Fotoliza związków klatkowanych pozwala na gwałtowny i zlokalizowany wzrost stężenia różnych związków aktywnych fizjologicznie. W niniejszej pracy przedstawiamy sposób uzyskiwania rejestracji metodą patch-clamp w połączeniu z fotolizą klatkowanego cAMP lub klatkowanego Ca w celu badania transdukcji węchowej w dysocjowanych neuronach sensorycznych węchu myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Fotoliza błyskowa związków klatkowych w rzęskach neuronów sensorycznych węchu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fotoliza związków klatkowych umożliwia gwałtowny i miejscowy wzrost stężenia różnych związków aktywnych fizjologicznie1. Związki klatkowe to cząsteczki, które zostały uczynione nieaktywnymi fizjologicznie poprzez chemiczną klatkę, którą można rozbić za pomocą błysku światła ultrafioletowego. W niniejszej pracy pokazujemy, jak przeprowadzić rejestrację metodą patch-clamp w połączeniu z fotolizą związków klatkowych w celu badania transdukcji węchowej w dysocjowanych neuronach sensorycznych węchu myszy. Proces transdukcji węchowej (Rysunek 1) zachodzi w rzęskach neuronów sensorycznych węchu, gdzie wiązanie odorantów z receptorami prowadzi do wzrostu poziomu cAMP, co otwiera kanały cyklicznych nukleotydów (CNG)2. Wpływ Ca przez kanały CNG aktywuje kanały Cl aktywowane przez Ca. Pokazujemy, jak dysocjować neurony z nabłonka węchowego myszy3 oraz jak aktywować kanały CNG lub kanały Cl aktywowane przez Ca poprzez fotolizę klatkowego cAMP4 lub klatkowego Ca5. Używamy lampy błyskowej6,7 do aplikowania błysków ultrafioletowych do obszaru rzęsek w celu uwolnienia cAMP lub Ca, podczas gdy rejestracja patch-clamp służy do pomiaru prądu w konfiguracji whole-cell voltage-clamp8-11.
Protokół
1. Instrumentacja
- Aby zmierzyć odpowiedź neuronów sensorycznych węchu na fotolizę związków w klatkach (caged compounds), stosujemy lampę błyskową w połączeniu z typowym systemem do rejestracji patch-clamp, który obejmuje: wzmacniacz patch-clamp, elektrodę rejestrującą i elektrodę referencyjną podłączone do przedwzmacniacza (head-stage) wzmacniacza patch-clamp, dygityzator, komputer, oprogramowanie do akwizycji danych, mikromanipulatory, mikroskop epifluorescencyjny, system perfuzyjny, stół antywibracyjny oraz klatkę Faradaya (Rysunek 2).
- Do generowania intensywnego błysku światła ultrafioletowego (UV) używamy ksenonowej lampy błyskowej (Rapp OptoElectronic JML-C2 Flash Unit, Rysunek 3A), która działa poprzez rozładowanie kondensatora wysokiego napięcia przez krótkołukową lampę błyskową wypełnioną gazem ksenonowym6-7. Błysk światła może być wyzwalany ręcznie lub komputerowo, przy użyciu tego samego oprogramowania, które steruje akwizycją elektrofizjologiczną.
- W szczelinę wyjściową lampy błyskowej wstawiany jest filtr UV krótkoprzepustowy zoptymalizowany do aplikacji uwalniania związków z klatek (uncaging) (270-390 nm), a do mikroskopu podłączany jest kwarcowy światłowód (patrz 1.5).
- Intensywność błysku światła, a tym samym zakres fotolizy, można modyfikować poprzez zmianę określonych parametrów:
napięcia lub pojemności6. Rzeczywiście, intensywność światła jest powiązana z energią zmagazynowaną w kondensatorze i zależy od wartości pojemności oraz napięcia na nim, zgodnie ze standardowym wzorem 0.5 CV2. Na panelu przednim naszej lampy błyskowej można wybrać jedną z trzech wartości pojemności (C1=1000 μF, C2=2000 μF lub C3=3000 μF), a napięcie może być zmieniane w zakresie od 100 do 385 V (Rysunek 3A), co generuje energię zmagazynowaną od 5 do 220 J. Czas trwania błysku wynosi od 0,5 do 1 ms przy pełnej szerokości połówkowej (FWHM) i zależy od wybranej wartości pojemności. Przed wybraniem innej pojemności lub ustawieniem niższej wartości napięcia konieczne jest rozładowanie kondensatora poprzez wybranie trybu rozładowania (discharge mode) na panelu przednim lampy błyskowej (Rysunek 3A).
