Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

Podsumowanie

Opisano metodę zasiewania autologicznymi komórkami biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią oraz testowania ich biokompatybilności. Metoda ta wykorzystuje komórki progenitorowe śródbłonka oraz rurki tytanowe, zasiewane na kilka minut przed chirurgiczną implantacją do żył głównych świni. Technika ta może zostać dostosowana do wielu innych implantowalnych urządzeń biomedycznych.

Streszczenie

Implantowalne urządzenia naczyniowo-sercowe są produkowane z materiałów sztucznych (np. tytanu (Ti), rozszerzonego politetrafluoroetylenu), które niosą ryzyko powstawania zakrzepów zatorowych^1,2,3. Opracowaliśmy metodę wykładania wewnętrznej powierzchni rurek z Ti autologicznymi ludzkimi lub świńskimi komórkami progenitorowymi śródbłonka (EPCs) pochodzącymi z krwi⁴. Poprzez implantację rurek z Ti zawierających zlewne warstwy świńskich EPCs w żyłę główną dolną (IVC) świń, przetestowaliśmy poprawioną biokompatybilność powierzchni zasianej komórkami w prozakrzepowym środowisku dużego modelu zwierzęcego i porównaliśmy ją z niemodyfikowanymi powierzchniami gołego metalu^5,6,7 (Rysunek 1). Metoda ta może być wykorzystana do endotelializacji urządzeń w ciągu kilku minut od implantacji oraz do testowania ich funkcji przeciwzakrzepowej in vivo.

Krew obwodową pobrano od świń rasy Yorkshire o masie 50 kg, a jej frakcję komórek mononuklearnych hodowano w celu wyizolowania EPC^4,8. Rurki z Ti (średnica wewnętrzna 9,4 mm) przecięto wcześniej na trzy 4,5 cm odcinki wzdłużne i połączono ponownie za pomocą rurek termokurczliwych. Zbudowano urządzenie do zasiewania, które umożliwia powolną rotację rurek z Ti.

U świń wykonano laparotomię, a następnie wypreparowano jelita i pęcherz moczowy. Do odsłonięcia żyły głównej dolnej (IVC) od jej rozwidlenia powyżej prawej tętnicy nerkowej zastosowano ostrą i tępą dyssekcję. Rurki tytanowe (Ti) wypełniono zawiesiną autologicznych komórek EPC znakowanych fluorescencyjnie i obracano z prędkością 10 RPH przez 30 min, aby uzyskać jednorodną powłokę komórkową⁹. Po podaniu 100 USP/kg heparyny zaklemowano oba końce IVC oraz żyłę lędźwiową. Wykonano wenotomię o długości 4 cm, po czym wprowadzono urządzenie i wypełniono je solą fizjologiczną (PBS). Podczas zamykania wenotomii ciągłym szwem z nici Prolene 4-0, zdjęto jeden zacisk, aby odpowietrzyć IVC. Na koniec zabiegu powięź zszyto nicią 0-PDS (polidoksanon), przestrzeń podskórną zamknięto nicią 2-0 Vicryl, a skórę zamknięto zszywkami.

Po 3 – 21 dniach świnie zostały poddane eutanazji, a urządzenie wyeksplantowano w całości i utrwalono. Rurki z Ti zostały rozmontowane, a ich powierzchnie wewnętrzne obrazowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Stwierdzono, że rurki z gołego tytanu uległy całkowitemu zamknięciu, podczas gdy rurki zasiane komórkami EPC pozostały drożne. Ponadto udało się wykazać obecność konfluencyjnej warstwy EPC na wewnętrznej powierzchni stykającej się z krwią.

Podsumowując, nasza technologia może być wykorzystana do endotelializacji rurek z Ti w ciągu kilku minut od implantacji przy użyciu autologicznych EPC w celu zapobiegania zakrzepicy urządzenia. Nasza metoda chirurgiczna umożliwia testowanie poprawionej biokompatybilności tak zmodyfikowanych urządzeń przy minimalnej utracie krwi i minimalnym naruszeniu powierzchni zasianej komórkami EPC.

