Opisano metodę zasiewania autologicznymi komórkami biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią oraz testowania ich biokompatybilności. Metoda ta wykorzystuje komórki progenitorowe śródbłonka oraz rurki tytanowe, zasiewane na kilka minut przed chirurgiczną implantacją do żył głównych świni. Technika ta może zostać dostosowana do wielu innych implantowalnych urządzeń biomedycznych.
Artykuł metodologiczny
Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Implantowalne urządzenia naczyniowo-sercowe są produkowane z materiałów sztucznych (np. tytanu (Ti), rozszerzonego politetrafluoroetylenu), które niosą ryzyko powstawania zakrzepów zatorowych1,2,3. Opracowaliśmy metodę wykładania wewnętrznej powierzchni rurek z Ti autologicznymi ludzkimi lub świńskimi komórkami progenitorowymi śródbłonka (EPCs) pochodzącymi z krwi4. Poprzez implantację rurek z Ti zawierających zlewne warstwy świńskich EPCs w żyłę główną dolną (IVC) świń, przetestowaliśmy poprawioną biokompatybilność powierzchni zasianej komórkami w prozakrzepowym środowisku dużego modelu zwierzęcego i porównaliśmy ją z niemodyfikowanymi powierzchniami gołego metalu5,6,7 (Rysunek 1). Metoda ta może być wykorzystana do endotelializacji urządzeń w ciągu kilku minut od implantacji oraz do testowania ich funkcji przeciwzakrzepowej in vivo.
Krew obwodową pobrano od świń rasy Yorkshire o masie 50 kg, a jej frakcję komórek mononuklearnych hodowano w celu wyizolowania EPC4,8. Rurki z Ti (średnica wewnętrzna 9,4 mm) przecięto wcześniej na trzy 4,5 cm odcinki wzdłużne i połączono ponownie za pomocą rurek termokurczliwych. Zbudowano urządzenie do zasiewania, które umożliwia powolną rotację rurek z Ti.
U świń wykonano laparotomię, a następnie wypreparowano jelita i pęcherz moczowy. Do odsłonięcia żyły głównej dolnej (IVC) od jej rozwidlenia powyżej prawej tętnicy nerkowej zastosowano ostrą i tępą dyssekcję. Rurki tytanowe (Ti) wypełniono zawiesiną autologicznych komórek EPC znakowanych fluorescencyjnie i obracano z prędkością 10 RPH przez 30 min, aby uzyskać jednorodną powłokę komórkową9. Po podaniu 100 USP/kg heparyny zaklemowano oba końce IVC oraz żyłę lędźwiową. Wykonano wenotomię o długości 4 cm, po czym wprowadzono urządzenie i wypełniono je solą fizjologiczną (PBS). Podczas zamykania wenotomii ciągłym szwem z nici Prolene 4-0, zdjęto jeden zacisk, aby odpowietrzyć IVC. Na koniec zabiegu powięź zszyto nicią 0-PDS (polidoksanon), przestrzeń podskórną zamknięto nicią 2-0 Vicryl, a skórę zamknięto zszywkami.
Po 3 – 21 dniach świnie zostały poddane eutanazji, a urządzenie wyeksplantowano w całości i utrwalono. Rurki z Ti zostały rozmontowane, a ich powierzchnie wewnętrzne obrazowano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Stwierdzono, że rurki z gołego tytanu uległy całkowitemu zamknięciu, podczas gdy rurki zasiane komórkami EPC pozostały drożne. Ponadto udało się wykazać obecność konfluencyjnej warstwy EPC na wewnętrznej powierzchni stykającej się z krwią.
Podsumowując, nasza technologia może być wykorzystana do endotelializacji rurek z Ti w ciągu kilku minut od implantacji przy użyciu autologicznych EPC w celu zapobiegania zakrzepicy urządzenia. Nasza metoda chirurgiczna umożliwia testowanie poprawionej biokompatybilności tak zmodyfikowanych urządzeń przy minimalnej utracie krwi i minimalnym naruszeniu powierzchni zasianej komórkami EPC.
Protokół
1. Izolacja komórek progenitorowych śródbłonka
- Na trzydzieści dni przed implantacją rurki zasianej komórkami EPC należy przygotować strzykawkę o pojemności 60 ml z 15 ml roztworu cytrynianu dekstrozy przeciwzakrzepowej i zabezpieczyć ją trójdrożnym kurkiem w celu izolacji EPC z obwodowej krwi świni. Na 24 godziny przed pobraniem krwi należy pokryć dwie płytki 12-dołkowe kolagenem szczurzym typu 1 (50 μg/ ml, rozpuszczone w 0,02 N roztworze kwasu octowego)4.
