Przewidywanie użycia koreceptorów HIV-1 (tropizm) za pomocą analizy sekwencji przy użyciu podejścia genotypowego

Summary

Przewidywanie użycia koreceptorów HIV-1 jest wymagane do podawania nowej klasy leków antyretrowirusowych, tj. antagonistów koreceptorów. Można to przeprowadzić poprzez analizę sekwencji genu env, a następnie interpretację za pomocą internetowego systemu interpretacji (geno2pheno_[koreceptor]).

Abstract

Maraviroc (MVC) jest pierwszym licencjonowanym lekiem antyretrowirusowym z klasy antagonistów receptorów. Wiąże się z koreceptorem gospodarza CCR5, który jest wykorzystywany przez większość szczepów HIV w celu zakażenia ludzkich komórek odpornościowych (ryc. 1). Inne izolaty HIV wykorzystują inny koreceptor, CXCR4. To, który receptor jest używany, określa w wirusie białko Env (ryc. 2). W zależności od zastosowanego koreceptora, wirusy są klasyfikowane odpowiednio jako R5 lub X4. MVC wiąże się z receptorem CCR5, hamując wnikanie wirusów R5 do komórki docelowej. W przebiegu choroby mogą pojawić się wirusy X4 i przerosnąć wirusy R5. Określenie użycia koreceptorów (zwanego również tropizmem) jest zatem obowiązkowe przed podaniem MVC, zgodnie z wymogami EMA i FDA.

Badania nad wydajnością MVC MOTIVATE, MERIT i 1029 zostały przeprowadzone za pomocą testu Trofile z Monogram, San Francisco, U.S.A. Jest to wysokiej jakości test oparty na zaawansowanych testach rekombinowanych. Akceptacja tego testu do codziennej rutyny jest raczej niska poza USA, ponieważ europejscy lekarze raczej mają tendencję do współpracy ze zdecentralizowanymi laboratoriami eksperckimi, które zapewniają również równoległe testy odporności. Laboratoria te przeszły szereg ocen zapewnienia jakości, z których ostatnia została przedstawiona w 2011 r.¹.

Od kilku lat przeprowadzamy pomiary tropizmu na podstawie analizy sekwencji z regionu genu HIV env-V3 (V3)². Ten region zawiera wystarczającą ilość informacji, aby wykonać wiarygodną prognozę. Genotypowe określenie wykorzystania koreceptorów niesie ze sobą takie korzyści jak: krótszy czas obrotu (odpowiednik badania oporności), niższe koszty, możliwość dostosowania wyników do potrzeb pacjentów oraz możliwość analizy próbek klinicznych o bardzo niskim lub wręcz niewykrywalnym mianie wirusa (VL), zwłaszcza że liczba próbek analizowanych z VL<1000 kopii/μl w ostatnich latach wzrosła z grubsza (ryc. 3).

Główne kroki do testowania tropizmu (Rys. 4) pokazane w tym filmie:

1. Pobranie próbki krwi
2. Izolacja RNA wirusa HIV z osocza i/lub DNA prowirusa HIV z komórek jednojądrzastych krwi
3. Wzmocnienie regionu env
4. Wzmocnienie regionu V3
5. Reakcja sekwencyjna amplikonu V3
6. Oczyszczanie próbek do sekwencjonowania
7. Sekwencjonowanie oczyszczonych próbek
8. Edycja sekwencji
9. Sekwencjonowanie, interpretacja danych i przewidywanie tropizmu

Protocol

Protokół jest podsumowany na rys. 4.

1. Pobieranie próbek krwi

1. Pobrać co najmniej 3 ml krwi do probówek EDTA w miejscu klinicznym.
2. Próbki mogą być przechowywane do tygodnia w temperaturze 4°C.
3. Próbki krwi EDTA należy wysłać do laboratorium tak szybko, jak to możliwe, zwykłą pocztą.

2. Izolacja RNA i/lub DNA wirusa HIV

1. Uzyskać wirusowe RNA i/lub DNA z 1000 μl krwi pełnej, surowicy lub osocza, używając zestawu MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation I I i MagNA Pure Compact System.
2. Eluować uzyskane RNA lub DNA w 50 μl buforu TE. Alternatywnie można zastosować inne procedury oczyszczania kwasów nukleinowych.

