Artykuł metodologiczny

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

18.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3273

⸱

28 października 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1San Diego Regenerative Medicine Institute, 2Xcelthera, 3Department of Neurosurgery, Harvard Medical School, 4Division of SCI Research, VA Boston Healthcare System, 5Program in Stem Cell & Regenerative Biology, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6La Jolla IVF

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Streszczenie

W dzisiejszej opiece zdrowotnej istnieje ogromne niezaspokojone zapotrzebowanie na klinicznie odpowiednie źródło ludzkich komórek neuronalnych do naprawy lub regeneracji uszkodzonych struktur i obwodów ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Terapie komórkowe dają wielkie nadzieje na przywrócenie utraconej tkanki i funkcji nerwowej w zaburzeniach OUN. Jednak terapie komórkowe oparte na pochodzących z OUN neuralnych komórkach macierzystych napotkały ograniczenia w dostawach oraz trudności w zastosowaniu w warunkach klinicznych ze względu na ich ograniczoną zdolność do ekspansji w kulturze oraz utratę plastyczności po licznych pasażach1-3. Mimo niektórych korzystnych wyników, pochodzące z OUN ludzkie neuralne komórki macierzyste (hNSC) wydają się wywierać swój efekt terapeutyczny przede wszystkim poprzez swoje progenitory nie-neuronalne, produkując cząsteczki troficzne i neuroprotekcyjne w celu ratowania endogennych komórek1-3. Alternatywnie, pluripotencjalne ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) oferują możliwości leczenia szerokiej gamy zaburzeń neurologicznych poprzez dostarczanie różnorodnych typów ludzkich komórek neuronalnych w rozwijającym się OUN w celu regeneracji1,4-7. Jednakże to, jak efektywnie i przewidywalnie skierować szeroki potencjał różnicowania pluripotencjalnych hESC w stronę pożądanego fenotypu, stanowiło główne wyzwanie zarówno dla badań rozwojowych, jak i translacji klinicznej. Konwencjonalne podejścia opierają się na inklinacji pluripotencjalnych komórek w kierunku wielu linii poprzez spontaniczne różnicowanie warstw zarodkowych, co prowadzi do nieefektywnego i niekontrolowanego determinowania linii, któremu często towarzyszy heterogeniczność i niestabilność fenotypowa, a w konsekwencji wysokie ryzyko tumorigeniczności7-10. Ponadto, niezdefiniowane obce/zwierzęce suplementy biologiczne i/lub komórki karmące, które zazwyczaj stosowano do izolacji, ekspansji i różnicowania hESC, mogą sprawić, że bezpośrednie zastosowanie takich wyspecjalizowanych przeszczepów komórkowych u pacjentów będzie problematyczne11-13. Aby przezwyciężyć te przeszkody, opracowaliśmy elementy zdefiniowanego systemu hodowli, które są niezbędne i wystarczające do utrzymania pluripotencji epiblastycznej hESC, służąc jako platforma do wyprowadzenia de novo klinicznie odpowiednich hESC oraz efektywnego, jednorodnego kierowania tych hESC w stronę klinicznie istotnych linii za pomocą małych cząsteczek14 (patrz schemat na Rys. 1). Kwas retinowy (RA) nie indukuje różnicowania neuronalnego niezróżnicowanych hESC utrzymywanych na komórkach karmiących1, 14. a w przeciwieństwie do mysich ESC, traktowanie zróżnicowanych ciał embrionalnych (EB) z hESC zwiększa niską wydajność uzyskiwania neuronów tylko nieznacznie1, 14, 15. Jednak po przesiewaniu różnych małych cząsteczek i czynników wzrostu odkryliśmy, że takie zdefiniowane warunki sprawiają, iż kwas retinowy (RA) jest wystarczający do indukcji specyfikacji neuroektodermy bezpośrednio z pluripotencjalnych hESC, które następnie przekształcają się w neuroblasty generujące ludzkie progenitory neuronalne i neurony w rozwijającym się OUN z wysoką wydajnością (Rys. 2). Zdefiniowaliśmy warunki indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych hESC bez pośredniego etapu wieloliniowych ciał embrionalnych, co umożliwia dobrze kontrolowane i wydajne uzyskiwanie dużej ilości ludzkich komórek neuronalnych na różnych etapach rozwoju dla zastosowań w terapiach komórkowych.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów i pożywek