- Wszelkie działania związane z opieką nad zwierzętami oraz eksperymenty należy przeprowadzać zgodnie z wytycznymi National Institute of Health dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystania, wyłącznie po uzyskaniu zgody nadzorującej Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Wykorzystania (Institutional Animal Care and Use Committee).
- Przeprowadzić sedację samicy świni rasy Yorkshire (45 kg) za pomocą acepromazyny (1,1 mg/kg) oraz ketaminy (22 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie domięśniowe przy użyciu igły motylkowej 19 G.
- Wprowadzić rurkę endotrachealną (długość 30 cm, średnica wewnętrzna 8 mm) do tchawicy świni i przeprowadzić znieczulenie izofluranem (4,5% objętości oddechowej podawanym przez maskę).
- Monitoruj świnię podczas procedury, mierząc saturację tlenem, częstotliwość akcji serca oraz temperaturę. Utrzymuj termoregulację, korzystając z automatycznego podgrzewanego stołu operacyjnego i koca grzewczego oraz poprzez podgrzewanie wlewanych płynów.
- Umieść świnię w pozycji brzusznej na stole operacyjnym, unieruchom kończyny tylne bocznie i w kierunku ogona, a następnie oczyść skórę roztworem Chlorhexidine, po czym przeprowadź sterylizację preparatem DuraPrep. Następnie przystąp do obłożenia pola operacyjnego w obszarze miednicy.
- Wprowadź igłę 21 G x 7 cm z zestawu mikrowprowadzaków 5 F tuż przyśrodkowo od wyczuwalnego tętna udowego (przyśrodkowo od mięśnia obszerny przyśrodkowy i bocznie od mięśnia smukłego) do żyły udowej, a następnie przeprowadź kaniulację żyły metodą Seldingera. Podłącz przygotowaną strzykawkę 60 ml do cewnika wewnątrznaczyniowego i pobierz 45 ml krwi.
- Uciskać miejsce nakłucia naczynia w celu uzyskania hemostazy (5 min), przerwać znieczulenie i doprowadzić do wybudzenia świni. Zwierzę jest monitorowane do pełnego wybudzenia, a następnie wraca do klatki.
- Rozcieńczyć roztwór krwi w stosunku 1:1 z buforem Hanksa (bez CaCl2)2, MgCl22, MgSO44) i nałóż równą objętość Histopaque, aby utworzyć wyraźne warstwy. Odwiruj (30 min, 740 g, ustawienie low break) i pobierz warstwę komórek mononuklearnych (MNC). Resuspenduj i przemyj MNC trzykrotnie za pomocą soli fizjologicznej w buforze Dulbecco (DPBS) (10 min, 515 g), a następnie wysiej je do dwóch płytek 12-dołkowych w pełnej pożywce wzrostowej (pożywka EBM-2 z 2% surowicy wieprzowej (PS) i EGM-2 SingleQuots) w temperaturze 37°C, 5% CO22.
- Powoli wymieniać pożywkę co 24 godziny przez pierwsze 7 dni, a następnie co drugi dzień. Identyfikować kolonie EPC po średnim czasie
przez 7 dni (Rycina 2). - Namnażaj EPC w kulturze, gdy zajmą one 1/4 powierzchni dołka w płytce 12-dołkowej. Potwierdź tożsamość EPC za pomocą cytometrii przepływowej, badając obecność markerów powierzchniowych CD31 oraz brak CD14 i CD45. Inne analizy, które można przeprowadzić, obejmują ocenę morfologii komórek oraz aktywność tlenku azotu III po poddaniu działaniu przepływu.4.
2. Montaż rurki tytanowej
- Przeciąć rurkę z Ti wzdłużnie na 3 równe segmenty pod kątem 120 stopni (długość 4,5 cm), używając tarczy nacinającej HHS z 72 zębami zamocowanej na wrzecionie piły w frezarce pionowej. Obroty ustawić na 300 RPM, a obszar cięcia stale nasycać płynem chłodzącym Tap Magic Cutting Fluid podczas całego procesu cięcia (Rysunek 3).
- Wypolerować powierzchnię wewnętrzną za pomocą szlifierki stołowej i metalowej tarczy Scotch-Brite. Następnie wypolerować ręcznie papierem ściernym 3M, aby dodatkowo wygładzić i wyrównać powierzchnię oraz usunąć wszelkie widoczne wżery.
- Oczyścić elementy z Ti roztworem mydła Alconox, a następnie zanurzyć na 5 min w wodzie królewskiej (stężony kwas azotowy do stężonego kwasu solnego w stosunku 1:3), po czym przepłukać kilkoma litrami wody10. Zachować szczególną ostrożność, ponieważ woda królewska jest silnie żrąca i potencjalnie wybuchowa!