3. Wzmocnienie regionu env

Amplifikuj region env (ryc. 2 i 4) z RNA osocza lub prowirusowego DNA. Powstaje produkt o długości 1245 pz, zawierający większość białka Env (nt 6556-7811 według HXB2).

1. Próbki RNA: reakcja RT-PCR
   1. Wirusowe RNA ma bardzo złożoną strukturę drugorzędową (ryc. 4), która może utrudniać reakcję RT. Aby uniknąć tego problemu, inkubuj 10 μl RNA w temperaturze 65°C przez 10 minut (już w probówce PCR i w maszynie do PCR), a następnie zmniejsz temperaturę do 50°C.
   2. Dodać 40 μl PCR Master Mix, w tym starterów Env-F i Env-R.
      
      Master Mix do wewnętrznego systemu RT-PCR:
        Objętość/reakcja (μl) Stężenie końcowe Nie zawiera RNaz H₂O 14,4   5x Bufor (zestaw Qiagen OneStep RT-PCR) 10 1x 5x Rozwiązanie Q 10 1x Miks dNTP (10 mM każdy) cyfra arabska 400 μM każdego dNTP Enzym-Mix (zestaw Qiagen OneStep RT-PCR) cyfra arabska   Podkład Env-F (100 μM) 0,3 0,6 μM Podkład Env-R (100 μM) 0,3 0,6 μM Inhibitor RNazy (RNasina) 1 5 jednostek/reakcję
      
      Env-F: 5'- CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3' (nt 6556→6586 zgodnie z HXB2)
      
      Env-R: 5'- AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3' (nt 7785←7811)
   3. Uruchom reakcję RT w temperaturze 50°C na 30 minut.
   4. Uruchom pierwszy PCR w następujący sposób:
      
      95°C, 15min 1 x 95°C, 30 sek
      50°C, 30 sek
      72°C, 2 min 1 x 95°C, 30 sek
      56°C, 30 sek
      72°C, 2 min 38 razy 72°C, 10 min
      4°C ∞  
2. Próbki DNA: reakcja PCR
   
   W przypadku próbek DNA prowirusa nie jest wymagana wstępna reakcja RT, a reakcja PCR może rozpocząć się bezpośrednio.
   1. Dodać 40 μl PCR Master Mix do 10 μl provial DNA.
      
      
      Master Mix do PCR w systemie wewnętrznym:
        Objętość/reakcja (μl) Stężenie końcowe Nie zawiera RNaz H₂O Rozdział 15,4   5x Bufor (Polimeraza DNA HotStarTaq) 10 1x 5x Rozwiązanie Q 10 1x Miks dNTP (10 mM każdy) cyfra arabska 400 μM każdego dNTP Enzym-Mix (polimeraza DNA HotStarTaq) cyfra arabska   Podkład Env-F (100 μM) 0,3 0,6 μM Podkład Env-R (100 μM) 0,3 0,6 μM
      
      Env-F: 5'- CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3' (NT 6556→6586)
      
      Env-R: 5'- AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3' (nt 7785←7811)
   2. Uruchom warunki PCR zgodnie z wcześniejszym opisem dla próbek RNA (krok 3.1.4).

4. Amplifikacja regionu V3: zagnieżdżony PCR

1. W przypadku zagnieżdżonej reakcji PCR należy użyć 5 μl z pierwszej reakcji PCR (bez wcześniejszej analizy w żelu agarozowym) jako matrycę i dodać 95 μl PCR Master Mix.
   
   Master Mix do zagnieżdżonego wewnętrznego PCR   Objętość/reakcja (μl) Stężenie końcowe H₂O 61,9 pkt.   10x bufor PCR 10 1x 5x Rozwiązanie Q 20 1x Miks dNTP (10 mM każdy) cyfra arabska 200 μM każdego dNTP Grunt Env-2F (100 μM) 0,3 0,6 μM Podkład Env-2R (100 μM) 0,3 0,6 μM Polimeraza DNA HotStarTaq 0,5 2,5 jednostki/reakcję
   
   Env-2F: 5'- GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3' (nt 6838→6864)
   
