Przeznosowe przeszczepienie indukowanych pluripotencjalnych ludzkich komórek mikrogleju pochodzących z ludzkich komórek gleju do mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Parajuli, B., et.al. Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film pokazuje przeznosowe przeszczepienie indukowanych pluripotencjalnych komórek ludzkiego mikrogleju pochodzących z ludzkich komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu myszy. Hialuronidazę nakłada się na nozdrza myszy zubożonej w mikroglej w celu zwiększenia przepuszczalności. Zawiesinę iPSMG podaje się donosowo, a mysz może dojść do siebie. Pożywki bogate w czynniki wzrostu są regularnie podawane w celu wsparcia przeżycia iPSMG w tkance mózgowej.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie pożywki komórkowej, pożywki transplantacyjnej i mieszaniny anestezjologicznej

1. Przygotuj pożywkę komórkową, dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej i 0,1% penicyliny/streptomycyny do zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco.
2. Przygotować pożywkę do przeszczepu, dodając do pożywki komórkowej ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii 1 lub hCSF1 (250 ng/ml) i ludzki transformujący czynnik wzrostu beta 1 lub hTGF-β1 (100 ng/ml).
3. Przygotuj mieszaninę znieczulającą do wstrzyknięcia dootrzewnowego, mieszając 0,45 ml chlorowodorku medetomidyny, 1,2 ml midazolamu i 1,5 ml winianu butorfanolu w 11,8 ml zwykłej soli fizjologicznej.

2. Przygotowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek mikrogleju ludzkiego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych (iPSMG)

UWAGA: Zamrożony iPSMG (tabela materiałów) przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

1. Zamrożone komórki szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Mieszaj próbki, aż stopi się cały widoczny lód.
2. Dodać rozmrożony indukowany pluripotencjalny mikroglej ludzki pochodzący z ludzkich komórek macierzystych (iPSMG) do pożywki hodowlanej ogrzanej do 37 °C. Dodać 1 ml rozmrożonych komórek zawierających pożywkę (1 × 10⁶ komórek) do 10 ml pożywki hodowlanej.
3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórek.
4. Po odwirowaniu usunąć cały supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Całkowite usunięcie supernatantu jest pożądane w celu zmniejszenia rozcieńczenia stężenia cytokin w pożywce transplantacyjnej.
5. Dodać pożywkę do przeszczepu, aby uzyskać stężenie komórek 1 x 10⁵ komórek/μl.
6. Umieść iPSMG na lodzie i natychmiast przystąp do przeszczepu.
   UWAGA: Przygotowanie iPSMG do przeszczepu odbywa się na czystej ławce, aby uniknąć zanieczyszczenia.

3. Przygotowanie myszy do przeszczepu przeznosowego (Tsn)

1. Karmić samce myszy typu dzikiego (C57BL/6J, 8 tygodni) dietą zawierającą PLX5622 przez 7 dni.
2. Pod koniec 7^dnia należy przerwać dietę PLX i karmić myszy normalną dietą do końca badania.
   UWAGA: PLX5622 dietę zawierającą przygotowuje się przez dodanie 1,2 g PLX5622 w 1 kg AIN-93G (tabela materiałów).

4. Przeznosowe przeszczepienie komórek

1. 24 godziny po zaprzestaniu karmienia PLX zważyć myszy i znieczulić je za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny znieczulającej (0,2 ml/20 g).
2. Po całkowitym znieczuleniu myszy ocenianym na podstawie braku reakcji na odruch wycofania pedału (mocne szczypanie palca), podaj 2,5 μl hialuronidazy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (100 U/ml), 1 godzinę przed przeznosowym przeszczepem iPSMG do każdego nozdrza dwukrotnie za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl, aby zwiększyć przepuszczalność błony śluzowej nosa.
3. Po zastosowaniu hialuronidazy należy ułożyć myszy w pozycji leżącej.
4. Powtórz krok 4.2 10 minut przed przeznosowym przeszczepieniem iPSMG.
5. Nanieść 2,5 μl zawiesiny komórek do jednego nozdrza myszy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl.
6. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach na 5 minut przed podaniem zawiesiny komórek do drugiego nozdrza.
7. Powtórzyć kroki 4.5 i 4.6 cztery razy, nakładając całkowitą objętość 20 μl na zwierzę.
8. Umieść mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C do czasu wyleczenia ze znieczulenia.
9. Po 48 godzinach od zaprzestania karmienia PLX powtórz kroki 4.1-4.7 na tych samych myszach jeszcze raz.
   UWAGA: Należy zauważyć, że komórki iPSMG są umieszczane na lodzie podczas przeszczepu.

5. Zastosowanie cytokin

1. Znieczulić myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny znieczulającej (0,2 ml/20 g).
2. Nanieść 2,5 μl pożywki transplantacyjnej do jednego nozdrza myszy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl.
3. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach na 5 minut przed podaniem pożywki do przeszczepu do drugiego nozdrza.
4. Powtórzyć kroki 5.2 i 5.3 cztery razy, stosując łączną objętość 20 μl na zwierzę.
   UWAGA: Należy zauważyć, że donosowe podawanie pożywki transplantacyjnej (cytokin ludzkich) jest wymagane co 12 godzin, aby przeszczepiona iPSMG była zdatna do życia do końca badania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
Surowica bydlęca	GE Healthcare Nauki przyrodnicze	SH30070.03
Mrożone iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Laboratorium Odkrywania Leków i Badań nad Chorobami
Ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H-3506
Chlorowodorek medetomidyny	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldehyd	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Penicylina/streptomycyna	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Pipeta	Eppendorf	3120000011
Końcówka do pipety	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
Transformujący czynnik wzrostu-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21

<>