- Poddać sekcje z Ti sonikacji przez 16 min w roztworze mydła Alconox, przepłukać 30 razy w wodzie dejonizowanej, a następnie ponownie sonikować przez 16 min w wodzie dejonizowanej. Pozostawić do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Odciąć rurkę termokurczliwą z PVC o długości 4,5 cm i dokładnie oczyścić zgodnie z punktem 2.4.
- Za pomocą pęsety umieścić 3 oczyszczone sekcje z Ti na wspierającym trzpieniu (wykonanym z aluminium, OD 8,5 mm) i nałożyć rękaw rurki termokurczliwej z PVC wokół sekcji z Ti (Rysunek 4). Kurczyć rurkę za pomocą opalarki, obracając trzpień, aby równomiernie i ściśle spiąć sekcje z Ti.
3. Montaż urządzenia do wysiewania i jego komponentów
- Uciąć rurki silikonowe na odcinki o długości 2,5 cm i 3,5 cm.
- Przeciąć plastikową strzykawkę 5 cc na poziomie oznaczenia 0,8 ml i zachować „część głowicową” z końcówką luer.
- Dokładnie oczyścić 2 odcinki silikonowe, „część głowicową” strzykawki oraz nakrętkę luera poprzez sonikację, zgodnie z opisem w punkcie 2.4.
- Przymocować rurki silikonowe do każdego końca złożonej rurki Ti z punktu 2.5, tak aby wystawały o 5 mm poza rurkę PVC.
- Wsunąć przecięty koniec „części głowicowej” strzykawki do krótkiej rurki silikonowej, tak aby przylegała ona do rurki Ti (Rysunek 5).
- Zapieczętować gotowy zestaw z rurką Ti wraz z jedną nakrętką luer w woreczku Tyvek i wysterylizować gazem tlenkiem etylenu (18 godzin w 5°C).
- Zamontować synchroniczny silnik czasowy (10 RPH) na platformie z pleksiglasu i połączyć jego oś z uchwytem do strzykawki (wykonanym z aluminium, pasującym do strzykawki 5 cc) (Rysunek 6).
4. Wysiewanie EPC na wewnętrzną powierzchnię rurki z Ti
- Namnożyć EPC wyizolowane zgodnie z punktem 1. do 3 konfluencych kolb T-75 (lub do uzyskania co najmniej 9 x 106 komórek).
- W dniu operacji oznakować komórki fluorescencyjnie za pomocą barwnika długoterminowego (PKH26)1. Rozpocząć od dwukrotnego wypłukania hodowanych EPC w medium bezzserylkowym. Należy zachować ostrożność i ograniczyć ekspozycję na światło, aby chronić komórki podczas i po znakowaniu.
- Przykryć komórki 4 μM PKH26 w Diluent C (roztwór barwnika) w temperaturze pokojowej przez 4 minuty.
- Zatrzymać reakcję znakowania, dodając surowicę wieprzową w objętości równej objętości roztworu barwnika. Po jednej minucie rozcieńczyć połączony roztwór w stosunku 1:1 pełnym medium wzrostowym.
- Odssać ciecz i wypłukać komórki 3 razy pełnym medium wzrostowym.
- Przemyć EPC dwukrotnie w DPBS (bez CaCl2, MgCl2).
- Przykryć komórki trypsyną i inkubować w 37°C przez 3 minuty, a następnie potwierdzić odczepienie komórek pod mikroskopem świetlnym. Dodać roztwór neutralizujący trypsynę w objętości dwukrotnej względem użytej trypsyny.
- Połączyć roztwory komórek w jednej probówce i wymieszać poprzez pipetowanie. Nanieść 10 μl roztworu komórek na każdą stronę hemocytometru w celu ich przeliczenia.
- Odwirować roztwór komórek (150 RPH, 5 min.). Przeliczyć komórki i resuspendować pellet do stężenia 2 - 2.5 x 106 EPC/ ml w medium bezzserylkowym. Należy pamiętać, że minimalna objętość niezbędna do wypełnienia zestawu rurek wynosi 4,5 ml.
- Rozłożyć sterylny ręcznik w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu stworzenia pola sterylnego. Wyłożyć na pole sterylne wysterylizowaną gazowo zestaw rur Ti oraz dodatkową strzykawkę 5 cc.
- W sterylnych rękawiczkach wyjąć tłok ze strzykawki 5 cc i pozostawić go na polu do późniejszego użycia. Przymocować korek Luer do tej strzykawki.
- Pipetować 4,5 - 5 ml zawiesiny EPC z punktu 4.9 do otwartego korpusu strzykawki. Stabilnie włożyć tłok z powrotem do otwartego końca strzykawki.
