Przewidywanie wykorzystania koreceptora przez HIV-1 jest niezbędne do podania nowej klasy leków antyretrowirusowych, mianowicie antagonistów koreceptorów. Można to przeprowadzić poprzez analizę sekwencji genu env i późniejszą interpretację za pomocą internetowego systemu interpretacyjnego (geno2pheno[coreceptor]).
Artykuł metodologiczny
Przewidywanie wykorzystania koreceptora HIV-1 (tropizmu) poprzez analizę sekwencji z zastosowaniem podejścia genotypowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Marawirok (MVC) jest pierwszym licencjonowanym lekiem antyretrowirusowym z grupy antagonistów koreceptorów. Wiąże się on z koreceptorem gospodarza CCR5, który jest wykorzystywany przez większość szczepów HIV w celu zakażenia ludzkich komórek odpornościowych (Ryc. 1). Inne izolaty HIV wykorzystują inny koreceptor, CXCR4. To, który receptor jest wykorzystywany, jest determinowane w wirusie przez białko Env (Ryc. 2). W zależności od wykorzystywanego koreceptora wirusy klasyfikowane są odpowiednio jako R5 lub X4. MVC wiąże się z receptorem CCR5, hamując wniknięcie wirusów R5 do komórki docelowej. W przebiegu choroby mogą pojawić się wirusy X4 i zdominować wirusy R5. Wyznaczenie wykorzystania koreceptora (zwanego również tropizmem) jest zatem obowiązkowe przed podaniem MVC, zgodnie z wymogami EMA i FDA.
Badania nad efektywnością MVC w ramach projektów MOTIVATE, MERIT i 1029 zostały przeprowadzone z wykorzystaniem testu Trofile firmy Monogram, San Francisco, USA. Jest to wysokiej jakości analiza oparta na zaawansowanych testach rekombinacyjnych. Akceptacja tego testu w codziennej rutynie diagnostycznej jest poza USA raczej niska, ponieważ lekarze w Europie mają tendencję do współpracy z zdecentralizowanymi laboratoriami specjalistycznymi, które zapewniają również towarzyszące badania w kierunku oporności. Laboratoria te przeszły kilka ewaluacji zapewnienia jakości, z których ostatnia została przedstawiona w 2011 roku1.
Od kilku lat przeprowadzamy oznaczenia tropizmu w oparciu o analizę sekwencji regionu genu env-V3 wirusa HIV (V3)2. Region ten zawiera wystarczającą ilość informacji, aby przeprowadzić wiarygodną predykcję. Genotypowe oznaczenie wykorzystania koreceptora oferuje takie zalety jak: krótszy czas oczekiwania na wynik (porównywalny z badaniem oporności), niższe koszty, możliwość dostosowania wyników do potrzeb pacjentów oraz możliwość analizy próbek klinicznych z bardzo niską lub nawet niewykrywalną wiremią (VL), szczególnie że w ostatnich latach liczba analizowanych próbek z VL<1000 kopii/μl uległa znacznemu zwiększeniu (Rys. 3).
Główne etapy badania tropizmu (Ryc. 4) zaprezentowane w tym filmie:
1. Pobranie próbki krwi
2. Izolacja RNA HIV z osocza i/lub prowiralnego DNA HIV z mononuklearnych komórek krwi
3. Amplifikacja regionu env
4. Amplifikacja regionu V3
5. Reakcja sekwencjonowania amplikonu V3
6. Oczyszczanie próbek do sekwencjonowania
7. Sekwencjonowanie oczyszczonych próbek
8. Edycja sekwencji
9. Interpretacja danych sekwencjonowania i przewidywanie tropizmu
Protokół
Protokół został podsumowany na Rys. 4.
1. Pobieranie próbek krwi
- Pobrać co najmniej 3 ml krwi do probówek z EDTA w ośrodku klinicznym.
- Próbki można przechowywać do tygodnia w temperaturze 4°C.
- Próbki krwi z EDTA należy jak najszybciej wysłać do laboratorium pocztą zwykłą.
2. Izolacja RNA i/lub DNA HIV
- Wyizolować wirusowe RNA i/lub DNA z 1000 μl krwi pełnej, surowicy lub osocza, wykorzystując zestaw MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation I oraz system MagNA Pure Compact System.
- Eluować otrzymane RNA lub DNA w 50 μl buforu TE. Alternatywnie można zastosować inne procedury oczyszczania kwasów nukleinowych.