Jednak energia świetlna nie jest po prostu proporcjonalna do energii zmagazynowanej z wielu powodów związanych z fizyką wyładowań gazowych oraz nieliniowymi stratami w obwodzie wraz ze wzrostem energii elektrycznej6. Do pomiaru energii związanej z błyskiem światła można użyć dżulomierza, takiego jak JM10 firmy RappOptoElectronics. Należy zauważyć, że energia na wyjściu kwarcowego światłowodu z zainstalowanym filtrem UV mieści się w zakresie 1-15 mJ na błysk, zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia Rapp OptoElectronic Flash Unit.
Wraz z jednostką lampy błyskowej dostarczany jest zespół fotodiody (Rysunek 3B), który może być użyty do szacowania zmian intensywności światła w funkcji C i V. Sygnał wyjściowy fotodiody jest bowiem proporcjonalny do intensywności światła. Zgodnie z instrukcją obsługi, światłowód podłącza się do wejścia zespołu fotodiody, a wyjście do oscyloskopu. Rysunek 3C przedstawia szczytowe napięcie wyjściowe fotodiody w odpowiedzi na błyski światła dla trzech wartości pojemności C1, C2 lub C3, dostępnych w naszej jednostce lampy błyskowej, w funkcji przyłożonego napięcia. Wartości te będą się zmieniać wraz ze zużyciem żarówki błyskowej. Dobrą praktyką jest regularne używanie fotodiody w celu sprawdzania stopnia zużycia żarówki.
Zamiast modyfikować pojemność i/lub napięcie na panelu przednim, bardziej precyzyjną i szybszą kontrolę intensywności światła uzyskuje się poprzez umieszczenie filtrów neutralnych (ND) w drugiej szczelinie filtra lampy błyskowej (Rysunek 3A). Podejście to jest szybsze i dodatkowo nie zmienia czasu trwania błysku, który zależy od wybranej wartości pojemności. Dzięki filtrom neutralnym o transmitancji od 100% do 0,1% intensywność błysku można szybko modyfikować w szerokim zakresie. - Błysk światła jest kierowany na neuron, wysiany na szalkach z dna szklanego, poprzez kwarcowy światłowód (Rysunek 2). Światłowód jest połączony z przystawką epifluorescencyjną mikroskopu odwróconego za pomocą adaptera. Zmodyfikowany kostk filtracyjny bez filtra wzbudzenia kieruje wiązkę UV na neuron za pomocą lustra dichroicznego.
- Światło jest ogniskowane przez obiektyw imersyjny 100x. Obszar objęty błyskiem jest wizualizowany poprzez włożenie światłowodu do iluminatora zapewniającego ciągłe źródło światła widzialnego. Obraz (reprezentowany kolorem żółtym w filmie) jest wyświetlany na monitorze za pomocą kamery CCD podłączonej do mikroskopu. Na monitorze rysowany jest kontur oświetlonego obszaru, aby zlokalizować miejsce błysku UV dla eksperymentów. Przed podaniem błysku UV region rzęskowy neuronu jest ustawiany w obszarze zaznaczonym na monitorze.
- Wielkość plamki światła UV jest kontrolowana przez powiększenie obiektywu, średnicę światłowodu oraz położenie światłowodu z tyłu mikroskopu. Używamy obiektywu imersyjnego o powiększeniu 100x. Średnicę okrągłej plamki mierzy się, kierując światło z iluminatora na preparat z mikrometrem umieszczony na stoliku mikroskopu. Średnica plamki w naszej konfiguracji wynosi w przybliżeniu 16, 33, 50 lub 105 μm dla światłowodów o średnicach odpowiednio 200, 400, 600 lub 1250 μm.
2. Przygotowanie roztworów
Sekcja
- Roztwór Ringera: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glukozy, 1 mM pirogronianu sodu (pH 7,4 skorygowane za pomocą 1M NaOH).
- Roztwór stopujący: roztwór Ringera z 0,1 mg/ml BSA, 0,3 mg/ml leupeptyny i 0,02 mg/ml DNaseI.
- Bezwartościowy dwuwartościowy roztwór Ringera: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM glukozy, 1 mM pirogronianu sodu (pH 7,4 przy użyciu 1M NaOH). Do dysocjacji enzymatycznej dodać 200 μM cysteiny i 2 U/ml papainy.
