System mikroiniekcji mikroprzepływowej do skojarzonego infuzji leków i elektrofizjologii

Streszczenie

Źródło: Vanegas, M. I., et al. System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film przedstawia urządzenie mikroprzepływowe oparte na mikroelektrodach, które dostarcza roztwór leku przez rurkę kapilarną, wykorzystując roztwór markera na bazie oleju do precyzyjnego śledzenia objętości i umożliwiając jednoczesny zapis neuronowy i wlew leku.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Budowa mikroiniektoru do stymulacji i rejestracji (rysunek 1a)

1. Zmierz długość kaniuli i sondy (w tym przykładzie nanoczujnika). Sonda musi być dłuższa od kaniuli o długość, na jaką ma wystawać z końcówki kaniuli (w zależności od konstrukcji sondy) plus około 2 cm.
2. Pod lupą lub mikroskopem (~10-krotne powiększenie) załaduj sondę do kaniuli; jeśli to możliwe, preferowane jest ładowanie wsteczne, aby chronić końcówkę sondy.
   UWAGA: Ten krok, wykonywany ręcznie, jest trudny. Zaleca się ćwiczenie z mikroelektrodą pod szkłem powiększającym przed próbą z rzeczywistą sondą eksperymentalną.
3. Przełóż kaniulę (zawierającą sondę) przez górną tulejkę, złącze T i dolną tulejkę.
   1. Jeśli sonda jest tylko pojedynczym przewodem bez żadnych załączników, załaduj ją z powrotem do kaniuli i włóż zespół do trójnika od dolnej tulejki. Górna część kaniuli (strona z płaskim końcem) powinna znajdować się pośrodku złącza T, w dolnej, ale nie górnej tulejce. Sonda eksperymentalna lub bioczujnik powinny wystawać ponad górną część tulejki.
      UWAGA: Tuleje wykonane na zamówienie można również wykonać, wiercąc otwór w zaślepkach tulejek za pomocą mikrowierteł, przy czym rozmiar otworu zależy od średnicy potrzebnej do dokręcenia kaniuli do złącza T.
4. Użyj klucza do tulejek, aby dokręcić tuleje na górze i na dole trójnika. Nie dokręcaj zbyt mocno. Można dodać mały kawałek rurki, aby wzmocnić podparcie elektrody w górnej tulejce.
5. złote piny do każdego z zacisków sondy (sygnał, masa itp.), zgodnie ze specyfikacją sondy.
6. Dostosuj względne położenie sondy i kaniuli. Zmierz odległość, na jaką sonda wystaje z kaniuli pod powiększeniem i wyreguluj ręcznie od górnego końca (sonda może swobodnie przesuwać się w tulejach).
7. Dodaj klej epoksydowy między złotymi kołkami a górną skuwką, aby przymocować sondę do tulejki.
8. Odkręć górną tuleję, aby schować sondę wewnątrz kaniuli. Potwierdź wzrokowo, że sonda znajduje się całkowicie w kaniuli w powiększeniu.
9. Podłącz wtryskiwacz do mikronapędu.

2. Budowa mikroiniektora do infuzji leków (rysunek 1b)

1. Przymocuj "nieskośny" lub płaski koniec kaniuli do dolnej części złącza T za pomocą tulejki. Użyj klucza do tulejki, aby dokręcić tuleję.
2. Przymocuj mały kawałek rurki kapilarnej (~ 1,5 cm) do górnej części złącza T, przepuszczając go przez standardową tulejkę. Dokręć kluczem do tulejek.
3. Załaduj mikroelektrodę z powrotem przez rurkę kapilarną, złącze T, kaniulę i odpowiednie tulejki.
4. Upewnij się, że tylny koniec elektrody wystaje mniej niż 1 cm z tyłu rurki kapilarnej, a końcówka elektrody wystaje z kaniuli w żądanej odległości od spodu. Położenie elektrody można regulować ręcznie od góry.
5. złoty pin do końcówki mikroelektrody.
6. Dodaj klej epoksydowy między złotą szpilką a górną skuwką, aby przymocować mikroelektrodę do tulejki.
7. Odkręć górną tuleję, aby schować sondę wewnątrz kaniuli. Potwierdź wzrokowo, że mikroelektroda jest całkowicie schowana w kaniuli.

3. Budowa obwodu mikroprzepływowego (rysunek 2)

1. Umieść płytkę stykową na stabilnej powierzchni. Umieść dwa zawory trójdrogowe równolegle do najdłuższych boków płytki stykowej, około 6 cali. osobno, z jednym portem (tym, który jest zawsze otwarty) skierowanym do siebie. Użyj, aby przymocować zawory do płytki stykowej.
2. Umieść linijkę obok zaworów (aby mierzyć i śledzić ruch płynów wewnątrz rurki kapilarnej).
3. Załaduj mieszaninę oleju o niskiej lepkości w stosunku 1:1 i barwnika spożywczego (markera) do gazoszczelnej strzykawki i umieść w pompie Marker. Wytnij jeden kawałek rurki kapilarnej i użyj standardowych tulejek i złączy Luer-lock, aby podłączyć strzykawkę do jednego z portów na zaworze wejściowym. To jest "linia znacznika".
4. Wytnij krótki kawałek rurki kapilarnej na "linię linijki". Użyj standardowych tulejek, aby dokręcić do portów czołowych zaworów.
5. Wytnij dwa dłuższe kawałki rurki kapilarnej, aby połączyć zawór wyjściowy z mikrowtryskiwaczem i podłączyć pompę leku z zaworem wejściowym (użyj standardowych tulejek).
   UWAGA: Długość tych dwóch przewodów zależy od konfiguracji eksperymentalnej, jedna musi być wystarczająco długa, aby sięgać od aparatu infuzyjnego do zwierzęcia, a druga od pompy leku do zaworu wejściowego. Użyj kamienia do rozłupywania, aby przeciąć rurkę kapilarną.