- Trzymając strzykawkę korkiem do góry, zdjąć korek. Wsunąć strzykawkę końcem Luer w otwartą rurkę silikonową zestawu rur Ti, aż do oporu; nie wsuwać dalej do wnętrza rurki Ti.
- Powoli przesuwać tłok strzykawki, aż roztwór komórek dotrze do górnej krawędzi odciętej „głowicy” strzykawki, usuwając pęcherzyki powietrza z systemu. Zamknąć korkiem Luer i włożyć cały zestaw do sterylnej osłony, uszczelniając otwarty koniec taśmą.
- Włożyć cały zestaw do obrobionego uchwytu strzykawki z punktu 3.7. Umieścić w inkubatorze w 37°C i wyregulować platformę tak, aby część rurki Ti komory zasiewczej była pozioma, korzystając z poziomicy (Rysunek 6).
- Pozostawić zestaw rur Ti w rotacji przez 30 minut przed implantacją.
5. Implantacja rurki z Ti do dolnej żyły głównej świni
- Na dwadzieścia cztery godziny przed operacją podać świni (z której wyizolowano EPC) lek przeciwbólowy w postaci plastra z fentanylem (10 μg/ hr przezskórnie; plaster pozostawić na okres 72 godzin).
- Świnia powinna pozostawać na czczo (NPO) przez noc; w dniu operacji, przed zabiegiem, podać Baytril (enrofloksacyna) w dawce 5 mg/ kg (IM), a następnie przez kolejne 7 dni co 24 godziny jako profilaktykę antybiotykową.
- Wprowadzić świnię w stan sedacji, przeprowadzić intubację i znieczulić zwierzę zgodnie z opisem w punkcie 1.3 (objętość oddechowa 10 -15 ml/ kg), a następnie unieruchomić świnię w pozycji na plecach na stole operacyjnym. Podczas procedury monitorować nasycenie tlenem, czynność serca oraz temperaturę. Utrzymywać termoregulację, korzystając z automatycznego podgrzewanego stołu operacyjnego, koca grzewczego oraz ogrzewając podawane płyny.
- Wprowadzić kaniulę dożylną (IV) 18 G do żyły usznej świni i zabezpieczyć oczy zwierzęcia kroplami Vetropolycin.
- Oczyścić, przygotować i obłożyć sterylną draperią brzuch świni zgodnie z punktem 1.6. Wykonać nacięcie w linii środkowej za pomocą skalpela nr 15, od drugiej pary gruczołów mlekowych w stronę kranialną do przedostatniej pary w stronę kaudalną.
- Przeprowadzić rozcięcie aż do powięzi brzusznej przy użyciu elektrokauteryzatora.
- Unieść otrzewną kleszczykami typu Mosquito i ostrożnie przeciąć ją nożyczkami Metzenbauma.
- Wyprowadzić pęcherz moczowy na zewnątrz i założyć szew purse-string (tobalkowy) 3-O Vicryl w ścianie pęcherza. Wykonać nacięcie punktowe w jego środku i wprowadzić cewnik Foleya 16 F. Podawać płyny dożylnie (roztwór Ringera z mleczanami), aby utrzymać diurezę na poziomie >/= 1 ml/ kg/ hr podczas operacji.
- Następnie wyprowadzić jelito cienkie i grube na zewnątrz i zastosować dwa rozszerzacze chirurgiczne Balfoura, aby odsłonić tylną część jamy otrzewnowej i zidentyfikować żyłę główną dolną (IVC).
- Za pomocą ostrej i tępej dyssekcji ostrożnie uwolnić IVC z otaczających tkanek i wypreparować naczynie od prawej tętnicy nerkowej proksymalnie do rozwidlenia IVC dystalnie. Należy zachować szczególną ostrożność podczas dyssekcji IVC, ponieważ nawet niewielki defekt w tej żyle może prowadzić do szybkiego krwotoku i wykrwawienia zwierzęcia.
- Podwiązać wszystkie odgałęzienia segmentu IVC, aby zapewnić brak krwawienia wokół implantowanej rurki Ti. Należy zwrócić uwagę na zazwyczaj duże dwie tylne żyły lędźwiowe, które wymagają bardzo ostrożnej dyssekcji i podwiązania. Ponadto, bezpośrednio proksymalnie od rozwidlenia IVC, po stronie posteromedialnej, często występuje duża żyła lędźwiowa, którą należy wypreparować i zabezpieczyć pętlami naczyniowymi w przygotowaniu do założenia zacisków.
- Przystąpić do zasiewania rurki Ti jednocześnie, zgodnie z opisem w punkcie 4.