Protokół

1. Izolacja komórek progenitorowych śródbłonka

1. Na trzydzieści dni przed implantacją rurek zasianych komórkami EPC należy przygotować strzykawkę 60 ml z 15 ml roztworu cytrynianu dekstrozy przeciwkrzepliwej i zabezpieczyć ją trójdrożnym kranikiem do izolacji EPC z obwodowej krwi świni. Na 24 godziny przed pobraniem krwi dwie płytki 12-dołkowe należy pokryć kolagenem szczurzym typu 1 (50 μg/ ml, rozpuszczonym w 0,02 N roztworze kwasu octowego)⁴.
2. Wszelkie czynności związane z opieką nad zwierzętami i eksperymentami należy przeprowadzać zgodnie z wytycznymi National Institute of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz wyłącznie po uzyskaniu zatwierdzenia przez nadzorujący Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt.
3. Samicę świni rasy Yorkshire (45 kg) należy uspokoić za pomocą acepromazyny (1,1 mg/ kg) i ketaminy (22 mg/ kg) podanych domięśniowo za pomocą igły motylkowej 19 G.
4. Świnię należy intubować rurką endotrachealną (długość 30 cm, średnica wewnętrzna 8 mm) i zanieścić izofluranem (4,5 % objętości oddechowej przez maskę).
5. Podczas procedury należy monitorować świnię, mierząc saturację tlenem, tętno i temperaturę. Termoregulację należy utrzymać, korzystając z automatycznego podgrzewanego stołu operacyjnego i koca grzewczego oraz podgrzewając wlewy.
6. Świnię należy ułożyć na stole operacyjnym w pozycji na plecach, unieruchomić kończyny tylne boczno-ogonowo i oczyścić chloreksydyną, a następnie przeprowadzić sterylizację preparatem DuraPrep. Następnie należy założyć sterylne pole na obszar miednicy.
7. Igłę 21 G x 7 cm z zestawu mikrointroducera 5 F należy wprowadzić do żyły udowej nieco przyśrodkowo od wyczuwalnego tętna udowego (przyśrodkowo od mięśnia obszernego przyśrodkowego i bocznie od mięśnia smukłego), a następnie przeprowadzić kaniulację żyły techniką Seldingera. Przygotowaną strzykawkę 60 ml należy podłączyć do cewnika wewnątrznaczyniowego i pobrać 45 ml krwi.
8. Miejsce nakłucia naczynia należy uciskać do uzyskania hemostazy (5 min), następnie przerwać znieczulenie i pozwolić świni na wybudzenie. Zwierzę jest monitorowane do pełnego powrotu do sprawności i następnie wraca do klatki.
9. Roztwór krwi należy rozcieńczyć w stosunku 1:1 roztworem soli buforowej Hanksa (bez CaCl₂, MgCl₂, MgSO₄) i nałożyć na równe objętości Histopaque w celu utworzenia wyraźnych warstw. Odwirujemy (30 min, 740 g, niskie ustawienie hamowania) i zebrać warstwę komórek mononuklearnych (MNC). Komórki MNC należy resuspenderować i przemyć 3 razy fosforanowym buforem solnym Dulbecco (DPBS) (10 min, 515 g) przed wysianiem na dwie płytki 12-dołkowe w pełnej pożywce wzrostowej (pożywka EBM-2 z 2 % surowicy świńskiej (PS) i EGM-2 SingleQuots) w temperaturze 37°C, przy 5 % CO₂.
10. Pożywkę należy wymieniać powoli co 24 godziny przez pierwsze 7 dni, a następnie co drugi dzień. Kolonie EPC należy zidentyfikować po średnim czasie
    7 dni (Rysunek 2).
11. Komórki EPC należy namnażać w hodowli, gdy pokryją ¼ powierzchni dołków 12-dołkowych. Tożsamość EPC należy potwierdzić za pomocą cytometrii przepływowej, badając obecność markerów powierzchniowych CD31 oraz brak CD14 i CD45. Inne analizy, które można przeprowadzić, obejmują morfologię komórek oraz aktywność tlenku azotu III po wystawieniu na przepływ⁴.