   Env-2R: 5'- CACCACTCTTCTCTGCCTTGGTGGGTGC -3' (nt 7712←7742)
2. Uruchom PCR w następujący sposób:
   93°C, 15min 1 x 95°C, 30 sek
   50°C, 30 sek
   72°C, 90 sekund 1 x 95°C, 30 sek
   56°C, 30 sek
   72°C, 90 sekund 43 razy 72°C, 10 min
   4°C ∞  
3. Przeanalizować produkt PCR na 1% żelu agarozowym (ryc. 4). Oczekiwany produkt ma długość 902 punktów bazowych.
4. Oczyszczanie próbek sekwencjonowanych.
   1. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu Qiagen PCR-Purification, korzystając z protokołu, roztworów i mikrokolumn dostarczonych przez dostawcę. Eluować w buforze PE o pojemności 30-100 μl, w zależności od intensywności pasma.
   2. Alternatywnie próbki można oczyścić za pomocą egzonukleazy I i szybkiej AP (fosfatazy termoalkalicznej). W tym celu dodać 6 μl Exo-AP Mix do 15 μl produktu PCR i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37°C. 580 μl H₂O Szybki punkt dostępowy 66 μl 13,4 μl Exo I

5. Reakcja sekwencyjna amplikonu V3

1. Reakcja sekwencyjna składa się z reakcji PCR z użyciem tylko jednego z następujących starterów:
   
   Env-2: 5'- GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959→6980)
   Env-5: 5'- AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3' (nt 7352←7371)
   Env-6: 5'- GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3' (NT 6979→7000)
   Env-7: 5'- TGTCCACTGATGGGAGGC - 3' (NT 7530←7549)
   Env-10: 5' - GCAGAATAAAACAAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478←7507)
   Env-11: 5' - TACATTGCTTTTCCTCTCTCTGCCAC - 3' (NT 7638←7664)
   Startery pierwszego wyboru to: Env-2, Env-6 lub Env-7, Env-11
2. Użyć 1 μl z oczyszczonego amplikonu V3 jako matrycy i dodać 9 μl master-mixu PCR.
   
   Mistrzowska mieszanka sekwencjonowania: Mieszanka sekwencji 4 μl (zestaw do genotypowania HIV) 4 μl H₂O 1 μl Podkład (100 pmol/μl)
3. Uruchom reakcję sekwencyjną w następujący sposób: 96°C, 10 sekund   50°C, 10 sekund 36 razy 60°C, 45 sekund   4°C ∞  

6. Oczyszczanie próbek sekwencjonowania

Oczyszczaj sekwencje za pomocą Sephadex G-50 superfine.

1. Napełnij odpowiednią liczbę studzienek w "ładowarce kolumnowej" za pomocą Sephadex G-50 superfine. Przenieś Sephadex na płytę filtracyjną MAHVN4510, obracając go.
2. Dodać 300 μl Milli-Q_{H 2}O do każdej studzienki na płytce filtracyjnej i inkubować przez co najmniej 3 godziny w temperaturze 2-8°C.
3. Odwirować płytki przez 5 minut w temperaturze 910Xg i temperaturze 4-15°C. Wyrzucić przepływ.
4. Dodać 10 μl_H2O do produktu sekwencji, a następnie pipetować sekwencję na spęczniałą płytkę Sephadexu.
5. Aby uzyskać oczyszczony produkt, należy odwirować płytkę przez 5 minut w temperaturze 910Xg i temperaturze 4-15°C i zebrać przepływ.

7. Sekwencjonowanie oczyszczonych próbek na sekwenatorze ABI Prism 3130 XL

1. Przed każdym uruchomieniem należy zmienić bufor i sprawdzić objętość polimeru (POP7). W razie potrzeby wymień starą kolbę polimerową na nową.
2. Korzystaj z zapisanych warunków pracy, w tym czasu wtrysku wynoszącego 18 sekund.
3. W tej maszynie zebranie danych sygnałowych z jednego przebiegu z 16 próbkami sekwencji trwa około 60 minut (kapilara 36 cm) lub 150 minut (kapilara 50 cm).

8. Edycja sekwencji

1. Użyj programu Lasergene (DNA-Star), aby wyrównać i edytować sekwencje (rys. 5). Można użyć innych programów do edycji sekwencji. Użyj "V3-Consensus B" i sekwencji konsensusu env jako odniesień.
2. Lasergene tworzy sekwencję konsensusu analizowanej próbki przy użyciu wszystkich dostępnych surowych danych i przechowuje ją jako plik FAPSA. Plik FASTA to plik tekstowy, który zawiera nagłówek z nazwą próbki i sekwencją nukleotydów.