- Bezpośrednio przed założeniem zacisków na IVC podać dożylnie heparynę w dawce 10 USP/ kg. Założyć zaciski chirurgiczne pod kątem 45 stopni najpierw dystalnie na IVC i żyłę lędźwiową, a następnie proksymalnie.
- Wyonać podłużną wenotomię (4 cm) pomiędzy zaciskami proksymalnym a dystalnym za pomocą skalpela nr 11, a następnie rozszerzyć nacięcie nożyczkami Pottsa.
- Usunąć krew z IVC i przepłukać światło naczynia sterylnym DPBS.
- Wprowadzić do IVC rurkę Ti zasianą komórkami EPC (lub kontrolną rurkę z gołego metalu) i wypełnić ją DPBS (z CaCl2, MgCl2), aby zapobiec wysychaniu komórek i usunąć powietrze.
- Zamknąć wenotomię szwem ciągłym 4-0 Prolene i usunąć jeden zacisk proksymalny, aby odprowadzić powietrze z IVC poprzez niewielki krwotok wsteczny. Założyć szew stabilizujący („stay-suture”) przez ścianę żyły do rurki PVC, aby zapobiec migracji implantu w czasie.
- Zamknąć powięź szwem O-PDS na igle CT, a przestrzeń podskórną szwem ciągłym 2-O Vicryl. Zamknąć skórę za pomocą zszywek.
- Podać do 20 ml 0,25% Marcaine (bupiwakaina) podskórnie wzdłuż miejsca nacięcia i przykryć ranę gazą oraz opatrunkiem Tegaderm. W razie potrzeby podawać podskórnie Flunixin (2,2 mg/ kg co 24 hr) i oksymorfon (0,15 mg/ kg co 3 - 4 hr) w celu uśmierzenia bólu.
- Przerwać znieczulenie, monitorować świnię do momentu wybudzenia i przenieść do klatki. Monitorować zwierzę dwa razy dziennie pod kątem oznak stresu/bólu, zdolności do stania i poruszania się, ilości stolca i moczu oraz koloru skóry wskazującego na prawidłową perfuzję.
6. Eksplantacja rurki z Ti
- Po 3 tygodniach przeprowadzić sedację, intubację i znieczulić świnię zgodnie z opisem w punktach 1.3 - 1.4.
- Wykonać laparotomię zgodnie z opisem w punktach 5.5 - 5.8.
- Należy pamiętać, że bliznowacenie przesłoni miejsce implantacji, jednak sztywną rurkę z Ti można wyczuć palpacyjnie in situ.
- Wypreparować IVC zgodnie z opisem w punktach 5.9 - 5.1 i usunąć rurkę z Ti en-block wraz z otaczającym ją IVC za pomocą ciężkich nożyc.
- Uśmiercić zwierzę, stosując roztwór do eutanazji Euthasol (390 mg/ ml pentobarbanu sodu i 50 mg/ ml fenytoiny sodu w dawce 1 ml/ 10 lbs).
7. Fixacja i obrazowanie wewnętrznej powierzchni Ti
- Opłucz wycięty segment żyły z rurką Ti w roztworze DPBS i sfotografuj jego światło (drożne lub zamknięte) za pomocą cyfrowego aparatu o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 7).
- Następnie utrwal preparat poprzez zanurzenie w 3,7% paraformaldehydzie na minimum 15 minut. Opłucz preparat w roztworze DPBS.
- Bardzo ostrożnie nacinaj otaczającą żyłę oraz rurkę PVC, aby odsłonić rurkę Ti. Umieść 3 sekcje pod mikroskopem fluorescencyjnym powierzchniami wewnętrznymi skierowanymi w stronę obiektywu/źródła światła i wykonaj obrazowanie przy długości fali wzbudzenia 50 nm, aby zwizualizować znakowane PKH26 komórki EPC w kolorze czerwonym/pomarańczowym (Rysunek 8A). W razie potrzeby komórki można dodatkowo barwić (np. markerem adhezji komórek śródbłonkowych płytek krwi (PECAM) w celu wizualizacji granic komórek (Rysunek 8B), barwnikiem DAPI w celu wizualizacji jąder itp.)).
8. Reprezentatywne wyniki:
Po wykonaniu niniejszego protokołu lekarze i naukowcy będą w stanie przeprowadzić endotelializację struktur rurek stałych przy użyciu autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka pochodzących z krwi w modelu dużego zwierzęcia. Rycina 2 wykazuje, że EPC wyizolowane naszą metodą pojawiają się jako kolonie o morfologii brukowanej po około 7 dniach hodowli. Nasze urządzenie do wysiewania przedstawione w Rysunki 5 i 6 umożliwia powolną rotację probówek z Ti wypełnionych zawiesiną EPC, co pozwala na uzyskanie jednorodnej warstwy na wewnętrznej powierzchni probówki w warunkach sterylnych9.