2. Montaż rurki tytanowej

1. Przeciąć rurkę z Ti wzdłuż na 3 równe części pod kątem 120 stopni (długość 4,5 cm), używając tarczy do nacinania HHS z 72 zębami, zamocowanej na trzpieniu piły w frezarce pionowej. Pracować z prędkością 300 RPM, cały czas utrzymując obszar cięcia nasyconym płynem chłodniczym Tap Magic Cutting Fluid (Rysunek 3).
2. Wypolerować powierzchnię wewnętrzną za pomocą szlifierki stołowej i metalowej tarczy Scotch-Brite. Następnie wypolerować ręcznie papierem ściernym 3M, aby dodatkowo wygładzić i wyrównać powierzchnię oraz usunąć wszelkie widoczne wżery.
3. Oczyścić fragmenty Ti roztworem mydła Alconox, a następnie zanurzyć na 5 min w wodzie królewskiej (1:3 stężonego kwasu azotowego do stężonego kwasu solnego), po czym wypłukać kilkoma litrami wody¹⁰. Należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ woda królewska jest silnie żrąca i potencjalnie wybuchowa!
4. Poddać fragmenty Ti sonikacji przez 16 min w roztworze mydła Alconox, wypłukać 30 razy w wodzie dejonizowanej, a następnie ponownie poddać sonikacji przez 16 min w wodzie dejonizowanej. Pozostawić do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
5. Uciąć termokurczliwą rurkę PVC na długość 4,5 cm i dokładnie oczyścić zgodnie z punktem 2.4.
6. Za pomocą pęsety umieścić 3 oczyszczone fragmenty Ti na wspierającym trzpieniu (wykonanym z aluminium, średnica zewnętrzna 8,5 mm) i nałożyć rurkę termokurczliwą z PVC wokół fragmentów Ti (Rysunek 4). Kurczyć rurkę za pomocą opalarki, obracając trzpień, aby równomiernie i ciasno spiąć fragmenty Ti.

3. Montaż urządzenia do wysiewu i jego komponentów

1. Odciąć rurki silikonowe o długości 2,5 cm i 3,5 cm.
2. Przeciąć plastikową strzykawkę 5 cc na oznaczeniu 0,8 ml i zachować „część głowicy” z końcówką luer.
3. Dokładnie oczyścić 2 odcinki silikonowe, „część głowicy” strzykawki oraz nasadkę luera za pomocą sonikacji, zgodnie z opisem w punkcie 2.4.
4. Do każdego końca złożonej rurki Ti z punktu 2.5 dołączyć rurkę silikonową, tak aby wystawała o 5 mm poza rurkę PVC.
5. Wsunąć odcięty koniec „części głowicy” strzykawki do krótkiej rurki silikonowej, tak aby przylegała ona do rurki Ti (Rysunek 5).
6. Zamknięte rurki Ti wraz z jedną nasadką luer włożyć do woreczka Tyvek i poddać sterylizacji gazowej tlenkiem etylenu (18 godzin w 55°C).
7. Zamontować synchroniczny silnik czasowy (10 RPH) na platformie z pleksiglasu i połączyć jego oś z uchwytem strzykawki (wykonanym z aluminium, dopasowanym do strzykawki 5 cc) (Rysunek 6).

4. Wysiew EPC na wewnętrzną powierzchnię rurki z Ti

1. Namnożyć EPC wyizolowane zgodnie z punktem 1. do poziomu 3 konfluencyjnych kolb T-75 (lub co najmniej 9 x 10⁶ komórek).
2. W dniu zabiegu znakować komórki fluorescencyjnie przy użyciu barwnika długoterminowego (PKH26)¹¹. Rozpocząć od dwukrotnego przepłukania hodowlanych EPC medium bez surowicy. Należy zachować ostrożność i ograniczyć ekspozycję na światło, aby chronić komórki podczas i po znakowaniu.
3. Przykryć komórki 4 μM PKH26 w rozcieńczalniku C (roztwór barwnika) w temperaturze pokojowej przez 4 minuty.
4. Przerwać reakcję znakowania, dodając surowicę wieprzową w objętości równej objętości roztworu barwnika. Po jednej minucie rozcieńczyć połączony roztwór w stosunku 1:1 pełnym medium wzrostowym.
5. Odssać ciecz i przepłukać komórki 3 razy pełnym medium wzrostowym.
6. Przemyć EPC dwukrotnie w DPBS (bez CaCl₂, MgCl₂).
7. Przykryć komórki trypsyną i inkubować w 37°C przez 3 minuty, a następnie potwierdzić odklejenie pod mikroskopem świetlnym. Dodać roztwór neutralizujący trypsynę w objętości dwukrotnej względem użytej trypsyny.
8. Połączyć roztwory komórkowe w jednej probówce i wymieszać poprzez pipetowanie. Nanieść 10 μl roztworu komórek na każdą stronę hemocytometru w celu przeliczenia.
9. Odwirować roztwór komórek (1500 RPH, 5 min.). Przeliczyć komórki i resuspender osad w stężeniu 2 - 2.5 x 10⁶ EPC/ ml w medium bez surowicy. Należy pamiętać, że minimalna objętość niezbędna do wypełnienia zestawu probówki wynosi 4,5 ml.
10. Rozłożyć sterylny ręcznik w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu stworzenia pola sterylnego. Wyłożyć na pole sterylne zesterylizowaną gazowo probówkę z Ti oraz dodatkową strzykawkę 5 cc.
11. W sterylnych rękawiczkach wyjąć tłok ze strzykawki 5 cc i pozostawić go na polu do późniejszego użycia. Do strzykawki przymocować zatyczkę Luer.
12. Napipetować 4,5 - 5 ml zawiesiny EPC z punktu 4.9 do otwartego cylindra strzykawki. Bezpiecznie włożyć tłok z powrotem do otwartego końca strzykawki.
13. Trzymać strzykawkę z zatyczką skierowaną do góry i zdjąć zatyczkę. Wsunąć strzykawkę końcem Luer do otwartej rurki silikonowej zestawu probówki Ti, aż zostanie ciasno osadzona; nie przesuwać jej dalej wewnątrz probówki Ti.
14. Powoli przesuwać tłok strzykawki, aż roztwór komórek dotrze do górnej krawędzi odciętej „części głowicy” strzykawki, usuwając pęcherzyki powietrza z układu. Zamknąć zatyczką Luer i włożyć cały zestaw do sterylnej osłony, uszczelniając otwarty koniec taśmą.
15. Włożyć cały ten zestaw do obrabianego uchwytu strzykawki z punktu 3.7. Umieścić w inkubatorze w 37°C i wyregulować platformę tak, aby część probówki Ti komory zasiewczej była wypoziomowana, używając poziomicy (Rysunek 6).
16. Pozostawić zestaw probówki Ti w rotacji przez 30 minut przed implantacją.

