to utrudnić wkręcenie elektrody (np. w przypadku lewej pierwotnej kory silnikowej tES wybierz prawą przednią i tylną pozycję ciemieniowej).
7. W przypadku wszczepionej przeciwelektrody należy przebić trzeci otwór znajdujący się w prawej tylnej kości ciemieniowej w celu przyszłego zamocowania tunelizowanego.
8. Umieść plastikowe w otworach na zadziory i dokręć, aż poczujesz pierwsze tarcie. Następnie wykonaj trzy dodatkowe obroty o 180 °. Sprawdź kleszczami stabilność i dodaj jeszcze jeden obrót, jeśli nie jest wystarczająco dokręcony.
   UWAGA: W przypadku dorosłych szczurów zapewni to zewnątrzoponowe umieszczenie bez uszkodzenia opony twardej lub mózgu (w zależności od konstrukcji gwintu liczba zwojów może się różnić). Zastosowanie ze stali nierdzewnej powinno być również wykonalne, ponieważ nawet przy gęstości prądu DCS powyżej progu neurodegeneracji; Umieszczenie nie zaburzało lokalizacji zmiany ani zasięgu poniżej.
9. Włącz lutownicę i podgrzewaj przez około 5 minut. Nawiń wychodzący z tunelu tkankowego po potynicy wokół prawej ciemieniowej, a następnie przetnij go, pozostawiając około 1 cm za uzwojeniem. Ostrożnie zdejmij izolację na końcu za pomocą skalpela.
10. Przymocuj nawinięty do i kości za pomocą kleju cyjanoakrylowego.
11. Nałóż niewielką ilość bezołowiowego lutu cynowego na złącze i na nieosłonięte przewody przeciwelektrody i połącz oba, krótko ściskając obie wstępnie przylutowane części razem, dotykając końcówki lutowniczej, aż lut cynowy się stopi (około 2-3 s). Natychmiast wyjmij grot lutowniczy, aby uniknąć nadmiernego nagrzewania się metalu, co prowadzi do późniejszego uszkodzenia tkanki.
12. Podnieś wykonane na zamówienie gniazdo elektrody tES (rysunek 1B, w kolorze czerwonym) za pomocą wygiętych, ząbkowanych kleszczyków i nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na dolną krawędź gniazda. W przypadku umieszczenia powyżej kory ruchowej i użycia nasadki o średnicy 4 mm, należy umieścić środkowy punkt gniazda w odległości 2 mm z przodu i 2 mm z boku od bregmy. W tej pozycji wewnętrzna przyśrodkowa granica zębodołu powinna kończyć się bezpośrednio na szwie strzałkowym, a granica ogonowa powinna kończyć się na wysokości bregmy. Krótko dociśnij panewkę do kości (większość klejów cyjanoakrylowych twardnieje pod naciskiem).
    UWAGA: Umieszczenie źródła światła bezpośrednio nad gniazdem może ułatwić umieszczenie gniazda.
13. Upewnij się, że kość w obszarze gniazda jest wolna od kleju (sprawdzając światłem, ponieważ klej jest odblaskowy). W przypadku rozlania kleju wyjmij gniazdo, zeskrob klej skalpelem i powtórz krok 2.12.
14. Po umieszczeniu zębodołu na miejscu, a obszar przyszłej stymulacji jest wolny od kleju, najpierw uszczelnij boczną granicę zębodołu do sąsiedniej tkanki za pomocą małej kropli kleju cyjanoakrylowego, aby uniknąć mostka płynu, który mógłby prowadzić do przetaczania prądu w tym miejscu. Nie nakładaj zbyt dużej ilości kleju, ponieważ może on wpłynąć do obszaru stymulacji (jeśli tak się stanie, wróć do kroku 2.12).
    UWAGA: Utrzymanie obszaru stymulacji wolnego od kleju ma kluczowe znaczenie, ponieważ zmniejszenie obszaru stymulacji może znacznie zwiększyć gęstość prądu (A/m²).
15. Przykryj wszystkie klejem cyjanoakrylowym.
16. Wymieszaj dwuskładnikowy dentystyczny cement akrylowy w małej silikonowej tubce lub szklance. Gdy tylko stanie się lepki, nałóż go szpatułką dentystyczną, aby uszczelnić pozostałe granice zębodołu do kości. Unikaj przepływu dentystycznego cementu akrylowego do obszaru stymulacji.
17. Na koniec pokryj całą czaszkę,, przeciwelektrody i gniazdo do 1/3 gniazda dentystycznym cementem akrylowym. Upewnij się, że cement ma odpowiednią lepkość: jeśli jest zbyt płynny, spłynie do otaczającej tkanki; Jeśli jest zbyt twardy, trudno jest go równomiernie rozprowadzić.
18. Kiedy cała kość jest pokryta, a cement stwardniał, usuń zaciski buldoga; skóra powinna po prostu dotknąć nagromadzonego cementu, aby szycie nie było potrzebne. (Jeśli początkowe cięcie zostało wybrane zbyt długie, a tkanka łączna lub mięsień jest widoczny, należy założyć szew zgodnie z opisem w kroku 1.12).
19. Nałóż jedną warstwę jodu za pomocą bawełnianego wacika wokół granicy przeciętej skóry i wstrzyknij podskórnie karprofen (5 mg/kg masy ciała rozpuszczony w 5-7,5 ml 0,9% soli fizjologicznej do leczenia bólu i wymiany płynów).
    UWAGA: Jeśli używasz znieczulenia wziewnego, wyłącz je teraz.
20. Umieść gryzonia w pudełku grzewczym w celu odzyskania zdrowia po znieczuleniu, dopóki gryzoń się nie obudzi i nie zostanie przywrócona stabilność postawy.
    UWAGA: Codziennie sprawdzaj rozwój masy ciała zwierzęcia, stan rany i kryteria ogólnego samopoczucia zgodnie z zaleceniami instytucji.