3. Amplifikacja regionu env
Przeprowadź amplifikację regionu env (Ryc. 2 i 4) z RNA plazmy lub prowiralnego DNA. Powstanie produkt o długości 1245 bp, obejmujący większość białka Env (nt 6556-7811 zgodnie z HXB2).
- Próbki RNA: reakcja RT-PCR
- Wirusowe RNA posiada bardzo złożoną strukturę drugorzędową (Rys. 4), która może utrudniać reakcję RT. Aby uniknąć tego problemu, inkubować 10 μl RNA w temperaturze 65°C przez 10 minut (bezpośrednio w probówce PCR i w termocyklerze), a następnie obniżyć temperaturę do 50°C.
- Dodać 40 μl PCR Master Mix zawierającego startery Env-F i Env-R.
Master Mix dla systemu RT-PCR In-House:
objętość/reakcja (μl) stężenie końcowe RNase-free H2O 14.4 5x Buffer (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) 10 1x 5x Q-Solution 10 1x dNTP Mix (10 mM each) 2 400 μM każdego dNTP Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) 2 Primer Env-F (100 μM) 0.3 0.6 μM Primer Env-R (100 μM) 0.3 0.6 μM RNase Inhibitor (RNasin) 1 5 jednostek/reakcja
Env-F: 5'- CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3' (nt 6556→6586 zgodnie z HXB2)
Env-R: 5'- AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3' (nt 7785←7811) - Przeprowadzić reakcję RT w temperaturze 50°C przez 30 minut.
- Przeprowadzić pierwszą reakcję PCR zgodnie z poniższymi parametrami:
95°C, 15min 1 x 95°C, 30 sec
50°C, 30 sec
72°C, 2 min1 x 95°C, 30 sec
56°C, 30 sec
72°C, 2 min38 x 72°C, 10 min
4°C ∞
- Próbki DNA: reakcja PCR
W przypadku próbek prowirusowego DNA wstępna reakcja RT nie jest wymagana i można bezpośrednio rozpocząć reakcję PCR.- Dodać 40 μl PCR Master Mix do 10 μl prowirusowego DNA.
Master Mix dla systemu PCR In-House:
objętość/reakcja (μl) stężenie końcowe RNase-free H2O 15.4 5x Buffer (HotStarTaq DNA Polymerase) 10 1x 5x Q-Solution 10 1x dNTP Mix (10 mM each) 2 400 μM każdego dNTP Enzym-Mix (HotStarTaq DNA Polymerase) 2 Primer Env-F (100 μM) 0.3 0.6 μM Primer Env-R (100 μM) 0.3 0.6 μM
Env-F: 5'- CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3' (nt 6556→6586)
Env-R: 5'- AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3' (nt 7785←7811) - Zastosować warunki PCR opisane wcześniej dla próbek RNA (Krok 3.1.4).
- Dodać 40 μl PCR Master Mix do 10 μl prowirusowego DNA.
4. Amplifikacja regionu V3: PCR zagnieżdżony
- Do reakcji nested PCR należy użyć 5 μl produktu z pierwszej reakcji PCR (bez wcześniejszej analizy w żelu agarozowym) jako matrycy i dodać 95 μl Master Mixu do PCR.
Master Mix do Nested-In-House PCRobjętość/reakcja (μl) stężenie końcowe H2O 61.9 10x PCR Buffer 10 1x 5x Q-Solution 20 1x dNTP Mix (10 mM each) 2 200 μM każdego dNTP Starter Env-2F (100 μM) 0.3 0.6 μM Starter Env-2R (100 μM) 0.3 0.6 μM HotStarTaq DNA Polymerase 0.5 2,5 jednostek/reakcja
Env-2F: 5'- GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3' (nt 6838→6864)
Env-2R: 5'- CACCACTCTTCTCTTTGCCTTGGTGGGTGC -3' (nt 7712←7742) - Reakcję PCR należy przeprowadzić zgodnie z następującymi parametrami:
93°C, 15 min1 x 95°C, 30 s
50°C, 30 s
72°C, 90 s1 x 95°C, 30 s
56°C, 30 s
72°C, 90 s43 x 72°C, 10 min
4°C ∞ - Produkt PCR należy przeanalizować w 1% żelu agarozowym (Rys. 4). Oczekiwany produkt ma długość 902 bp.
- Oczyszczanie próbek do sekwencjonowania.