5. Implantacja rurki z Ti do dolnej żyły głównej świni

1. Na dwadzieścia cztery godziny przed operacją podać świni (z której izolowano EPC) lek przeciwbólowy w postaci plastra z fentanylem (100 μg/ hr przezskórnie; plaster pozostawić przez 72 godziny).
2. Świnia powinna pozostawać na czczo (NPO) przez noc; w dniu operacji przed zabiegiem oraz przez kolejne 7 dni co 24 godziny podawać Baytril (enrofloksacyna) (5 mg/ kg, IM) jako profilaktykę antybiotykową.
3. Przeprowadzić sedację, intubację i znieczulić świnię zgodnie z opisem w punkcie 1.3 (objętość oddechowa 10 -15 ml/ kg) i unieruchomić zwierzę w pozycji na plecach na stole operacyjnym. Podczas zabiegu monitorować saturację tlenem, częstotliwość akcji serca oraz temperaturę. Termoregulację zapewnić za pomocą automatycznego podgrzewanego stołu operacyjnego, koca grzewczego oraz poprzez ogrzewanie wlewanych płynów.
4. Wprowadzić cewnik dożylny 18 G do żyły ucha świni i zabezpieczyć oczy zwierzęcia kroplami Vetropolycin.
5. Oczyścić, przygotować i obłożyć sterylnymi materiałami brzuch świni zgodnie z opisem w punkcie 1.6. Wykonać cięcie w linii środkowej skalpelem nr 15 od drugiego zestawu gruczołów mlecznych w kierunku kranialnym do przedostatniego zestawu w kierunku kaudalnym.
6. Przeprowadzić dyssekcję aż do powięzi brzusznej przy użyciu elektrokoagulacji.
7. Unieść otrzewną kleszczykami Mosquito i ostrożnie otworzyć ją nożyczkami Metzenbauma.
8. Wyewnuć pęcherz moczowy i nałożyć szew sakulacyjny (purse-string) nitką 3-O Vicryl na ścianie pęcherza. Wykonać nacięcie w jego środkowej części i wprowadzić cewnik Foleya 16 F. Podawać płyny dożylne (roztwór Ringera z mleczanem), aby utrzymać diurezę na poziomie >/= 1 ml/ kg/ hr podczas operacji.
9. Następnie wyewnuć jelito cienkie i grube, a następnie umieścić dwa rozwieracze chirurgiczne Balfoura, aby odsłonić tylną część jamy otrzewnej i zidentyfikować żyłę główną dolną (IVC).
10. Za pomocą dyssekcji ostrej i tępej ostrożnie uwolnić IVC z otaczających tkanek i wypreparować naczynie od prawej tętnicy nerkowej proksymalnie do miejsca rozwidlenia IVC dystalnie. Zachować szczególną ostrożność podczas dyssekcji IVC, ponieważ nawet niewielki defekt w IVC może doprowadzić do szybkiego krwotoku i wykrwawienia zwierzęcia.
11. Przeszyć wszystkie odgałęzienia segmentu IVC, aby zapobiec krwawieniu wokół implantowanej rurki Ti. Należy zwrócić uwagę na zazwyczaj duże dwie tylne żyły lędźwiowe, które wymagają bardzo ostrożnej dyssekcji i podwiązania. Ponadto, bezpośrednio proksymalnie od rozwidlenia IVC po stronie tylno-przyśrodkowej często spotyka się dużą żyłę lędźwiową, którą należy uwolnić i zabezpieczyć pętlami naczyniowymi w przygotowaniu do założenia zacisków.
12. Przystąpić do zasiedlania rurki Ti równolegle, zgodnie z opisem w punkcie 4.
13. Bezpośrednio przed założeniem zacisków na IVC podać 100 USP/ kg heparyny. Założyć chirurgiczne zaciski pod kątem 45 stopni dystalnie na IVC i żyłę lędźwiową, a następnie proksymalnie.