  1. Roztwór do powlekania żelatyną: 0,1% (w/v) żelatyny w ddH2O, autoklawowany i przechowywany w temperaturze 4°C.
  2. Roztwory do powlekania Matrigel. Roztwór zapasowy: powolne rozmrażanie Matrigelu (10 ml) w 4°C przez noc, dodanie 10 ml lodowatego DMEM lub DMEM/F12, dokładne wymieszanie i rozdzielenie na aliquoty po 1 ml/probówkę pod sterylnym dygestorium do hodowli tkankowych, przechowywanie w -20°C. Roztwór roboczy: powolne rozmrażanie aliquoty 1 ml Matrigelu w 4°C przez 1-2 godziny, przeniesienie do 14 ml schłodzonego DMEM lub DMEM/F12 i dokładne wymieszanie pod sterylnym dygestorium do hodowli tkankowych bezpośrednio przed powlekaniem.
  3. Roztwór do powlekania ludzką lamininą: rozcieńczenie 1 ml roztworu ludzkiej lamininy (0,5 mg/ml w buforze Tris-NaCl, przechowywać w -80°C, powoli rozmrażać w 4°C przez 1-2 godziny) lodowatym DMEM lub DMEM/F12 do 12,5 ml roztworu roboczego (40 μg/ml) pod sterylnym dygestorium do hodowli tkankowych bezpośrednio przed powlekaniem.
  4. Roztwory zapasowe czynników wzrostu (50-10X): rozpuszczenie czynnika wzrostu w stężeniu 10 μg/ml w sterylnym buforze (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerolu, 1XPBS) i przechowywanie w aliquotach 50-10 μl/probówkę w -80°C.
  5. Roztwór roboczy kwasu all-trans-retinowego (10X): 10 mM w DMSO, przechowywać w aliquotach w -80°C.
  6. Pożywka do HESC: DMEM/F12 lub KO-DMEM (80%), zamiennik surowicy KO (20%), L-alanylo-L-glutamina lub L-glutamina (2 mM), nieessentialne aminokwasy MEM (MNAA, 1X) oraz β-merkaptoetanol (10 μM), przefiltrowana i przechowywana w 4°C, uzupełniona o 20 ng/ml bFGF przed użyciem. Alternatywnie, zastąpienie „zamiennika surowicy knock out (KO)” określonymi składnikami: DMEM/F12 lub KO-DMEM (10%), L-alanylo-L-glutamina lub L-glutamina (2 mM), MNAA (1X), essentialne aminokwasy MEM (MEAA, 1X) oraz β-merkaptoetanol (100 μM), przefiltrowana i przechowywana w 4°C, uzupełniona przed użyciem o bFGF (20 ng/ml), ludzką insulinę (20 μg/ml), kwas askorbinowy (50 μg/ml), ludzką aktywinę A (50 ng/ml), ludzką albuminę/Albumax (10 mg/ml) oraz ludzką transferrynę (8 μg/ml).
  7. Pożywka do NSC: DMEM/F12 (10%), suplement N-2 (1X), heparyna (8 μg/ml).

2. Powlekanie płytek

  1. Pokrycie płytek żelatyną: dodać 2,5 ml/dołek roztworu żelatyny do płytek 6-dołkowych i inkubować przez noc w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C.
  2. Pokrycie płytek lamininą: schłodzić płytki pokryte żelatyną i usunąć żelatynę, następnie dodać 2,5 ml/dołek roztworu roboczego Matrigel lub ludzkiej lamininy do schłodzonych wcześniej żelatynizowanych płytek 6-dołkowych i inkubować w temperaturze 4°C przez noc.