9. Sekwencjonowanie, interpretacja danych i przewidywanie tropizmu

1. Interpretacja danych sekwencjonowania jest wykonywana przez internetowy system interpretacji geno2pheno_[koreceptor] (http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php). Do przewidywania tropizmu można wybrać różne ustawienia FPR. Ustawienie domyślne jest zgodne z niemiecko-austriackimi wytycznymi terapeutycznymi. W przypadku FPR ≥ 20% wirus jest klasyfikowany jako R5, gdy FPR ≥ 20%, a X4 dla FPR < 12,5%.
2. Prześlij plik FASTA na serwer. Ten serwer tłumaczy sekwencję nukleotydów na aminokwasy, dopasowuje ją do sekwencji V3-Consensus B i tworzy klasyfikację podtypów. Ponadto generuje prognozę użycia koreceptorów (ryc. 4) wyrażoną jako odsetek wyników fałszywie dodatnich (FPR).

10. Reprezentatywne wyniki

Dane wyjściowe geno2pheno_[coreceptor] pokazują stopniowaną interpretację tropizmu. W zależności od prawdopodobieństwa użycia koreceptora, tekst interpretacyjny i kolor tła wahają się od zielonego (<20% FPR), sugerującego bezpieczne podawanie MVC, do żółtego, sugerującego możliwe, niskie ryzyko, a na końcu do czerwonego. Czerwony jest kolorem sugerującym, aby nie przepisywać MVC. Dodatkowo serwer generuje raport w formacie pdf, który można wydrukować, wypełnić danymi pacjenta i próbki oraz wysłać do lekarza. Przykłady wyjścia geno2feno_{[koreceptora]} przedstawiono na ryc. 6.

rysunek. 1. Schematyczna replikacja wirusa HIV. Wirion musi związać się z komórkowym CD4 jako receptorem oraz z CCR5 lub CXCR4 jako koreceptorem. Koreceptor CCR5 może być blokowany przez antagonistów CCR5, takich jak Marawirok (MVC, Celsentri, Selzentry). Po zespoleniu błon wirusowych i komórkowych nukleokapsyd wirusowy jest uwalniany w cytoplazmie. Nukleokapsyd rozpada się, a kompleks wirusowego RNA jest uwalniany do cytoplazmy. Wirusowa odwrotna transkryptaza (RT) transkrybuje genomowy RNA do prowirusowego DNA, który jest następnie transportowany do jądra i integrowany z genomem gospodarza przez integrazę HIV. Komórkowe polimerazy RNA transkrybują wirusowe, genomowe i informacyjne RNA z genomu prowirusowego. Białka wirusowe są wytwarzane w cytoplazmie i transportowane na powierzchnię komórki. Cząsteczki wirusa pączkują w komórkach jako niedojrzałe, niezakaźne wiriony. Proteaza HIV rozszczepia białka wytwarzające cząsteczki zakaźne. Zahamowanie jednego z etapów prowadzi do przerwania cyklu replikacji.

Leki przeciwretrowirusowe i etap replikacji, który hamują, są zaznaczone na czerwono.

Wirusowe RNA i prowirusowe DNA (materiał używany do analizy tropizmu lub oporności) są oznaczone na zielono.

Rysunek 2. Genom wirusa HIV. Cząsteczka HIV jest zbudowana z różnych białek strukturalnych i zawiera różne enzymy i białka, zarówno pochodzenia wirusowego, jak i komórkowego. Rysunek przedstawia lokalizację genów w genomie wirusa. Białka powierzchniowe gp120 i gp41 stanowią kolce na powierzchni wirionu i kontaktują się z komórką ludzką w celu przeprowadzenia fuzji błonowej. W dolnej części rysunku pokazano produkty amplifikacji PCR oraz startery użyte w naszym protokole.

Rysunek 3. Odsetek pacjentów z pomiarami niskiego miana wirusa (VL) analizowanymi pod kątem określenia lekooporności lub tropizmu w Instytucie Wirusologii Uniwersytetu w Kolonii (Niemcy).