14. Wyonać podłużną wenotomię (4 cm) między zaciskami proksymalnym i dystalnym za pomocą skalpela nr 11, a następnie rozszerzyć otwór nożyczkami Pottsa.
15. Usunąć krew z IVC i przepłukać jej światło sterylnym DPBS.
16. Wprowadzić zasiedloną komórkami EPC rurkę Ti (lub metalową rurkę kontrolną) do IVC i wypełnić ją DPBS (z CaCl₂, MgCl₂), aby zapobiec wysychaniu komórek i usunąć powietrze.
17. Zamknąć wenotomię szwem ciągłym 4-0 Prolene i zdjąć jeden zacisk proksymalny, aby usunąć powietrze z IVC poprzez niewielkie cofnięcie krwi. Założyć szew stabilizujący („stay-suture”) przez ścianę żyły do rurki PVC, aby zapobiec przemieszczaniu się implantu w czasie.
18. Zamknąć powięź szwem O-PDS na igle CT, a przestrzeń podskórną szwem ciągłym 2-O Vicryl. Zamknąć skórę za pomocą zszywek.
19. Podać podskórnie do 20 ml 0,25% Marcainy (bupiwakaina) wzdłuż miejsca nacięcia i pokryć ranę gazą oraz opatrunkiem Tegaderm. W razie potrzeby podawać podskórnie Flunixin (2,2 mg/ kg co 24 h) i oksymorfon (0,15 mg/ kg co 3 - 4 h) w celu uśmierzenia bólu.
20. Przerwać znieczulenie, monitorować świnię aż do wybudzenia i przenieść do klatki. Monitorować zwierzę dwa razy dziennie pod kątem oznak stresu/bólu, zdolności do stania i chodzenia, wydalania stolca i moczu oraz koloru skóry świadczącego o prawidłowym ukrwieniu.

6. Eksplantacja rurki z Ti

1. Po 3 tygodniach przeprowadzić sedację, intubację i znieczulenie świni zgodnie z opisem w punktach 1.3 - 1.4.
2. Wykonać laparotomię zgodnie z opisem w punktach 5.5 - 5.8.
3. Należy zwrócić uwagę, że bliznowacenie może maskować miejsce implantacji, jednak sztywną rurkę Ti można wyczuć palpacyjnie in situ.
4. Wypreparować IVC zgodnie z opisem w punktach 5.9 - 5.11, a następnie usunąć rurkę Ti en-block wraz z otaczającym ją IVC przy użyciu ciężkich nożyczek.
5. Uśmiercić zwierzę za pomocą roztworu do eutanazji Euthasol (390 mg/ml pentobarbale sodu i 50 mg/ml fenytoiny sodu w dawce 1 ml/ 10 lbs).

7. Fixacja i obrazowanie wewnętrznej powierzchni Ti

1. Wypłucz wycięty segment żyły z rurką Ti w roztworze DPBS, a następnie sfotografuj jego światło (drożne lub zamknięte) za pomocą cyfrowego aparatu o wysokiej rozdzielczości (Rycina 7).
2. Następnie utrwal preparat poprzez zanurzenie w 3,7 % paraformaldehydzie na minimum 15 minut. Wypłucz preparat w roztworze DPBS.
3. Bardzo ostrożnie nacinaj otaczającą żyłę oraz rurkę PVC, aby odsłonić rurkę Ti. Umieść 3 sekcje pod mikroskopem fluorescencyjnym powierzchniami wewnętrznymi skierowanymi w stronę obiektywu/źródła światła i wykonaj obrazowanie przy długości fali wzbudzenia 550 nm, aby zwizualizować znakowane PKH26 EPC w kolorze czerwonym/pomarańczowym (Rycina 8A). W razie potrzeby komórki można dodatkowo barwić (np. barwienie markerem adhezji komórek śródbłonka i płytek krwi (PECAM), aby zwizualizować granice komórek (Rycina 8B), barwienie DAPI w celu wizualizacji jąder itp.).