Uwaga: Roztwory do sekcji należy przefiltrować sterylnie.
Roztwory do rejestracji metodą patch-clamp
Roztwory zewnątrzkomórkowe
- Pozakomórkowy roztwór Ringera: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glukozy, 1 mM pirogronianu sodu (pH 7.4 skorygowane za pomocą 1M NaOH).
- Roztwór Ringera z niską zawartością Ca: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glukozy, 1 mM pirogronianu sodu (pH 7.4 skorygowane za pomocą 1M NaOH).
Roztwory wewnątrzkomórkowe
Roztwory związków klatkowych należy zawsze przygotowywać i stosować w przyciemnionym świetle, aby uniknąć degradacji związków klatkowych pod wpływem światła otoczenia. Pojemniki należy chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
Klatkowany cAMP:
- Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy zawierający 145 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgATP oraz 0.1 mM NaGTP (pH 7.4 dostrojone za pomocą 1M KOH).
- Przygotować roztwór zapasowy, rozpuszczając klatkowany cAMP (BCMCM-cAMP4) w DMSO do stężenia 50 mM. Rozdzielić na alikwoty po 5 μl. Przechowywać do jednego roku w temperaturze -20°C.
- Rozpuścić alikwot roztworu zapasowego klatkowanego cAMP w roztworze wewnątrzkomórkowym, aby uzyskać stężenie końcowe 50 μM klatkowanego cAMP. Wymieszać za pomocą wortexa.
- Przygotować alikwoty po 1 ml roztworu wewnątrzkomórkowego z klatkowanym cAMP. Przechowywać do dwóch miesięcy w temperaturze -20°C do momentu użycia.
Klatkowany Ca:
Przygotowujemy roztwory wewnątrzkomórkowe zawierające 3 mM DMNP-EDTA5 z 50% nasyceniem 1.5 mM Ca.
- Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy zawierający 140 mM KCl (lub CsCl) oraz 10 mM HEPES (pH 7,4 skorygowane za pomocą 1M KOH lub CsOH).
- Otworzyć fiolkę zawierającą 5 mg DMNP-EDTA. Dodać 52,8 μl wzorca roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,1 M oraz 1 ml roztworu wewnątrzkomórkowego. Wymieszać za pomocą wortexa.
- Aby uniknąć uwalniania uwięzionego Ca pod wpływem światła otoczenia, przenieść roztwór do probówki zabezpieczonej przed światłem folią aluminiową. Dodać roztwór wewnątrzkomórkowy do uzyskania końcowej objętości 3,5 ml. Wymieszać za pomocą wortexa. Przygotować alikwoty roztworu wewnątrzkomórkowego z uwięzionym Ca o objętości około 1 ml i przechowywać do dwóch miesięcy w temperaturze -20°C do momentu użycia.
Uwagi: Podczas przeprowadzania eksperymentów należy chronić roztwory związków klatkowych przed światłem za pomocą folii aluminiowej i przechowywać je w lodzie. Roztwór wewnątrzkomórkowy należy przefiltrować sterylnie.
3. Dysocjacja neuronów sensorycznych węchowych myszy
Zwierzęta były traktowane zgodnie z włoskimi wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (Decreto Legislativo 27/01/1992, nr 116) oraz wytycznymi Unii Europejskiej w zakresie badań na zwierzętach (Nr 86/609/EEC).
- Przygotować trzy szalki z przeszklonym dnem pokryte 10 mg/ml konkawaliny A oraz 10 mg/ml poli-L-lizyny.
- W celu przygotowania do sekcji przygotować 1 ml zero-dwuwartościowego roztworu Ringera. Napełnić dwie 50 mm szalki Petriego pokryte Sylgardem roztworem Ringera i umieścić je w lodzie. Schłodzić również mieszaninę papainy z cysteiną, 0,5 ml roztworu stopującego oraz strzykawkę z filtrem 0,22 μm zawierającą około 10 ml roztworu Ringera.
- Uśmiercić mysz poprzez uduszenie CO2, a następnie dekapitację. Usunąć skórę pokrywającą czaszkę, naciąć wzdłuż linii żuchwy i umieścić głowę w szalce Petriego pokrytej Sylgardem.
- Umieścić szalkę pod stereomikroskopem. Za pomocą skalpela dokonać cięcia strzałkowego głowy wzdłuż linii środkowej. Obrócić połowę głowy stroną przyśrodkową do góry. Ostrożnie usunąć przegrodę, aby odsłonić błony nosowe (patrz również Cygnar et al., 201013).