3. Procedura przezczaszkowej stymulacji elektrycznej

UWAGA: Ponieważ znieczulenie wpływa na efekty tES, zaleca się wykonywanie stymulacji u czujnych gryzoni, gdy tylko jest to możliwe. Pozwól gryzoniowi dojść do siebie przez co najmniej 5 dni (gojenie się rany głowy i klatki piersiowej) przed rozpoczęciem eksperymentów. Eksperymenty można przeprowadzać we wcześniejszych punktach czasowych po operacji, przy użyciu zewnętrznej przeciwelektrody przymocowanej za pomocą kamizelki, ponieważ rana w klatce piersiowej jest najbardziej drażliwa, ale zwierzęta muszą być przyzwyczajone do kamizelki z elektrodą przez kilka dni i mogą wystąpić zakłócenia w zadaniach behawioralnych.

1. Napełnij do połowy gniazdo elektrody tES 0.9% solą fizjologiczną i usuń pęcherzyki powietrza.
2. Przed sesjami katodowej przezczaszkowej stymulacji prądem stałym (tDCS) należy zawsze sprawdzić chlorowanie i, jeśli to konieczne (np. błyszcząca srebrna powierzchnia), ponownie chlorować elektrodę Ag/AgCl. Przed sesjami anodowego tDCS usuń ewentualny nadmiar osadów AgCl z poprzednich stymulacji papierem ściernym, aby zapewnić dobrą przewodność podczas stymulacji. Wkręcić nakrętkę elektrody tES (Rysunek 1B, szary element).
   UWAGA: Brak ponownego chlorowania elektrody między katodowymi sesjami tDCS doprowadzi do wyczerpania chlorowania podczas stymulacji i do nagromadzenia się toksyn w wyniku reakcji elektrochemicznej. Spowoduje to uszkodzenie tkanek. Ponowne chlorowanie nie jest konieczne w ciągu jednej sesji, jeśli czas trwania stymulacji jest krótszy niż 20 minut.
3. Podłącz do dwóch złączy na głowicy (w przypadku stymulacji anodowej anodowy jest podłączony do złącza na nakrętce, w przypadku stymulacji katodowej jest odwrotnie).
   UWAGA: W przypadku korzystania z umieszczonej na zewnątrz przeciwelektrody przykryj przeciwelektrodę żelem przewodzącym i umieść ją na klatce piersiowej gryzonia. Najłatwiej jest, jeśli elektroda jest wstępnie zamocowana w małej kamizelce dla gryzoni, którą gryzoń może nosić podczas stymulacji.
4. Umieść gryzonia w klatce eksperymentalnej, z podłączonymi do krętlika nad klatką, który pozwala na swobodny ruch.
5. Włącz stymulator i dostosuj parametry stymulacji (intensywność stymulacji, czas trwania, czas narastania i opuszczania).
6. Jeśli nie używasz dostępnego na rynku urządzenia stymulacyjnego z alarmem wyłącznika bezpieczeństwa i odłączenia, dołącz miernik do obwodu, aby sprawdzić stały przepływ prądu.
   UWAGA: Dzięki tej konfiguracji stymulacja może być stosowana podczas wykonywania lub trenowania zadań behawioralnych.
7. Sprawdź, czy podczas stymulacji u gryzonia nie ma oznak stresu lub dyskomfortu.
8. Po zakończeniu stymulacji należy odłączyć, odkręcić nasadkę elektrody na głowicy, a następnie wyczyść i osusz gniazdo wacikiem. Przywróć gryzonia do środowiska domowego lub w razie potrzeby wykonaj procedurę behawioralną.

Rysunek 1: Materiały do operacji i schemat techniczny zespołu gniazda tES i nasadki elektrody. a) 1. Waciki bawełniane, 2. środek dezynfekujący, 3. ramka stereotaktyczna, 4. lutownica, 5. leki przeciwbólowe (np. karprofen), 6. & 7. środki znieczulające (np. ksylazyna i ketamina), 8. strzykawka, 9. maszynka do strzyżenia, 10. dziurkacz do uszu, 11. maść do oczu (np. bepanten), 12. Bezołowiowy lut cynowy, 13. dwuskładnikowy dentystyczny cement akrylowy (DAC), 14. Jod, 15. 3% H2O2, 16. 0,9% sól fizjologiczna, 17. szew syntetyczny pleciony niewchłanialny (np. Mersilene 4-0), 18. wiertła, 19. klej cyjanoakrylowy, 20. Zaciski buldoga 21. kleszcze homeostatyczne, 22. Kleszcze z wygiętą, ząbkowaną końcówką, 23. Kleszcze proste, z ostrą końcówką, 24. proste, kleszcze do tkanek, 25. szpatułka dentystyczna, 26. skalpel, 27. nożyczki, 28. wiertarka ręczna, 29. śrubokręt, 30. Wiertarka napędzana silnikiem, 31. złącza żeńskie, 32. Gniazdo tES, 33. kwadratowa elektroda platynowa przymocowana do, złącze lutownicze pokryte klejem histoakrylowym, 34. z tworzywa sztucznego. (B) gniazdo tES (czerwone) do mocowania na czaszce gryzonia o średnicy wewnętrznej 4 mm; zespół elektrody (szary) jest zbudowany z nakrętki i wewnętrznego stempla z centralnym otworem pozostawiającym miejsce na elektrody tarczowej Ag/Cl, który jest przyklejony do dolnej części stempla. Pozwala to na maksymalną stabilność ustawienia i uniknięcie pęknięć drutu w newralgicznym punkcie połączenia drut-elektroda.