8. Reprezentatywne wyniki:

Po wykonaniu niniejszego protokołu lekarze i naukowcy są w stanie przeprowadzić endotelizację stałych struktur rurkowych przy użyciu autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka pochodzących z krwi w modelu dużych zwierząt. Rysunek 2 pokazuje, że EPC wyizolowane naszą metodą pojawiają się jako kolonie o morfologii brukowanej po około 7 dniach hodowli. Nasze urządzenie do wysiewu przedstawione na Rysunkach 5 i 6 umożliwia powolną rotację rurek z Ti wypełnionych zawiesiną EPC, co skutkuje równomiernym pokryciem wewnętrznej powierzchni rurki w warunkach sterylnych⁹.

Nasza procedura chirurgicznej implantacji umożliwia badanie skłonności biomateriałów, takich jak Ti, do wywoływania zakrzepicy w modelu dużych zwierząt. Stwierdziliśmy, że świnie dobrze tolerują ten zabieg, a implantacja ta może zostać przeprowadzona przy minimalnej utracie krwi i bez uszkodzenia warstwy EPC.

Rysunek 7 pokazuje, że niepowlekana rurka z Ti ulega całkowitemu zatkaniu, podczas gdy nasza rurka wyścielona EPC pozostaje drożna nawet w prozakrzepowym środowisku o niskim ścinaniu w żyle głównej dolnej. Co więcej, obecność ciągłej warstwy komórek znakowanych fluorescencyjnie potwierdza skuteczność tej metody, co przedstawiono na Rysunku 8.

Rycina 1. Schemat eksperymentu dotyczącego zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka (EPC). Najpierw pobiera się krew obwodową od świni. Następnie z krwi izoluje się EPC i namnaża je w hodowli. EPC są następnie wykorzystywane do wyścielenia urządzenia w postaci tytanowej (Ti) rurki, która następnie zostaje chirurgicznie wszczepiona do żyły głównej dolnej tej samej świni, z której wyizolowano komórki.

Rycina 2. Reprezentatywna kolonia EPC w kulturze, około 7 dni po procedurze izolacji (obrazowanie wykonano za pomocą odwróconego mikroskopu Leica DMIL z kamerą obrazującą i oprogramowaniem QCapture).

Rysunek 3. Przekroje rurek Ti przed montażem. Rurki Ti są cięte wzdłużnie na 3 równe sekcje, a następnie przycinane do długości 4,5 cm. Wewnętrzne powierzchnie sekcji Ti są polerowane za pomocą szlifierki stołowej i papieru ściernego w celu usunięcia widocznych wżerów.

Rysunek 4. Montaż sekcji rur z Ti za pomocą termokurczliwych rurek z PVC (niebieskie) i opalarki. Sekcje Ti są podparte na obrobionym aluminiowym trzpieniu, który przechodzi przez sekcje Ti i odpowiada wymiarom średnicy wewnętrznej rury z Ti.

Rysunek 5. Zestaw z rurką tytanową, przedstawiający wszystkie elementy: nasadkę luer, „element głowicy” strzykawki, rurkę silikonową oraz rurkę Ti z owijką PVC (niebieska). Zestaw jest montowany przed sterylizacją do użytku chirurgicznego.

Rycina 6. Układ do zasiewania rurki z Ti wewnątrz inkubatora, przedstawiający silnik, platformę, obrobiony aluminiowy uchwyt strzykawki, zespół rurki z Ti oraz strzykawkę 5 cc. Uwaga: Zespół przedstawiono bez ochronnej sterylnej osłony w celu lepszej wizualizacji.

Rycina 7. Reprezentatywne wyniki makroskopowe operacji implantacji. (A) Widok czołowy kontrolnej, niepowlekanej rurki Ti po implantacji w dolnej żyle głównej (IVC) świni. Światło rurki jest całkowicie zamknięte przez stały skrzep. (B) Widok czołowy rurki Ti obsianej komórkami EPC po implantacji. Światło rurki jest całkowicie drożne i czyste. (C) Widok po sekcji kontrolnej (niepowlekanej) rurki Ti po 3 dniach implantacji, pokazujący zakres zakrzepicy (eksperymenty prowadzono do 3 tygodni, uzyskując identyczne wyniki).