- Produkt PCR należy oczyścić za pomocą zestawu Qiagen PCR-Purification, stosując protokół, roztwory i mikrokolumny dostarczone przez producenta. Elucję przeprowadza się w 30-100 μl buforu PE, w zależności od intensywności prążka.
- Alternatywnie próbki można oczyścić przy użyciu egzonukleazy I i Fast AP (fosfatazy alkalicznej Thermo). W tym celu do 15 μl produktu PCR dodaje się 6 μl mieszaniny Exo-AP Mix i inkubuje przez 15 minut w temperaturze 37°C.
580 μl H2O 66 μl fast AP 13.4 μl Exo I
5. Reakcja sekwencjonowania amplikonu V3
- Reakcja sekwencjonowania polega na przeprowadzeniu reakcji PCR z użyciem tylko jednego z poniższych starterów:
Env-2: 5'- GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959→6980)
Env-5: 5'- AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3' (nt 7352←7371)
Env-6: 5'- GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3' (nt 6979→7000)
Env-7: 5'- TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3' (nt 7530←7549)
Env-10: 5' - GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478←7507)
Env-11: 5' - TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638←7664)
Startery pierwszego wyboru to: Env-2, Env-6 lub Env-7, Env-11 - Użyć 1 μl oczyszczonego amplikonu V3 jako matrycy i dodać 9 μl master-mixu do PCR.
Master Mix do sekwencjonowania:4 μl mieszaniny do sekwencjonowania (HIV-Genotyping Kit) 4 μl H2O 1 μl startera (100 pmol/μl) - Reakcję sekwencjonowania przeprowadzić zgodnie z poniższymi parametrami:
96°C, 10 sec 50°C, 10 sec 36 x 60°C, 45 sec 4°C ∞
6. Oczyszczanie próbek do sekwencjonowania
Oczyść sekwencje, wykorzystując Sephadex G-50 superfine.
- Wypełnij odpowiednią liczbę dołków w „loaderze kolumn” żywicą Sephadex G-50 superfine. Przenieś Sephadex na płytkę filtrującą MAHVN4510, odwracając ją.
- Dodaj 300 μl wody Milli-Q H2O do każdego dołka w płytce filtrującej i inkubuj przez co najmniej 3h w temperaturze 2-8°C.
- Wiruj płytki przez 5 min przy 910Xg w temperaturze 4-15°C. Usuń filtrat.
- Dodaj 10 μl H2O do produktu sekwencjonowania, a następnie nanieś produkt na płytkę z napęczniałym Sephadexem.
- Aby uzyskać oczyszczony produkt, wiruj płytkę przez 5 min przy 910Xg w temperaturze 4-15°C i zbierz filtrat.
7. Sekwencjonowanie oczyszczonych próbek na sekwenconversorze ABI Prism 3130 XL
- Przed każdym uruchomieniem należy wymienić bufor i sprawdzić objętość polimeru (POP7). W razie potrzeby należy zastąpić zużytą kolbę z polimerem nową.
- Należy zastosować zapisane warunki analizy, w tym czas wstrzyknięcia wynoszący 18 sekund.
- W tym urządzeniu zbieranie danych sygnałowych z jednego przebiegu dla 16 próbek sekwencyjnych trwa około 60 min (kapilara 36 cm) lub 150 min (kapilara 50 cm).
8. Edycja sekwencji
- Do wyrównania i edycji sekwencji należy użyć programu Lasergene (DNA-Star) (Ryc. 5). Można zastosować również inne programy do edycji sekwencji. Jako referencje należy wykorzystać "V3-Consensus B" oraz sekwencję konsensusową env.
- Program Lasergene tworzy sekwencję konsensusową analizowanej próbki, wykorzystując wszystkie dostępne surowe dane, i zapisuje ją w formacie pliku FASTA. Plik FASTA jest plikiem tekstowym, który zawiera nagłówek z nazwą próbki oraz sekwencję nukleotydową.
9. Interpretacja danych sekwencjonowania i przewidywanie tropizmu
- Interpretacja danych sekwencjonowania jest wykonywana za pomocą internetowego systemu interpretacyjnego geno2pheno[coreceptor] (http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). W celu przewidzenia tropizmu można wybrać różne ustawienia FPR. Ustawienie domyślne jest zgodne z niemiecko-austriackimi wytycznymi terapeutycznymi. W przypadku FPR ≥ 20%, wirus jest klasyfikowany jako R5, gdy FPR ≥ 20%, oraz jako X4 dla FPR < 12,5%.