- Za pomocą pęsety nr 3 i skalpela usunąć błony nosowe wyścielone nabłonkiem węchowym. Przenieść je do szalki Petriego pokrytej Sylgardem.
- Za pomocą superprecyzyjnej pęsety nr 55 oddzielić fragmenty nabłonka węchowego od przylegających części błon nosowych. Przenieść je do probówki zawierającej 1 ml zero-dwuwartościowego roztworu Ringera. Dodać mieszaninę papainy i cysteiny. Za pomocą mikronozyciór rozdrobnić nabłonki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Delikatnie rozdrobnić ponownie mikronozyciorami i odczekać kolejne 5 minut.
- Za pomocą wypalanej pipety Pasteura przenieść zawartość do probówki zawierającej 0,5 ml roztworu stopującego.
- Wirować przy 300 g (1500 RPM) przez 5 minut. Odlać nadsącz i dodać około 1 ml filtrowanego roztworu Ringera. Delikatnie homogenizować za pomocą wypalanej pipety Pasteura.
- Nanieść około 0,3 ml roztworu zawierającego komórki na środek trzech szalek z przeszklonym dnem. Pozostawić komórki do osiadania przez około jedną godzinę w temperaturze +4°C. Dodać roztwór Ringera.
4. Rejestracja
- Przygotować pipety do patch-clampu z kapilar borokrzemianowych tak, aby uzyskać oporność od 3-7 MΩ po napełnieniu ich roztworem wewnątrzkomórkowym.
- Umieścić na stoliku mikroskopu odwróconego naczynko z dna szklanego zawierające dysocjowane neurony sensoryczne węchowe. Perfundować roztworem Ringera.
- Strzykawkę zawierającą roztwór wewnątrzkomórkowy z klatkowanymi związkami (caged compounds) osłonić przed światłem folią aluminiową i przechowywać w lodówce. Pracować w przyciemnionym świetle, aby uniknąć degradacji klatkowanych związków pod wpływem światła otoczenia.
- Przy powiększeniu 100x odnaleźć izolowany neuron sensoryczny węchowy z nienaruszonymi rzęskami. Przesunąć stolik mikroskopu tak, aby obszar rzęsek znajdował się wewnątrz okręgu narysowanego na monitorze, w celu zlokalizowania wcześniej zdefiniowanego obszaru błysku UV.
- Napełnić pipetę do patch-clampu roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym klatkowany związek, używając elastycznej igły. Usunąć pęcherzyki powietrza z końcówki pipety. Włożyć pipetę do uchwytu w głowicy wzmacniacza patch-clamp. Za pomocą mikromanipulatora zbliżyć się do somy neuronu i zastosować delikatne ssanie w celu uzyskania uszczelnienia gigaohmowego (gigaohm seal). Ustawić napięcie na -60 mV i zastosować dodatkowe ssanie, aby przejść w tryb whole-cell, stosując standardowe techniki patch-clamp12.
- Odczekać co najmniej dwie minuty na dyfuzję klatkowanego związku do rzęsek.
- Uruchomić na komputerze protokół stymulacji i zarejestrować odpowiedź. Zastosować filtr dolnoprzepustowy 1 kHz i digitalizować sygnał z częstotliwością próbkowania co najmniej 2 kHz.
- Typowy protokół stymulacji polega na utrzymaniu stałej wartości napięcia i wyzwoleniu błysku UV z lampy błyskowej w celu fotolizy klatkowanego związku w obszarze rzęsek.
5. Reprezentatywne wyniki:
Powinieneś być w stanie przeprowadzić lokalne odblokowanie klatkowanego cAMP lub klatkowanego Ca w regionie rzęskowym wyizolowanego neuronu sensorycznego węchu oraz zarejestrować odpowiedź prądową w konfiguracji voltage-clamp w trybie whole-cell.
Rysunek 4 przedstawia typowy prąd wewnątrzkomórkowy wywołany błyskiem UV powodującym fotolizę klatkowanego cAMP, zarejestrowany przy napięciu -60 mV w obecności zewnętrznego roztworu Ringera o niskiej zawartości Ca. W tych warunkach prąd wewnątrzkomórkowy wynika z napływu Na przez kanały CNG. Faza wzrostowa prądu była szybka i została dopasowana do pojedynczej funkcji wykładniczej ze stałą czasową 3,4 ms.