Nasza metoda operacji implantacji umożliwia badanie skłonności biomateriałów, takich jak Ti, do powstawania zakrzepicy w modelu dużego zwierzęcia. Stwierdziliśmy, że świnie dobrze tolerują ten zabieg, a implantację można przeprowadzić przy minimalnej utracie krwi i bez przerwania warstwy EPC.
Rycina 7 pokazuje, że niepowlekana rurka Ti ulega całkowitemu zamknięciu, podczas gdy rurka wyścielona komórkami EPC pozostaje drożna nawet w prozakrzepowym środowisku o niskim ścinaniu w żyle głównej dolnej. Ponadto obecność zlewnej warstwy fluorescencyjnie znakowanych komórek potwierdza skuteczność tej metody, co przedstawiono na Rycini 8.
Rysunek 1. Schemat eksperymentu z zasiewaniem autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka (EPC). W pierwszej kolejności pobierana jest krew obwodowa od świni. Następnie z krwi izolowane są komórki EPC, które poddawane są ekspansji w hodowli. Komórki EPC są następnie wykorzystywane do wyścielenia urządzenia w postaci rurki tytanowej (Ti), która następnie zostaje chirurgicznie wszczepiona do żyły głównej dolnej tej samej świni, od której wyizolowano komórki.
Rysunek 2. Reprezentatywna kolonia EPC w hodowli, około 7 dni po procedurze izolacji (obraz wykonany za pomocą odwróconego mikroskopu Leica DMIL z kamerą obrazującą i oprogramowaniem QCapture).
Rycina 3. Przekroje rurek z Ti przed montażem. Rurkę z Ti przecina się wzdłuż na 3 równe części, a następnie przycina do długości 4,5 cm. Powierzchnie wewnętrzne przekrojów z Ti poleruje się za pomocą szlifierki stołowej i papieru ściernego w celu usunięcia widocznych wżerów.
Rysunek 4. Montaż sekcji rurek z Ti przy użyciu termokurczliwych rurek z PVC (niebieskich) i opalarki. Sekcje z Ti są wsparte na obrobionym aluminium trzpieniu, który przechodzi przez sekcje z Ti i odpowiada wymiarom średnicy wewnętrznej rurki z Ti.
Rycina 5. Zespół rurki tytanowej z widokiem wszystkich komponentów: nakrętka Luer, „głowica” strzykawki, rurka silikonowa oraz rurka z Ti z owijką z PVC (niebieska). Zespół zostaje złożony przed sterylizacją do użytku chirurgicznego.
Rysunek 6. Układ do zasiewania rurek tytanowych (Ti) wewnątrz inkubatora, przedstawiający silnik, platformę, wykonany z aluminium uchwyt strzykawki, zespół rurek Ti oraz strzykawkę 5 cc. Uwaga: W celu lepszej wizualizacji zestaw przedstawiono bez ochronnej sterylnej osłony.
Rycina 7. Reprezentatywne makroskopowe wyniki operacji implantacji. (A) Widok końcowy kontrolnej tytanowej rurki (Ti) bez powłoki po implantacji w dolnej żyle głównej (IVC) świni. Światło rurki jest całkowicie zamknięte przez zwarty skrzep. (B) Widok końcowy rurki tytanowej zasiedlonej komórkami EPC po implantacji. Światło rurki jest w pełni drożne i czyste. (C) Widok po sekcji kontrolnej (gołej) rurki z Ti po 3 dniach implantacji, pokazujący zakres zakrzepicy (doświadczenia prowadzono do 3 tygodni, uzyskując identyczne wyniki).
Rycina 8. Komórki EPC na powierzchni rurki z Ti po 3 dniach implantacji (obrazowanie za pomocą mikroskopu Leica DMRB z monochromatyczną kamerą cyfrową QImaging QICAM i oprogramowaniem Image Pro Plus). (A) Konfluencyjne komórki na powierzchni wykazujące znakowanie PKH26 przed operacją. (B) Konfluencyjna warstwa EPC. Kolor czerwony: znakowanie PKH26 przed operacją. Kolor zielony: barwienie PECAM dla EPC.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda zasiewania komórek w rurkach z Ti umożliwia lekarzom i naukowcom szybką i jednorodną endotelializację powierzchni urządzeń implantowalnych mających kontakt z krwią. Ponieważ izolujemy i namnażamy EPC z próbek krwi obwodowej, pozyskanie tych komórek nie wymaga przeprowadzenia żadnego poważnego zabiegu inwazyjnego. Co więcej, EPC są autologiczne, dzięki czemu eliminuje się ryzyko wystąpienia reakcji immunologicznej na implant z zasianymi komórkami. Zasady zaprezentowane w tym protokole mogą być wykorzystane nie tylko w przypadku rurek z Ti, ale także dla wielu innych biomateriałów stosowanych w medycynie naczyniowej i kardiologii.