3. Pasażowanie i wysiewanie niezróżnicowanych hESC w warunkach zdefiniowanych

  1. Pozostaw kolonie hESC do czasu osiągnięcia wieku 5-7 dni, a następnie przenieś płytkę z hodowlą hESC pod mikroskop dissectingowy (wcześniej podgrzej stolik mikroskopowy do 37°C) wewnątrz sterylnego dygestorium.
  2. Wybierz kolonie hESC do pasażowania. Pod względem morfologicznym kolonie te powinny zawierać > 75% niezróżnicowanych hESC (małe, zwarte komórki), zazwyczaj lekko mętne (nie białe skupiska komórek, nie przezroczyste komórki zróżnicowane) z wyraźną krawędzią widoczną pod mikroskopem dissectingowym. Ostrożnie obrysuj wybrane kolonie i usuń otaczającą je warstwę zróżnicowanych fibroblastów oraz wszystkie zróżnicowane części kolonii (jeśli występują), używając krawędzi sterylnego końcówki pipety P2 lub wyciągniętej kapilary szklanej. (Należy pamiętać, że pluripotencjalne hESC znajdują się w stadium przejściowym i ulegają spontanicznej różnicowaniu nawet w optymalnych warunkach; choć jest to preferowane, trudno stwierdzić pod mikroskopem dissectingowym, czy komórki te są w 100% niezróżnicowane; zazwyczaj za punkt dopuszczający pasażowanie uznaje się >75% niezróżnicowanych komórek. Komórki zróżnicowane zazwyczaj nie przytwierdzą się do podłoża i nie będą dalej rosnąć, zostając wyeliminowane w procesie pasażowania).
  3. Usuń starą pożywkę zawierającą pływające, oderwane komórki zróżnicowane poprzez aspirację. Przepłucz raz pożywką hESC (bez bFGF). Dodaj 3 ml/studzienkę świeżej pożywki hESC zawierającej 20 ng/ml bFGF.
  4. Podziel niezróżnicowane kolonie hESC na małe fragmenty i oddziel je za pomocą sterylnej końcówki pipety lub wyciągniętej kapilary szklanej.
  5. Zebierz pożywkę zawierającą oderwane fragmenty kolonii do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłucz płytkę raz za pomocą 1 ml/studzienkę pożywki hESC zawierającej 20 ng/ml bFGF i dodaj do wspólnej puli.
  6. Odsuń aspirat z roztworu Matrigelu lub ludzkiej lamininy z nowo powlekanych płytek. Rozdziel po 4 ml/studzienkę pożywki hESC z fragmentami kolonii do płytki 6-dołkowej. Ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora, nie potrząsając nią, i pozostaw fragmenty kolonii do przytwierdzenia przez noc, niepokojąc ich, w wilgotnym inkubatorze przy 37°C w atmosferze 5% CO2.

4. Indukcja neuronalna hESC w zdefiniowanym systemie hodowli z zastosowaniem kwasu retinowego

  1. W 3. dniu po wysiewaniu usunąć większość starej pożywki z każdej studni płytki, pozostawiając ilość wystarczającą do zanurzenia kolonii hESC (nigdy nie dopuszczać do wyschnięcia hESC). Zastąpić ją 4 ml/studnię świeżym medium dla hESC zawierającym 20 ng/ml bFGF oraz 10 μM kwasu retinowego.
  2. Wymieniać starą pożywkę na świeże medium dla hESC zawierające 20 ng/ml bFGF i 10 μM kwasu retinowego co drugi dzień i pozwolić koloniom hESC indukowanym w kierunku neuronalnym rosnąć do 7. lub 8. dnia. Wszystkie komórki w obrębie kolonii ulegną zmianom morfologicznym, przekształcając się w duże zróżnicowane komórki, które będą nadal mnożyć się. Kolonie zwiększą swój rozmiar, pokrywając płytkę do 7. lub 8. dnia, a w niektórych obszarach kolonii komórki zaczną się piętrzyć.