Rycina 5A-B przedstawia odpowiedzi innego obwąchowego neuronu sensorycznego w niskim stężeniu Ca oraz w roztworze Ringera z 1mM Ca. Faza wzrostowa prądu przy -60 mV stała się znacznie wolniejsza i wielofazowa (Rycina 5 A-B). Jest to spowodowane działaniem jonów Ca wnikających do rzęsek poprzez kanały CNG i aktywujących wtórny prąd Cl10. Wcześniejsza kationowa składowa prądu, wynikająca z aktywacji CNG, jest mniejsza w roztworze Ringera z 1mM Ca niż w roztworze z niskim stężeniem Ca z powodu blokady wywołanej przez przenikające jony Ca, które redukują całkowity prąd.
Innym sposobem na ograniczenie wzrostu stężenia Ca w rzęskach jest utrzymanie potencjału neuronu na poziomie +60 mV (Rysunek 5 C-D). Faza wzrostowa odpowiedzi wywołanej odblokowaniem cAMP przy +60 mV była dobrze opisana przez pojedynczą funkcję wykładniczą ze stałą czasową wynoszącą 6,7 ms, co wskazuje na obecność tylko jednego komponentu prądu.
Poprzez fotouwalnianie Ca wewnątrz rzęsek neuronu sensorycznego węchu powinno być możliwe zmierzenie szybko rosnącego prądu. Prąd ten jest przenoszony przez jony Cl. Rycina 6 A przedstawia prądy wewnątrzkomórkowe przy -50 mV wywołane fotouwalnianiem klatkowanego Ca w odpowiedzi na błyski UV o różnych intensywnościach. Faza wzrostu prądów Cl aktywowanych przez Ca była dobrze opisana za pomocą pojedynczej funkcji wykładniczej ze stałymi czasowymi wynoszącymi od 3,8 do 5 ms (Rycina 6 B).
Rycina 1. Transdukcja węchowa w rzęskach neuronów sensorycznych węchu. Cząsteczki odorantów wiążą się z receptorami węchowymi (OR), aktywując białko G, które z kolei aktywuje cyklazę adenylową (ACIII), powodując wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia cAMP. cAMP otwiera kanały sterowane cyklicznymi nukleotydami (CNG), umożliwiając napływ jonów Na i Ca. Wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca aktywuje kanały Cl aktywowane przez wapń. Do rzęsek, poprzez pipetę patch, można wprowadzić cAMP w klatce (caged cAMP) lub Ca w klatce (caged Ca). Błysk światła UV powoduje fotolizę związku w klatce (Zmodyfikowano za zgodą Pifferi et al. 20062).
Rysunek 2. System rejestracji metodą patch-clamp i fotolizy błyskowej. Elementy układu obejmują wzmacniacz patch-clamp, komputer, dygityzator, mikroskop epifluorescencyjny, lampę błyskową ksenonową, kamerę CCD oraz monitor. Linie niebieska i fioletowa wskazują odpowiednio drogę światła widzialnego i UV.
Rycina 3. Ksenonowa lampa błyskowa. (A) Źródło światła wykorzystywane do fotolizy błyskowej związków klatkowych. (B) Moduł fotodiody służący do oceny intensywności błysku światła. (C) Światłowód z lampy błyskowej podłączono do wejścia fotodiody, a sygnał wyjściowy wizualizowano na oscyloskopie. Na przełączniku przedniego panelu lampy błyskowej wybrano jedną z trzech dostępnych wartości pojemności (C1, C2 lub C3), a napięcie zmieniano, obracając pokrętłem na panelu przednim. Napięcie wyjściowe fotodiody w odpowiedzi na różne intensywności błysku wykreślono w funkcji przyłożonego napięcia dla każdej wartości pojemności: C1 = 1000 μF, C2 = 2000 μF lub C3 = 3000 μF. Użyto światłowodu o średnicy 600 μm.
Rycina 4. Rejestracja metodą patch-clamp w odpowiedzi na fotolizę klatkowanego cAMP w roztworze o niskim stężeniu zewnątrzkomórkowego Ca.(A) Odpowiedź prądowa w konfiguracji whole-cell wywołana w izolowanym neuronie sensorycznym węchu poprzez fotolizę klatkowanego cAMP zlokalizowanego w rzęskach. Błysk UV został wyzwolony w czasie wskazanym przez strzałkę. Potencjał holdingowy wynosił -60 mV. (B) Fazę wzrostu prądu dobrze dopasowano do pojedynczej funkcji wykładniczej (linia przerywana) ze stałą czasową 3,4 ms.