Kluczowymi etapami niniejszego protokołu są drobiazgowe czyszczenie rurek Ti, ponieważ stwierdzono, że każda przylegająca warstwa zanieczyszczeń upośledza adhezję komórek. Ponadto podczas procesu wysiewania niezbędna jest niska prędkość obrotu (odwrotnie proporcjonalna do średnicy rurki), aby EPC mogły powoli osiadać i przylegać do powierzchni podczas ruchu rurki Ti.
Nasza metoda wysiewania bezpośrednio przed implantacją pozwala uniknąć niepraktycznego czasu hodowli ex vivo; komórki przylegają indywidualnie, a następnie tworzą zwartą warstwę in vivo, co eliminuje ryzyko embolizacji w postaci płata bezpośrednio po przywróceniu przepływu. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że po osiągnięciu przez EPCs stanu konfluencji tworzą one macierz zewnątrzkomórkową, do której trwale przylegają, co dodatkowo minimalizuje możliwość złuszczenia warstwy śródbłonka. Choć nie można całkowicie wykluczyć możliwości odrywania się zatorów, ryzyko to wydaje się być wielokrotnie niższe niż ryzyko zakrzepicy całej powierzchni urządzenia, której zapobieganie jest celem tej terapii.
Nasze podejście polegające na implantacji do środowiska o niskim ścinaniu i prozakrzepowym w obrębie żyły głównej dolnej wykorzystuje jeden z najbardziej sprawdzonych modeli dużych zwierząt do badania kompatybilności krwi oraz zakrzepicy urządzeń5,6. Należy zaznaczyć, że wszelka opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institute of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i wyłącznie po zatwierdzeniu przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Duke.
Aby skutecznie wykorzystać tę metodę implantacji do testowania biomateriałów i urządzeń, ważne jest cierpliwe oczyszczenie z tkanek segmentu IVC oraz podwiązanie wszystkich odgałęzień żylnych w przygotowaniu do wprowadzenia urządzenia, tak aby krwawienie wokół urządzenia nie pochodziło z tzw. „fałszywego światła”. Kolejnym krytycznym krokiem jest dodanie DPBS do światła urządzenia, tak aby komórki na wewnętrznej powierzchni rurki pozostały wilgotne podczas zamykania wenotomii i przed rozpoczęciem reperfuzji. Jeśli urządzenie nie zostanie odnalezione w miejscu implantacji, mogło ono przemieścić się „w górę” IVC. Można temu zapobiec, przeprowadzając szew (4-O Prolene) przez ścianę żyły oraz przez odcinek rurki PVC o długości 2 – 3 mm, tak aby rurka była mocno zakotwiczona w obecnym położeniu. W przypadku gdy badacz ma trudności z odnalezieniem uprzednio znakowanych fluorescencyjnie komórek pokazanych na Rysunku 8 po eksplantacji z w innym stopniu drożnej rurki, prawdopodobne jest, że komórki oddzieliły się w postaci spójnej warstwy. Można temu zapobiec poprzez bardzo delikatną dyssekcję otaczającej żyły i demontaż 3 sekcji rurki z Ti, po uprzednim utrwaleniu żyły wraz z rurką.