Rysunek 4. Ogólny schemat eksperymentu. Proszę kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Edycja sekwencji za pomocą Lasergene. Amplikon V3 jest sekwencjonowany z co najmniej jednym starterem do przodu i jednym do tyłu. Lasergene wyrównuje pliki ".abi" uzyskane z sekwencera z sekwencjami referencyjnymi "V3-Consensus B" i env. Lasergene tworzy sekwencję konsensusu przy użyciu wszystkich dostępnych danych wierszy. Sekwencje referencyjne mogą być oznaczone (a następnie wyświetlane w kolorze szarym), tak aby nie przyczyniały się do sekwencji konsensusu próbki.

Rysunek 6. Raporty predykcyjne tropizmu generowane przez narzędzie geno2pheno_{[coreceptor].} Raporty są generowane jako pliki pdf, które można zapisać i uzupełnić na komputerze. Dodatkowe dane, takie jak imię i nazwisko pacjenta, data pobrania krwi itp., można wprowadzić ręcznie za pomocą programu do zapisywania plików PDF. Można również dodać konkretne komentarze. Dane te znajdują się wyłącznie na komputerze użytkownika, a nie na serwerze geno2pheno_{[coreceptor].} Proszę kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Sekwencja V3 pozwala na wiarygodne przewidywanie tropizmu wirusowego, jak wykazano w badaniach klinicznych^3-9. W rzeczywistości określenie genotypu jest rozważane w aktualnych wytycznych europejskich i niemiecko-austriackich¹⁰.

W porównaniu z badaniami fenotypowymi krótszy jest nie tylko czas obrotu (odpowiednik badania odpornościowego), ale także koszty. Ponadto główną zaletą badań genotypowych jest to, że wyniki są klasyfikowane jako FPR, a zatem mogą być dostosowane do potrzeb pacjentów. Z drugiej strony wyniki Trofile to po prostu raporty R5 lub X4, a dostęp do surowych danych nie jest udzielany.

Obecnie wytyczne europejskie sugerują wartość graniczną FPR na poziomie 20%¹⁰, podczas gdy wytyczne austriacko-niemieckie pozwalają na dostosowanie wartości odcięcia FPR specjalnie do potrzeb każdego pacjenta¹¹. W tej linii, dla pacjentów z szeroką gamą leków przeciwretrowirusowych, zaleca się wyższe wartości odcięcia FPR (> 20%). I odwrotnie, w przypadku pacjentów intensywnie leczonych z ograniczonymi opcjami terapeutycznymi można zastosować niższe wartości odcięcia FPR (> 5%). Tego rodzaju wytyczne terapeutyczne są obecnie kontynuowane przez testy oporności na NRTI, NNRTI, PI i INI, w których leki częściowo aktywne mogą być włączone do leczenia pacjentów z ograniczonymi opcjami terapeutycznymi. Ponadto, wraz z rosnącą liczbą zmian w terapii kierowanych genotypowo, klinicznie istotne punkty odcięcia FPR są stale dostosowywane przez panel bioinformatyków, wirusologów i klinicystów.

Kolejną ważną zaletą badania tropizmu genotypowego jest możliwość analizy próbek klinicznych o bardzo niskim lub nawet niewykrywalnym mianie wirusa (VL). W tych przypadkach, gdy RNA osocza nie jest amplifikowalny, prowirusowe DNA można zsekwencjonować i wykorzystać do wiarygodnych prognoz^9,12. Warto zauważyć, że liczba pacjentów z niską lub niewykrywalną wiremią gwałtownie wzrosła w ostatnich latach. Do tej pory test Trofile pozwala tylko na analizę próbek od pacjentów z VL<1000 kopii/ml. Jednak wstępne badania wykazały, że prowirusowe DNA może być również odpowiednie do badania za pomocą Trofile¹³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MagNA Pure Compact Zestaw do izolacji kwasów nukleinowych I	Grupa Roche	04 802 993 001
MagNA Pure Compact System	Roche Group	03731146001
T3000 Termocykler	Biometra	050-723
Jednoetapowy zestaw RT-PCR	Qiagen	210215
Zestaw HotStarTaq Master Mix	Qiagen	203445
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	28106
Egzonukleaza I (Exo I)	Fermentas	EN0582
FastAP Termoczuła fosfataza alkaliczna	Fermentas	EF0651
BigDye Terminator v3.1 Zestaw do sekwencjonowania cyklu	Applied Biosystems	4337457
Sephadex G-50 Superfine	GE Healthcare	17-0041-01
ABI Prism 3130 XL sekwencer kapilarny	Applied Biosystems	3130XL