4. Montaż mikroiniektoru do mikronapędu (Rysunek 3)

1. Przed montażem upewnij się, że mikroelektroda/sonda eksperymentalna jest schowana w kaniuli.
   UWAGA: Rurka prowadząca powinna znajdować się w jednym miejscu w mikronapędzie.
2. Podłącz specjalnie wykonany adapter do mikrowtrysku.
3. Załaduj mikrowtryskiwacz od góry przez rurkę prowadzącą i przymocuj go do adaptera za pomocą.
4. Zmierz położenie (głębokość) mikronapędu, na którym mikroiniekcja wystaje z rurki prowadzącej, a następnie wsuń ją o ~1 cm, aby przygotować się do włożenia.
5. W przypadku eksperymentów z mikroinfuzją podłącz "linię mózgową" do nieużywanego otworu złącza T mikroelektrody. Użyj standardowej tulejki i dokręć ją kluczem do tulejek.

5. Płukanie i przygotowanie układu mikroprzepływowego

1. Umieścić mikronapęd z mikrowtryskiwaczem nad zlewką na odpady.
2. Załadować chlorheksydynę (np. nolvasan rozpuszczony w stężeniu 20 g/l) do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 1 ml i umieścić ją w pompie do leku. Obróć kierunek przepływu zaworów tak, aby płyn przepływał z pompy leku przez zawór do przewodu zaworu i na zewnątrz "linii mózgu".
3. Przepłukać obwód chlorheksydyną przy niskim natężeniu przepływu (50-200 μl/min) przez co najmniej 10 minut. Powtórz kroki od 5.2 do 5.3 sterylną solą fizjologiczną, a następnie powietrzem.
   UWAGA: Na tym etapie ważne jest, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków. Delikatnie nałóż niestrzępiące się chusteczki na skrzyżowaniach, aby odsłonić wszelkie wycieki płynu przez tulejki.
4. Załaduj lek do gazoszczelnej strzykawki o pojemności 500 μl, spręż powietrze, a następnie umieść w pompie leku. Przepływać z prędkością 50 μl/min, aż z mikroiniekcji wypłynie kilka kropel.
5. Namoczyć rurkę prowadzącą w chlorheksydynie (rozpuszczonej w stężeniu 20 g/l) przez 15 minut.
6. Obróć kierunek zaworu wyjściowego w kierunku "linii płukania". Przesuwaj pompę markera, aż na linii linijki pojawi się wyraźna krawędź koloru i oleju. Upewnij się, że między lekiem a kolorem zawsze znajduje się olej, aby nie zmieszać dwóch rozpuszczalnych w wodzie materiałów i nie stracić ostrej krawędzi między nimi. Zaznacz pozycję początkową tej linii oleju/barwnika (za pomocą kawałka taśmy lub markera).
7. Obróć kierunek zaworu wyjściowego w kierunku linii mózgu.

6. Wykonywanie eksperymentu z nagrywaniem lub infuzją

UWAGA: Etapy postępowania ze zwierzętami będą się różnić w zależności od laboratorium i eksperymentu. Następujące kroki należy wykonać po niezbędnym ustawieniu chirurgicznym i przygotowaniu do odsłonięcia opony twardej. Po eksperymencie wszystkie niezbędne kroki po zabiegu muszą zostać wykonane zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.

1. Podłącz mikronapęd do komory nagrywania. Opuść rurkę prowadzącą, aby przeniknąć do opony twardej.
   UWAGA: Rurka prowadząca nie powinna penetrować dalej niż opona twarda, aby uniknąć uszkodzenia kory.
2. Opuścić mikrowstrzyknięcie do około 2 mm powyżej miejsca zapisu/wstrzyknięcia do mózgu.
3. Dokręć górną tulejkę (wystającą mikroelektrodę/biosensor) i podłącz złote piny do systemu nagrywania. Kontynuuj przesuwanie mikroiniekcji do miejsca docelowego.
   UWAGA: Pamiętaj, aby w obliczeniach uwzględnić odległość, na jaką mikroelektroda wystaje poza kaniulę.
4. W przypadku eksperymentów infuzyjnych użyj ręcznej pompki mikrostrzykawkowej, aby przesunąć kolumnę oleju o 1 cm co 3 minuty (~60 nL/min). Po podaniu żądanej objętości przełącz zawór wyjściowy w kierunku linii płukania.
   UWAGA: Objętość podawanej infuzji będzie się różnić w zależności od gatunku modelu i docelowego obszaru mózgu. Szybszy przepływ może uszkodzić tkankę nerwową.
5. Po zakończeniu eksperymentów wsuń mikroiniekcję w rurkę prowadzącą (pozostaw sondę wysuniętą). Następnie wyjmij mikronapęd w celu przepłukania. Przepłukać układ mikroprzepływowy, aby przygotować go do ponownego użycia. nuta: Z naszego doświadczenia wynika, że mikroiniekcja wystarczy na kilka zastosowań, jeśli zachowa się odpowiednią ostrożność. Jakość zapisu elektrofizjologicznego spada szybciej niż zdolność do iniekcji.

Wyniki

Rysunek 1: Produkcja mikrowtrysku krok po kroku. (a) Konfiguracja do użytku niezależnego od układu mikroprzepływowego. Kaniula i sonda są mierzone w celu potwierdzenia, że końcówka sondy może być wysunięta na żądaną długość (...

Materiały