5. Kontynuacja różnicowania neuronalnego w hodowli zawiesinowej

  1. Przenieś płytkę z hodowlą hESC pod sterylną komorę laminarnej do mikroskopu sekcyjnego (wcześniej podgrzej stolik sekcyjny do 37°C). Ostrożnie obrysuj kolonie i usuń warstwę fibroblastów otaczającą kolonię (zróżnicowane komórki, które wywędrowały z kolonii) za pomocą krawędzi sterylnej końcówki pipety P2 lub wyciągniętej kapilary szklanej.
  2. Usuń starą pożywkę zawierającą pływające, oderwane komórki fibroblastów poprzez aspirację. Przepłucz raz pożywką hESC (bez bFGF). Dodaj 3 ml/studzienkę świeżej pożywki hESC (bez bFGF).
  3. Podziel indukowane do linii neuronalnej kolonie hESC na małe fragmenty i oderwij je za pomocą sterylnej końcówki pipety lub wyciągniętej kapilary szklanej.
  4. Złącz pożywkę zawierającą oderwane fragmenty kolonii w probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłucz płytkę raz za pomocą 1 ml/studzienkę pożywki hESC (bez bFGF) i połącz z resztą materiału.
  5. Przenieś aliquoty po 4 ml/studzienkę bezzsrytkowej pożywki hESC zawierającej fragmenty kolonii na płytkę 6-dołkową o ultra-niskiej adhezji (ultralow attachment) i inkubuj w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C przez 4-5 dni, aby umożliwić formowanie się pływających skupisk komórkowych (neuroblastów).

6. Dojrzewanie fenotypu neuronalnego w hodowli adhezyjnej

  1. Połączyć pożywki zawierające pływające neuroblasty w probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Wirować przy 1400 rpm przez 5 min. Odessać jak największą ilość starej pożywki i dodać taką samą objętość świeżej pożywki NSC zawierającej VEGF (20 ng/ml), NT-3 (10 ng/ml) oraz BDNF (10 ng/ml).
  2. Wymieszać pływające neuroblasty poprzez wielokrotne pipetowanie i rozdzielić do płytek 6-dołkowych w ilości 4 ml/dołek. Neuroblasty można również wysiać w polimeryzowanej trójwymiarowej macierzy lamininy/kolagenu (Matrigel) lub ludzkiej lamininy w bezserwatkowej pożywce NSC zawierającej VEGF (20 ng/ml), NT-3 (10 ng/ml) oraz BDNF (10 ng/ml). Przenieść płytki do inkubatora z nawilżaniem w temperaturze 37°C, aby umożliwić neuroblastom przytwierdzenie się przez noc.
  3. Wymieniać pożywkę NSC zawierającą VEGF (20 ng/ml), NT-3 (10 ng/ml) oraz BDNF (10 ng/ml) co drugi dzień. Rozległe sieci komórek neuronalnych z wypustkami oraz komórek pigmentowanych zaczną pojawiać się w ciągu 2 tygodni ciągłej hodowli, a ich liczba będzie z czasem rosła; hodowla może być utrzymywana przez ponad 3 miesiące.

7. Reprezentatywne wyniki:

Kwas retinowy (RA) jest wystarczający, aby indukować przejście hESC utrzymywanych w zdefiniowanym systemie hodowlanym ze stanu pluripotencji wyłącznie w stronę fenotypu neuroektodermalnego (Ryc. 2A). Po wystawieniu niezróżnicowanych hESC na działanie RA, wszystkie komórki w kolonii przejdą zmiany morfologiczne w duże komórki zróżnicowane, które przestaną wyrażać markery związane z pluripotencją, takie jak Oct-4, i zaczną wyrażać różne markery związane z neuroektodermą, m.in. HNK1, AP2 i TrkC (Ryc. 2B). Te duże zróżnicowane komórki będą nadal się namnażać, a kolonie będą zwiększać swoje rozmiary, spontanicznie przechodząc do ekspresji wczesnego markera neuronalnego β-III-tubuliny (Ryc. 2B). Bardziej dojrzały marker neuronalny Map-2 zacznie pojawiać się w obszarach kolonii, w których komórki uległy zagęszczeniu (Ryc. 2B). Równocześnie z pojawieniem się komórek neuroektodermalnych i różnicowaniem neuronalnym, czynnik transkrypcyjny specyficzny dla neuronów Nurr1, zaangażowany w różnicowanie neuronów dopaminergicznych i aktywację genu hydroksylazy tyrozynowej (TH)16, przemieści się do jądra komórkowego (Ryc. 2B). Po odłączeniu hESC traktowane RA utworzą pływające skupiska komórkowe (neuroblasty) w hodowli zawiesinowej, aby kontynuować proces różnicowania neuronalnego. Po usunięciu bFGF i umożliwieniu neuroblastom przyczepienia się do płytki do hodowli tkanek lub po ich wysianiu w polimeryzowanej trójwymiarowej macierzy lamininy/kolagenu w zdefiniowanym medium beznadserkowym, zaczną pojawiać się komórki z wypustkami neurytowymi oraz komórki pigmentowe wykazujące ekspresję β-III-tubuliny i Map-2; nastąpi przy tym gwałtowny wzrost wydajności w porównaniu do spontanicznego różnicowania wieloliniowego hESC bez traktowania w tym samym okresie czasu, a proces ten mógł być utrzymywany przez ponad 3 miesiące (Ryc. 2C).

