Donosowe podawanie leku myszom za pomocą pipety i odwrotnej kaniulacji w celu dostarczania leku z nosa do mózgu

Streszczenie

Źródło: Kanazawa, T., et al. Nowatorskie metody podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym w celu oceny dostarczania leków z nosa do mózgu. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje donosowe podawanie leków znakowanych radioaktywnie znieczulonej myszy w celu uzyskania dostarczania leku z nosa do mózgu. Wyjaśnia, w jaki sposób leki przenikają przez nabłonek nosa i przemieszczają się szlakami neuronalnymi, aby dotrzeć do mózgu, a także w jaki sposób ruch rzęsek wpływa na zatrzymywanie i usuwanie leków. Dodatkowo film opisuje alternatywną metodę odwrotnej kaniulacji, która polega na wprowadzeniu kaniuli przez przełyk w celu dostarczenia leków przeciwko ruchowi rzęsek, zwiększając retencję i poprawiając wydajność transportu.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Zwierzęta wykorzystywane do podawania donosowego w znieczuleniu wziewnym

1. Myszy doświadczalne trzymane są w klatkach ze stali nierdzewnej w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność (światło w godzinach 8:00–20:00), z kontrolowaną temperaturą utrzymywaną na poziomie 23 ± 1°C, wilgotnością 50% ± 10% oraz dostępem ad libitum do pożywienia i wody.
2. Przed eksperymentem należy znieczulić myszy poprzez inhalację 2% izofluranu, po rozpoczęciu leczenia w stężeniu 4%. Potwierdź wymagany poziom znieczulenia, sprawdzając, czy nie zniknęła korekta powierzchni.

2. Przygotowanie roztworu do podawania

1. Przygotować roztwór do podawania [¹⁴C]-inuliny (50 μM, 0,5 μCi/ml na mysz) rozcieńczając w buforze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

3. Podawanie donosowe myszom

1. metodą mikropipet przy użyciu tymczasowo otwieranej maski inhalacyjnej (ryc. 1)
   1. Unieruchom myszy w pozycji leżącej na tablicy korkowej, zaklejając ich kończyny w znieczuleniu wziewnym 2% izofluranem (ryc. 1A).
   2. Podawaj całkowitą objętość 25 μl roztworu do podawania każdej myszy w odstępach 30-sekundowych, w dawkach od 1 do 2 μl podawanych naprzemiennie do lewego i prawego nozdrza, podczas gdy myszy są unieruchomione w znieczuleniu wziewnym (ryc. 1B i C).
   3. Uwaga: Odpadowy gaz znieczulający jest usuwany za pomocą środków aktywnych (okap wyciągowy, utwardzona szafka bezpieczeństwa biologicznego, próżnia itp.), gdy maska jest otwarta i w sposób pasywny (kanister z gazem znieczulającym odpady) po zamknięciu.
2. Metoda odwrotnej kaniulacji od strony dróg oddechowych przez przełyk (ryc. 2)
   1. Unieruchamiaj myszy w pozycji leżącej na tablicy korkowej, zaklejając ich kończyny w znieczuleniu wziewnym 2% izofluranem.
   2. Włosy na szyi są golone i przygotowywane poprzez aplikację betadyny lub chlorheksydyny, a następnie płukanie nasączone alkoholem.
   3. Odsłoń tchawicę i przełyk, rozszerzając skórę poniżej gardła kleszczami po wykonaniu małego nacięcia (1,5 cm) nożyczkami.
   4. Wykonaj nacięcie (1 mm) w tchawicy za pomocą nożyczek.
   5. Wprowadzić kaniulę (średnica wewnętrzna: 0,58 mm, średnica zewnętrzna: 0,965 mm) na długość 1,2 cm i przymocować przeciwległy koniec kaniuli do wnętrza maski wziewnej.
   6. Wykonaj nacięcie (1 mm) w przełyku za pomocą nożyczek, włóż kaniulę (średnica wewnętrzna: 0,28 mm, średnica zewnętrzna: 0,61 mm) na długość 1,4 cm w kierunku tylnej części jamy nosowej i podwiązaj ją (ryc. 2A i B). Uwaga: Procedury 3.2.2 do 3.2.4 przeprowadzono pod mikroskopem stereoskopowym w powiększeniu ×10.
   7. Przymocować igłę (27 g × 1/2) do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej roztworem do podawania i podłączyć do programowalnej pompy mikrostrzykawkowej.
   8. Podłącz powyższą igłę do kaniuli, która została wprowadzona do przełyku w punkcie 3.2.5 (ryc. 2C).
   9. Podawać całkowitą objętość 25 μl [¹⁴C] roztworu inuliny ze stałą szybkością (5 μl/min) (ryc. 2C i 2D).

Wyniki

Rysunek 1: Podanie donosowe za pomocą mikropipety w połączeniu z tymczasowo otwieraną maską wziewną. Fotografie przedstawiające nieruchomą mysz (A) z zamkniętą maską przed podaniem, (B) zbliżenie, oraz (C) całe widoki otwartej maski podczas p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule Nazwa Firma Numer katalogowy Komentarze ddY myszJaponia SLC, Inc. Mężczyzna, 4-6 tygodni, 20-30 gIsofluranePfizerv002139 Konfiguracja izofluranuSHINANO manufacturing CO. LTD.SN-487-OTAir, SN-489-4 Maska izofulanowaSHINANO manufacturing CO. LTD. Dla małych gryzoniMaska izofluranowa (typ opneable)SHINANO manufacturing CO., LTD. Specjalne zamówieniaPudełko anestezjologiczneSHINANO manufacturing CO. LTD.SN-487-85-02 Nożyczki do eksperymentów na zwierzętach-1NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.B-27H Nożyczki do eksperymentów na zwierzętach-2NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.Pęseta B-13H-1 NARZĘDZIA FINE SCIENCE Inc.11272-30Dumont #7 Pęseta Dumoxel-2NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.A-12-1 Rurka kaniuli (PE-50)Becton, Dickinson and Company.5069773Średnica wewnętrzna: 0,58 mm, średnica zewnętrzna: 0,965 mmRurka kaniuli (SP-10)NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.KN-392ID: 0,28 mm, OD: 0,61 mmGolarkaMARUKAN, LTD.DC-381 Mikroskop stereoskopowyOlympus CorporationSZ61 Igła 27G 1/2 w 13 mmTERUMO CORPORATIONNN-2738R Strzykawka 1 mlTERUMO CORPORATIONSS-01T Pompa strzykawkowaNeuro scienceNE-1000 MikroszpatułkaShimizu Akira Inc.91-0088 Mikropipeta (0,5-10 μl)Eppendorf AGZ368083 Chip do pipetEppendorf AG0030 000.811 Systemetykietowania Tape TimeMed, Inc.T-534-RDo mocowania myszy[¹⁴C]-inulinyAmerican Radiolabeled Chemicals Inc.ARC0124A0,1 mCi/mlEtOHWako Pure Chemical Industries, Ltd.Numer katalogowy: 054-00461