Fotoliza związków klatkowanych pozwala na gwałtowny i zlokalizowany wzrost stężenia różnych związków aktywnych fizjologicznie. W niniejszej pracy przedstawiamy sposób uzyskiwania rejestracji metodą patch-clamp w połączeniu z fotolizą klatkowanego cAMP lub klatkowanego Ca w celu badania transdukcji węchowej w dysocjowanych neuronach sensorycznych węchu myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Fotoliza błyskowa związków klatkowych w rzęskach neuronów sensorycznych węchu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fotoliza związków klatkowych umożliwia gwałtowny i miejscowy wzrost stężenia różnych związków aktywnych fizjologicznie1. Związki klatkowe to cząsteczki, które zostały uczynione nieaktywnymi fizjologicznie poprzez chemiczną klatkę, którą można rozbić za pomocą błysku światła ultrafioletowego. W niniejszej pracy pokazujemy, jak przeprowadzić rejestrację metodą patch-clamp w połączeniu z fotolizą związków klatkowych w celu badania transdukcji węchowej w dysocjowanych neuronach sensorycznych węchu myszy. Proces transdukcji węchowej (Rysunek 1) zachodzi w rzęskach neuronów sensorycznych węchu, gdzie wiązanie odorantów z receptorami prowadzi do wzrostu poziomu cAMP, co otwiera kanały cyklicznych nukleotydów (CNG)2. Wpływ Ca przez kanały CNG aktywuje kanały Cl aktywowane przez Ca. Pokazujemy, jak dysocjować neurony z nabłonka węchowego myszy3 oraz jak aktywować kanały CNG lub kanały Cl aktywowane przez Ca poprzez fotolizę klatkowego cAMP4 lub klatkowego Ca5. Używamy lampy błyskowej6,7 do aplikowania błysków ultrafioletowych do obszaru rzęsek w celu uwolnienia cAMP lub Ca, podczas gdy rejestracja patch-clamp służy do pomiaru prądu w konfiguracji whole-cell voltage-clamp8-11.
Protokół
1. Instrumentacja
- Aby zmierzyć odpowiedź neuronów sensorycznych węchu na fotolizę związków w klatkach (caged compounds), stosujemy lampę błyskową w połączeniu z typowym systemem do rejestracji patch-clamp, który obejmuje: wzmacniacz patch-clamp, elektrodę rejestrującą i elektrodę referencyjną podłączone do przedwzmacniacza (head-stage) wzmacniacza patch-clamp, dygityzator, komputer, oprogramowanie do akwizycji danych, mikromanipulatory, mikroskop epifluorescencyjny, system perfuzyjny, stół antywibracyjny oraz klatkę Faradaya (Rysunek 2).
- Do generowania intensywnego błysku światła ultrafioletowego (UV) używamy ksenonowej lampy błyskowej (Rapp OptoEl....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Fotoliza błyskowa związków w klatkach (caged compounds) połączona z rejestracją metodą patch-clamp jest użyteczną techniką pozwalającą na uzyskanie szybkich i lokalnych skoków stężenia fizjologicznie czynnych cząsteczek zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórek. Zsyntetyzowano kilka rodzajów związków w klatkach1, a technikę tę można stosować w odniesieniu do różnych typów komórek, w tym do komórek hodowlanych wykazujących ekspresję kanałów jonowych, które mogą być aktywowane lub modulowane poprzez fotolizę niektórych z.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Moduł adaptera lampy błyskowej do mikroskopu | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Stół pneumatyczny | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitalizator | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Oprogramowanie do akwizycji danych | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Oprogramowanie do analizy danych | WaveMetrics | Igor | |
| Lustro do modułu adaptera | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Uchwyt elektrody | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’klatka S | Wykonany na zamówienie | ||
| Kostka filtracyjna | Olympus Corporation | U-MWU | Usunięto filtr wzbudzenia |
| Lampa błyskowa | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Pinceta Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Kapilary szklane | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| Szkiełko z dnem szklanym | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Oświetlacz | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| Mikroskop odwrócony | Olympus Corporation | IX70 | |
| Mikromanipulatory | Luigs & Neumann | SM I | |
| Wytwarzarka mikropipet | Narishige International | PP-830 | |
| Monitorowanie | HesaVision | MTB-01 | |
| Filtry neutralnej gęstości | Omega Optical | zróżnicowany | |
| Obiektyw 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Zeiss lub Olympus |
| Obiektyw 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Zeiss lub Olympus |
| Optyczny filtr UV krótkoprzepustowy | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Wzmacniacz patch-clamp | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Zespół fotodiody | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Kwarcowy światłowód | Rapp OptoElectronic | zmienia się | Używamy 600 μśrednica m |
| Drut srebrny | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| Srebrny pellet mielony | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Lampa ksenonowa łukowa | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| Odczynnik | Firma | Numer katalogowy | |
| cAMP w klatce BCMCM | BioLog | B016 | |
| Seryjowa albumina bydlęca (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| roztwór wzorcowy CaCl2 0,1 M | Fluka | 21059 | |
| Klatkowany Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| Cysteina | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| Konkanawalina A typu V (ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNaza I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Leupeptyna | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Papaina | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Poly-L-lizyna | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| pirogronian sodu | Sigma-Aldrich | P2256 |
Bibliografia
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