- Prześlij plik FASTA na serwer. Serwer ten transluduje sekwencję nukleotydową na aminokwasy, dopasowuje ją do sekwencji V3-Consensus B i dokonuje klasyfikacji podtypu. Ponadto generuje prognozę wykorzystania koreceptora (Rys. 4) wyrażoną jako wskaźnik wyników fałszywie dodatnich (FPR).
10. Reprezentatywne wyniki
Wynik geno2pheno[coreceptor] przedstawia stopniowaną interpretację tropizmu. W zależności od prawdopodobieństwa wykorzystania koreceptora, tekst interpretacji i kolor tła zmieniają się od zielonego (<20% FPR), sugerującego bezpieczne podanie MVC, przez żółty, sugerujący możliwe, niskie ryzyko, aż po czerwony. Kolor czerwony sugeruje, aby nie przepisywać MVC. Dodatkowo serwer generuje raport w formacie pdf, który można wydrukować, uzupełnić o dane pacjenta i próbki, a następnie przesłać do lekarza. Przykłady wyników geno2pheno[coreceptor] przedstawiono na Rys. 6.
Rycina 1. Schemat replikacji HIV. Wirion musi związać się z komórkowym receptorem CD4 oraz z koreceptorem CCR5 lub CXCR4. Koreceptor CCR5 może zostać zablokowany przez antagonisty CCR5, takie jak Maraviroc (MVC, Celsentri, Selzentry). Po fuzji błony wirusowej i komórkowej nukleokapsyd wirusa zostaje uwolniony do cytoplazmy. Nukleokapsyd ulega rozpadowi, a kompleks RNA wirusa zostaje uwolniony do cytoplazmy. Wirusowa odwrotna transkryptaza (RT) przepisuje genomowy RNA na DNA prowirusowe, które jest następnie transportowane do jądra i włączane do genomu gospodarza przez integrazę HIV. Komórkowe polimerazy RNA przepisują wirusowe RNA genomowe i mRNA z genomu prowirusowego. Białka wirusowe są produkowane w cytoplazmie i transportowane na powierzchnię komórki. Cząsteczki wirusa wypączkowują z komórek jako niedojrzałe, niezakaźne wiriony. Proteaza HIV rozcina białka, tworząc zakaźne cząsteczki. Zahamowanie jednego z tych etapów prowadzi do przerwania cyklu replikacyjnego.
Leki antyretrowirusowe oraz etapy replikacji, które one hamują, są zaznaczone na czerwono.
Wirusowe RNA oraz prowirusowe DNA (materiał używany do analizy tropizmu lub oporności) są zaznaczone na zielono.
Rycina 2. Genom prowirusowy HIV. Cząsteczka HIV zbudowana jest z różnych białek strukturalnych i zawiera różnorodne enzymy oraz białka pochodzenia zarówno wirusowego, jak i komórkowego. Na rycinie przedstawiono rozmieszczenie genów w genomie wirusa. Białka powierzchniowe gp120 i gp41 tworzą wypustki na powierzchni wirionu i kontaktują się z komórką ludzką, aby przeprowadzić fuzję błon. W dolnej części ryciny przedstawiono produkty amplifikacji PCR oraz startery użyte w naszym protokole.
Rycina 3. Odsetek pacjentów z pomiarami niskiego ładunku wirusowego (VL) analizowanych pod kątem określenia oporności na leki lub tropizmu w Instytucie Wirusologii Uniwersytetu w Kolonii (Niemcy).
Rysunek 4. Ogólny schemat eksperymentu.. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5. Edycja sekwencji w programie Lasergene. Amplikony V3 są sekwencjonowane z użyciem co najmniej jednego primera forward i jednego primera reverse. Program Lasergene dopasowuje pliki „.abi” uzyskane z sekwenatora do sekwencji referencyjnych „V3-Consensus B” oraz env. Lasergene tworzy sekwencję konsensusową, wykorzystując wszystkie dostępne dane surowe. Sekwencje referencyjne mogą zostać oznaczone (wtedy są wyświetlane w kolorze szarym), aby nie miały wpływu na sekwencję konsensusową próbki.