Rycina 5. Odpowiedzi prądowe indukowane fotolizą klatkowanego cAMP w roztworach z niską zawartością Ca oraz w roztworach Ringera. (A) Olfaktoryczny neuron sensoryczny zanurzono w roztworze Ringera zawierającym 1 mM Ca lub w roztworze z niską zawartością Ca przy potencjale podtrzymującym -60 mV. Błysk UV emitowano w czasie wskazanym przez strzałkę. (B) Odpowiedzi prądowe przedstawione w powiększonej skali czasowej wykazały wielofazową fazę wzrostu w roztworze Ringera, podczas gdy faza wzrostu w odpowiedzi zarejestrowanej w roztworze z niską zawartością Ca była dobrze dopasowana do pojedynczej funkcji wykładniczej (linia przerywana) ze stałą czasową 3,5 ms. (C) Odpowiedzi prądowe z tego samego neuronu pokazanego na (A) zanurzonego w roztworze Ringera przy potencjale podtrzymującym -60 i +60 mV. (D) Odpowiedzi prądowe przedstawione w powiększonej skali czasowej wykazały wielofazową fazę wzrostu przy -60 mV, natomiast przy +60 mV faza wzrostu była dobrze dopasowana do pojedynczej funkcji wykładniczej ze stałą czasową 6,7 ms (linia przerywana).
Rysunek 6. Reakcje na fotolizę klatkowanego Ca. (A) Prądy całokomórkowe indukowane fotolizą klatkowanego Ca przy -50 mV. Błyski UV emitowano w czasie wskazanym przez strzałkę. Intensywność błysków była regulowana za pomocą filtrów neutralnych. (B) Powiększona skala czasu pokazuje szybki wzrost prądu po fotouwolnieniu Ca. Prądy dobrze pasowały do pojedynczej funkcji wykładniczej (linie przerywane), ze stałymi czasowymi wynoszącymi 5, 4,8, 3,8 ms. (Reprodukowano za zgodą Boccaccio & Menini, 200710).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Fotoliza błyskowa związków w klatkach (caged compounds) połączona z rejestracją metodą patch-clamp jest użyteczną techniką pozwalającą na uzyskanie szybkich i lokalnych skoków stężenia fizjologicznie czynnych cząsteczek zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórek. Zsyntetyzowano kilka rodzajów związków w klatkach1, a technikę tę można stosować w odniesieniu do różnych typów komórek, w tym do komórek hodowlanych wykazujących ekspresję kanałów jonowych, które mogą być aktywowane lub modulowane poprzez fotolizę niektórych z...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Moduł adaptera lampy błyskowej do mikroskopu | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Stół pneumatyczny | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitalizator | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Oprogramowanie do akwizycji danych | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Oprogramowanie do analizy danych | WaveMetrics | Igor | |
| Lustro do modułu adaptera | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Uchwyt elektrody | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’klatka S | Wykonany na zamówienie | ||
| Kostka filtracyjna | Olympus Corporation | U-MWU | Usunięto filtr wzbudzenia |
| Lampa błyskowa | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Pinceta Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Kapilary szklane | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| Szkiełko z dnem szklanym | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Oświetlacz | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| Mikroskop odwrócony | Olympus Corporation | IX70 | |
| Mikromanipulatory | Luigs & Neumann | SM I | |
| Wytwarzarka mikropipet | Narishige International | PP-830 | |
| Monitorowanie | HesaVision | MTB-01 | |
| Filtry neutralnej gęstości | Omega Optical | zróżnicowany | |
| Obiektyw 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Zeiss lub Olympus |
| Obiektyw 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Zeiss lub Olympus |
| Optyczny filtr UV krótkoprzepustowy | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Wzmacniacz patch-clamp | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Zespół fotodiody | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Kwarcowy światłowód | Rapp OptoElectronic | zmienia się | Używamy 600 μśrednica m |
| Drut srebrny | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| Srebrny pellet mielony | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Lampa ksenonowa łukowa | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| Odczynnik | Firma | Numer katalogowy | |
| cAMP w klatce BCMCM | BioLog | B016 | |
| Seryjowa albumina bydlęca (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| roztwór wzorcowy CaCl2 0,1 M | Fluka | 21059 | |
| Klatkowany Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| Cysteina | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| Konkanawalina A typu V (ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNaza I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Leupeptyna | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Papaina | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Poly-L-lizyna | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| pirogronian sodu | Sigma-Aldrich | P2256 |
Bibliografia
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