Rycina 8. Komórki EPC na powierzchni rurki z Ti po 3 dniach od implantacji (obrazowanie wykonane za pomocą prostego mikroskopu Leica DMRB z monochromatyczną kamerą cyfrową QImaging QICAM i oprogramowaniem Image Pro Plus). (A) Konfluencyjne komórki na powierzchni wykazujące znakowanie PKH26 przed operacją. (B) Konfluencyjna warstwa komórek EPC. Czerwony: znakowanie PKH26 przed operacją. Zielony: barwienie PECAM w komórkach EPC.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda zasiewania komórek w rurkach z Ti umożliwia lekarzom i naukowcom szybką i jednorodną endotelializację powierzchni urządzeń implantowalnych mających kontakt z krwią. Ponieważ izolujemy i namnażamy EPC z próbek krwi obwodowej, pozyskanie tych komórek nie wymaga przeprowadzenia żadnego poważnego zabiegu inwazyjnego. Co więcej, EPC są autologiczne, dzięki czemu eliminuje się ryzyko wystąpienia reakcji immunologicznej na implant z zasianymi komórkami. Zasady zaprezentowane w tym protokole mogą być wykorzystane nie tylko w przypadku rurek z Ti, ale także dla wielu innych biomateriałów stosowanych w medycynie naczyniowej i kardiologii.

Kluczowymi etapami niniejszego protokołu są drobiazgowe czyszczenie rurek Ti, ponieważ stwierdzono, że każda przylegająca warstwa zanieczyszczeń upośledza adhezję komórek. Ponadto podczas procesu wysiewania niezbędna jest niska prędkość obrotu (odwrotnie proporcjonalna do średnicy rurki), aby EPC mogły powoli osiadać i przylegać do powierzchni podczas ruchu rurki Ti.

Nasza metoda wysiewania bezpośrednio przed implantacją pozwala uniknąć niepraktycznego czasu hodowli ex vivo; komórki przylegają indywidualnie, a następnie tworzą zwartą warstwę in vivo, co eliminuje ryzyko embolizacji w postaci płata bezpośrednio po przywróceniu przepływu. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że po osiągnięciu przez EPCs stanu konfluencji tworzą one macierz zewnątrzkomórkową, do której trwale przylegają, co dodatkowo minimalizuje możliwość złuszczenia warstwy śródbłonka. Choć nie można całkowicie wykluczyć możliwości odrywania się zatorów, ryzyko to wydaje się być wielokrotnie niższe niż ryzyko zakrzepicy całej powierzchni urządzenia, której zapobieganie jest celem tej terapii.

Nasze podejście polegające na implantacji do środowiska o niskim ścinaniu i prozakrzepowym w obrębie żyły głównej dolnej wykorzystuje jeden z najbardziej sprawdzonych modeli dużych zwierząt do badania kompatybilności krwi oraz zakrzepicy urządzeń^5,6. Należy zaznaczyć, że wszelka opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institute of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i wyłącznie po zatwierdzeniu przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Duke.

Aby skutecznie wykorzystać tę metodę implantacji do testowania biomateriałów i urządzeń, ważne jest cierpliwe oczyszczenie z tkanek segmentu IVC oraz podwiązanie wszystkich odgałęzień żylnych w przygotowaniu do wprowadzenia urządzenia, tak aby krwawienie wokół urządzenia nie pochodziło z tzw. „fałszywego światła”. Kolejnym krytycznym krokiem jest dodanie DPBS do światła urządzenia, tak aby komórki na wewnętrznej powierzchni rurki pozostały wilgotne podczas zamykania wenotomii i przed rozpoczęciem reperfuzji. Jeśli urządzenie nie zostanie odnalezione w miejscu implantacji, mogło ono przemieścić się „w górę” IVC. Można temu zapobiec, przeprowadzając szew (4-O Prolene) przez ścianę żyły oraz przez odcinek rurki PVC o długości 2 – 3 mm, tak aby rurka była mocno zakotwiczona w obecnym położeniu. W przypadku gdy badacz ma trudności z odnalezieniem uprzednio znakowanych fluorescencyjnie komórek pokazanych na Rysunku 8 po eksplantacji z w innym stopniu drożnej rurki, prawdopodobne jest, że komórki oddzieliły się w postaci spójnej warstwy. Można temu zapobiec poprzez bardzo delikatną dyssekcję otaczającej żyły i demontaż 3 sekcji rurki z Ti, po uprzednim utrwaleniu żyły wraz z rurką.