Nasza technologia stanowi dowód koncepcji zapobiegania zakrzepicy urządzeń sercowo-naczyniowych poprzez zasiew EPC. Technologia ta może zostać wykorzystana w opracowywaniu implantów „biogennych” wyściełanych własnymi endotelialnymi komórkami progenitorowymi pacjentów. Badanie wykonalności w naszym modelu zwierzęcym na świniach stanowi pierwsze kroki w kierunku przeniesienia tej „medycyny personalizowanej” do praktyki klinicznej.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować firmie Leica Microsystems za cenne wskazówki dotyczące obrazowania przekrojów tytanowych oraz firmie Gemini Bio-Products za dostarczenie surowicy wieprzowej wykorzystanej w niniejszym badaniu. Dziękujemy również NIH za wsparcie w ramach grantu „Autologous EPC lining to improve biocompatibility of circulatory assist devices”, RC1HL099863-01. Ponadto jesteśmy wdzięczni National Science Foundation Graduate Research Fellowship za wsparcie Alexandry Jantzen. Chcielibyśmy również podziękować George'owi Quickowi, Mike'owi Lowe'owi i Ianthii Parker za pomoc w wielu aspektach procedury chirurgicznej oraz w obsłudze zwierząt badawczych. Steven Owen okazał się nieoceniony w obróbce wielu elementów naszego urządzenia do zasiewania komórek oraz w cięciu rurek tytanowych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Acepromazyna | Boehringer Ingeheim | BIC670025 | NAC# 10280002 |
| Precyzyjny środek czyszczący Alconox Powered Precision Cleaner | Alconox, Inc. | 1104 | |
| Retraktor chirurgiczny Balfoura | Adler | N/A | |
| Baytril | Bayer AG | APVMA 46028/0705 | |
| Igła motylkowa (19G) | Terumo Medical Corp. | SV19CLK | |
| Chlorheksydyna | 3M | 9200 | |
| Kleszczyki (45 stopni) | Aesculap | FC339T | |
| DPBS (-/-) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| DPBS (+/+) | GIBCO, by Life Technologies | 14040-133 | |
| DuraPrep | 3M | 8635 | |
| Pożywka EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | Baza dla pożywki bezsurowiczej oraz pełnej pożywki wzrostowej |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | CC-3162 | Stosowane z EBM-2 dla pożywki bezsurowiczej oraz pełnej pożywki wzrostowej |
| Narzędzie do elektrokoagulacji | Valleylab | SurgII-20 | |
| Papier ścierny | 3M | 60-0700-0425-8 | ziarnistość 240 |
| Roztwór do eutanazji Euthasol | Virbac Animal Health | ANADA #: 200-071 | |
| Plaster z fentanylem | Actavis | NDC # 67767-120-18 | |
| Fluniksyn | Merck & Co. | NAC #: 10470183 | |
| Cewnik Foleya (16F) | Bard | 730116 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H8264-500ML | |
| Opalarka | Milwaukee | 8988-20 | |
| Heparyna | NDC #: 25021 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | H8889-500ML | |
| Rurka intubacyjna | Mallinckrodt Baker Inc. | 86113 | |
| Izofluran | MWI Veterinary Supply | NDC #13985-030 | |
| Kaniula dożylna (18G) | BD Biosciences | 381547 | |
| Ketamina | Fort Dodge Animal Health | NDC #0856-2013 | |
| Poziomnica | Swanson | LLA001 | |
| Zaślepka do końcówki Luer-Lock | CML Supply | 909-001 | |
| Marcaine | Hospira Inc. | NDC #: 0409-1560-10 | |
| Nożyczki Metzenbauma | Adler | N/A | |
| Mikrowprowadza (5F) | Galt | KIT 002-01 | |
| Kleszczyki typu mosquito | Adler | N/A | |
| Silnik | Herbach and Rademan | H1-08 | |
| Oksymorfon | Endo Labs | NDC: 63481-624-10 | |
| Zestaw barwnika PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | |
| Surowica wieprzowa | Gemini Bio Products | 100-115 | stężenie 2% w pełnej pożywce wzrostowej |
| Nożyczki Pottsa | Adler | N/A | |
| Zszywacz skórny Precise Vista | 3M | 3998 | |
| Rurka PVC | McMaster-Carr | 7132K117 | rozszerzona średnica wewnętrzna 15,88 mm, odzyskana średnica wewnętrzna 7,95 mm |
| Kleszczyki kątowe, rozmiar średni | Adler | N/A | |
| Ostrze skalpela (#10-15) | Bard | 373910 | |
| Rurka silikonowa | McMaster-Carr | 51735K26 | średnica zewnętrzna 16,64 mm, średnica wewnętrzna 9,52 mm |
| Strzykawka (5 cc) | BD Biosciences | 309603 | |
| Tegaderm | 3M | 90001 | |
| Kurek trójdrożny | Kendall | 170060 | |
| Rurka tytanowa (Ti Tube) | Tico Titanium | N/A | Określona jako ½" średnicy zewnętrznej, ścianka .065", średnica wewnętrzna .370", .1737 lbs/ft |
| Trypsyna | Lonza Inc. | CC-5012 | |
| Roztwór neutralizujący trypsynę (TNS) | Lonza Inc. | CC-5002 | 0,03% |
| Vetropolycin | Pharmaderm Animal Health | NAC #: 12920110 | |
| Szew Vicryl (3-0) | Ethicon Inc. | J808T | |
| Myjka ultradźwiękowa w kąpieli wodnej | Branson | B200 |
Bibliografia
- Achneck, H. E. Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface. Circulation. 122, 2068-2077 (2010).
- Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient. Vascular. 16, 6-13 (2008).
- Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium. Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).
- Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
- Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).
- Ueberrueck, T. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. J Surg Res. 124, 305-311 (2005).
- Velik-Salchner, C. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thromb Res. 117, 597-602 (2006).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Achneck, H. E. American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).
- Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).
- Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking. J Surg Res. 62, 23-28 (1996).
Przedruki i uprawnienia