Rycina 6. Raporty z predykcji tropizmu wygenerowane przez narzędzie geno2pheno[coreceptor]. Raporty są generowane jako pliki pdf, które można zapisać i uzupełnić na komputerze. Dodatkowe dane, takie jak imię i nazwisko pacjenta, data pobrania krwi itp., mogą zostać wprowadzone ręcznie za pomocą programu do edycji pdf. Można również dodać szczegółowe uwagi. Dane te znajdują się wyłącznie na komputerze użytkownika, a nie na serwerze geno2pheno[coreceptor]. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Sekwencja V3 umożliwia wiarygodne przewidywanie tropizmu wirusowego, co wykazano w badaniach klinicznych3-9. W rzeczywistości oznaczenie genotypowe jest uwzględnione w aktualnych wytycznych europejskich oraz niemiecko-austriackich10.
W porównaniu z badaniami fenotypowymi, nie tylko czas oczekiwania na wynik jest krótszy (porównywalny z testami oporności), ale również koszty są niższe. Ponadto główną zaletą badań genotypowych jest to, że wyniki są klasyfikowane jako FPR, a zatem mogą być dostosowane do potrzeb pacjentów. Z kolei wyniki Trofile to po prostu raporty R5 lub X4, a dostęp do surowych danych nie jest zapewniony.
Obecnie europejskie wytyczne sugerują wartość graniczną FPR na poziomie 20%10, podczas gdy wytyczne austriacko-niemieckie dopuszczają dostosowanie wartości granicznej FPR konkretnie do potrzeb każdego pacjenta11. W związku z tym w przypadku pacjentów z szerokim wachlarzem opcji leków antyretrowirusowych zaleca się wyższe wartości graniczne FPR (> 20%). Z kolei u pacjentów z rozległą historią wcześniejszego leczenia i ograniczonymi opcjami terapeutycznymi można stosować niższe wartości graniczne FPR (> 5%). Tego rodzaju prowadzenie terapii opiera się obecnie na badaniu oporności na NRTI, NNRTI, PI oraz INI, gdzie leki częściowo aktywne mogą zostać włączone do leczenia pacjentów z ograniczonymi opcjami terapeutycznymi. Dodatkowo, ze względu na rosnącą liczbę zmian w terapii kierowanych genotypowo, klinicznie istotne wartości graniczne FPR są stale korygowane przez panel bioinformatyków, wirusologów i klinicystów.
Kolejną istotną zaletą testowania tropizmu genotypowego jest możliwość analizy próbek klinicznych z bardzo niską lub nawet niewykrywalną wiremią (VL). W przypadkach, gdy RNA z osocza nie nadaje się do amplifikacji, można zsekwencjonować prowiralne DNA i wykorzystać je do wiarygodnych przewidywań9,12. Należy zauważyć, że liczba pacjentów z niską lub niewykrywalną wiremią gwałtownie wzrosła w ostatnich latach. Do chwili obecnej test Trofile umożliwia analizę próbek jedynie u pacjentów z VL<1000 kopii/ml. Jednak wstępne badania wykazały, że prowiralne DNA może być również odpowiednie do badania za pomocą metody Trofile13.
Oświadczenia
Niniejszy artykuł wideo jest sponsorowany przez ViiV Healthcare oraz GlaxoSmithKline.
Podziękowania
Autorzy otrzymali finansowanie z projektów Corus, MedSys Cell Entry, CHAIN oraz Resina.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do izolacji kwasów nukleinowych MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I | Roche Group | 04 802 993 001 | |
| System MagNA Pure Compact System | Roche Group | 03731146001 | |
| Termocykler T3000 Thermocycler | Biometra | 050-723 | |
| Zestaw One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210215 | |
| Zestaw HotStarTaq Master Mix Kit | Qiagen | 203445 | |
| Zestaw do oczyszczania produktów PCR QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Egzonukleaza I (Exo I) | Fermentas | EN0582 | |
| Termolabilna fosfataza alkaliczna FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Fermentas | EF0651 | |
| Zestaw do sekwencjonowania cyklicznego BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337457 | |
| Sephadex G-50 Superfine | GE Healthcare | 17-0041-01 | |
| Sekwenator kapilarny ABI Prism 3130 XL | Applied Biosystems | 3130XL |
Bibliografia
- Heger, E., Schuelter, E., Klimkait, T., Lengauer, T., Kaiser, R., Walter, H., Sierra, S. European coreceptor proficiency panel test. 9th European Workshop on HIV & Hepatitis Treatment Strategies & Antiviral Drug Resistance, Paphos, Cyprus, , (2011).
- Lengauer, T., Sander, O., Sierra, S., Thielen, T., Kaiser, R. Bioinformatic prediction of HIV coreceptor usage. Nature Biotech. 25 (12), 1407-1410 (2007).