Nasza technologia stanowi dowód koncepcji zapobiegania zakrzepicy urządzeń sercowo-naczyniowych poprzez zasiew EPC. Technologia ta może zostać wykorzystana w opracowywaniu implantów „biogennych” wyściełanych własnymi endotelialnymi komórkami progenitorowymi pacjentów. Badanie wykonalności w naszym modelu zwierzęcym na świniach stanowi pierwsze kroki w kierunku przeniesienia tej „medycyny personalizowanej” do praktyki klinicznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acepromazyna	Boehringer Ingeheim	BIC670025	NAC# 10280002
Precyzyjny środek czyszczący Alconox Powered Precision Cleaner	Alconox, Inc.	1104
Retraktor chirurgiczny Balfoura	Adler	N/A
Baytril	Bayer AG	APVMA 46028/0705
Igła motylkowa (19G)	Terumo Medical Corp.	SV19CLK
Chlorheksydyna	3M	9200
Kleszczyki (45 stopni)	Aesculap	FC339T
DPBS (-/-)	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
DPBS (+/+)	GIBCO, by Life Technologies	14040-133
DuraPrep	3M	8635
Pożywka EBM-2	Lonza Inc.	CC-3156	Baza dla pożywki bezsurowiczej oraz pełnej pożywki wzrostowej
EGM-2 SingleQuots	Lonza Inc.	CC-3162	Stosowane z EBM-2 dla pożywki bezsurowiczej oraz pełnej pożywki wzrostowej
Narzędzie do elektrokoagulacji	Valleylab	SurgII-20
Papier ścierny	3M	60-0700-0425-8	ziarnistość 240
Roztwór do eutanazji Euthasol	Virbac Animal Health		ANADA #: 200-071
Plaster z fentanylem	Actavis		NDC # 67767-120-18
Fluniksyn	Merck & Co.		NAC #: 10470183
Cewnik Foleya (16F)	Bard	730116
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
Opalarka	Milwaukee	8988-20
Heparyna			NDC #: 25021
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	H8889-500ML
Rurka intubacyjna	Mallinckrodt Baker Inc.	86113
Izofluran	MWI Veterinary Supply		NDC #13985-030
Kaniula dożylna (18G)	BD Biosciences	381547
Ketamina	Fort Dodge Animal Health		NDC #0856-2013
Poziomnica	Swanson	LLA001
Zaślepka do końcówki Luer-Lock	CML Supply	909-001
Marcaine	Hospira Inc.		NDC #: 0409-1560-10
Nożyczki Metzenbauma	Adler	N/A
Mikrowprowadza (5F)	Galt	KIT 002-01
Kleszczyki typu mosquito	Adler	N/A
Silnik	Herbach and Rademan	H1-08
Oksymorfon	Endo Labs		NDC: 63481-624-10
Zestaw barwnika PKH26	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT
Surowica wieprzowa	Gemini Bio Products	100-115	stężenie 2% w pełnej pożywce wzrostowej
Nożyczki Pottsa	Adler	N/A
Zszywacz skórny Precise Vista	3M	3998
Rurka PVC	McMaster-Carr	7132K117	rozszerzona średnica wewnętrzna 15,88 mm, odzyskana średnica wewnętrzna 7,95 mm
Kleszczyki kątowe, rozmiar średni	Adler	N/A
Ostrze skalpela (#10-15)	Bard	373910
Rurka silikonowa	McMaster-Carr	51735K26	średnica zewnętrzna 16,64 mm, średnica wewnętrzna 9,52 mm
Strzykawka (5 cc)	BD Biosciences	309603
Tegaderm	3M	90001
Kurek trójdrożny	Kendall	170060
Rurka tytanowa (Ti Tube)	Tico Titanium	N/A	Określona jako ½" średnicy zewnętrznej, ścianka .065", średnica wewnętrzna .370", .1737 lbs/ft
Trypsyna	Lonza Inc.	CC-5012
Roztwór neutralizujący trypsynę (TNS)	Lonza Inc.	CC-5002	0,03%
Vetropolycin	Pharmaderm Animal Health		NAC #: 12920110
Szew Vicryl (3-0)	Ethicon Inc.	J808T
Myjka ultradźwiękowa w kąpieli wodnej	Branson	B200