- McGovern, R., Dong, W., Zhong, X., Knapp, D., Thielen, A., Chapman, D., Lewis, M., James, I., Valdez, H., Harrigan, P. R. Population-based Sequencing of the V3-loop Is Comparable to the Enhanced Sensitivity Trofile Assay in Predicting Virologic Response to Maraviroc of Treatment-na ve Patients in the MERIT Trial. 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).
- Reuter, S., Braken, P., Jensen, B., Sierra-Aragon, S., Oette, M., Balduin, M., Kaiser, R., Haussinger, D. Maraviroc in treatment-experienced patients with HIV-1 infection - experience from routine clinical practice. Eur. J. Med. Res. 15 (6), 231-237 (2010).
- Recordon-Pinson, P., Soulie, C., Flandre, P., Descamps, D., Lazrek, M., Charpentier, C., Montes, B., Trabaud, M. A., Cottalorda, J., Schneider, V., Morand-Joubert, L., Tamalet, C., Desbois, D., Mace, M., Ferre, V., Vabret, A., Ruffault, A., Pallier, C., Raymond, S., Izopet, J., Reynes, J., Marcelin, A. G., Masquelier, B. Evaluation of the genotypic prediction of HIV-1 coreceptor use versus a phenotypic assay and correlation with the virological response to maraviroc: the ANRS GenoTropism study. Antimicrob. Agents. Chemother. 54 (8), 3335-3340 (2010).
- Swenson, L. C., Knapp, D., Harrigan, P. R. Calibration and accuracy of the geno2pheno co-receptor algorithm for predicting HIV tropism for single and triplicate measurements of V3 genotype. 10th International Congress on Drug Therapy in HIV Infection, Glasgow, UK, , (2010).
- Macartney, M. J., Cameron, J., Strang, A., García, A., Booth, C., Marshall, N., Johnson, M., Geretti, A. M. Use of a genotypic assay for the prediction of HIV-1 coreceptor tropism and guiding the use of CCR5 antagonists in clinical practice. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
- Sierra, S., Thielen, A., Reuter, S., Jensen, B., Esser, S., Fätkenheuer, G., Lengauer, T., Pfister, H., Sichtig, N., Kaiser, R. Tropism determination and clinical outcome of 61 patients under MVC treatment. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
- Obermeier, M., Carganico, A., Bieniek, B., Schleehauf, D., Dupke, S., Fischer, K., Freiwald, M., Neifer, S., Schuler, C., Mayr, C., Klausen, G., Köppe, S., üünsche, T., Berg, T., Baumgarten, A. Tropism testing from proviral DNA - analysis of a subgroup from the Berlin Maraviroc cohort. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).
- Vandekerckhove, L. P., Wensing, A. M., Kaiser, R., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., De Luca, A., Dressler, S., Garcia, F., Geretti, A. M., Klimkait, T., Korn, K., Masquelier, B. European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing. Lancet Infect Dis. 11 (5), 394-407 (2011).
- Walter, H., Eberle, J., Möller, H., Noah, C., Wolf, E., St rmer, M., Braun, P., Krn, K., D umer, M., Berg, T., Obermeier, M., Thielen, A., Kaiser, R. Empfehlung zur Bestimmung des HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs (DAIG Recommendations for the HIV-1 tropism testing). , (2011).
- Obermeier, M. J., Carganico, A., Dupke, S., Schranz, D., Cordes, C., Freiwald, M., Klausen, G., Köppe, S., Schuler, C., Mayr, C., Schleehauf, D., Berg, T., Krznaric, I., Baumgarten, A. Clinical application of genotypic co-receptor tropism testing from viral RNA and proviral DNA: week 24 analysis of the Berlin maraviroc cohort. Journal of the International AIDS Society. 13, Suppl . 4. 129-129 (2010).
- Toma, J., Frantzell, A., Hoh, R., Martin, J., Deeks, S., Petropoulos, C., Huang, W. Determining HIV-1 Co-receptor Tropism Using PBMC Proviral DNA Derived from Aviremic Blood Samples. 18th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Przewidywanie tropizmu HIVanaliza wykorzystania koreceptor wsekwencjonowanie regionu V3narz dzie Geno to Phenobadanie podatno ci na maravirokamplifikacja za pomoc zagnie d onej PCRizolacja RNA HIVinterpretacja danych sekwencyjnychanaliza punktu odci cia FPRbadanie oporno ci na leki antyretrowirusowe