Schemat różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych komórek ES do komórek neuronalnych poprzez stadia neuroektodermalne.
Rysunek 1 Schemat dobrze kontrolowanej, efektywnej indukcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych wyłącznie w kierunku konkretnej, istotnej klinicznie linii komórkowej poprzez proste zastosowanie małych cząsteczek.

Schemat indukcji neuronalnej; oś czasu różnicowania hESC z obrazami z mikroskopii; β-III-tubulina, Map-2.
Rycina 2 Kwas retinowy indukuje specyfikację linii neuronalnej i progresję neuronalną bezpośrednio z pluripotencji w określonych warunkach. (A) Schemat przedstawiający oś czasu protokołu ukierunkowanej dyferencjacji hESC w neurony. (B) Po wystawieniu nieróżnicowanych hESC na działanie kwasu retinowego (RA) w określonym systemie hodowlanym, wewnątrz kolonii zaczęły pojawiać się duże, zróżnicowane komórki Oct-4 (czerwone) ujemne, w porównaniu z hESC poddanymi kontrolnej obróbce (DMSO). Zróżnicowane komórki Oct-4-ujemne indukowane przez RA zaczęły wykaziwać ekspresję HNK-1 (czerwony), AP2 (czerwony), TrkC (zielony), a następnie β-III-tubuliny (czerwony), co jest zgodne z wczesną różnicowaniem w kierunku neuroektodermy. Komórki te nadal dojrzewały, ostatecznie wykazując ekspresję markera neuronalnego Map-2 (zielony), zazwyczaj w obszarach, w których zaczęły się one spiętrzać. Równocześnie z pojawieniem się komórek neuroektodermalnych i różnicowaniem neuronalnym, czynnik transkrypcyjny specyficzny dla neuronów Nurr1 (zielony), zaangażowany w różnicowanie neuronów dopaminergicznych i aktywację genu hydroksylazy tyrozynowej (TH), przemieścił się do jądra. Wszystkie komórki są widoczne dzięki barwieniu ich jąder DAPI (niebieski). (C) Traktowanie kwasem retinowym (RA) indukuje różnicowanie w kierunku linii neuronalnej z wysoką wydajnością, co potwierdzają rozległe sieci komórek z wypustkami neurytowymi wykazujących ekspresję β-III-tubuliny (czerwony) i Map-2 (zielony, pokazany w macierzy trójwymiarowej). Strzałki wskazują komórki pigmentowane, typowe dla komórek OUN. Wszystkie komórki są widoczne dzięki barwieniu jąder DAPI (niebieski) na wstawkach. Paski skali: 0,1 mm.

Dyskusja

Jednym z głównych wyzwań zarówno dla badań rozwojowych, jak i translacji klinicznej było znalezienie sposobu na efektywne i przewidywalne skierowanie szerokiego potencjału różnicowania pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych w stronę pożądanego fenotypu. Chociaż komórki te mogą różnicować się spontanicznie in vitro w komórki wszystkich trzech listków zarodkowych, przechodząc przez etap agregatu wieloliniowego, tylko niewielka frakcja komórek przyjmuje określoną linię1,4. W tych agregatach pochodzących z hESC jednoczesne pojawienie się znacznej ilości szeroko zróżnicowanych, niepożądanych typów komórek, które mogą należeć do trzech listków zarodkowych, sprawia, że wyłanianie się pożądanych fenotypów jest często nie tylko nieefektywne, ale także niekontrolowane i niewiarygodne. Mimo że w poprzednich doniesieniach uzyskano linie kardiologiczne i neuronalne, niska wydajność generowania wyspecjalizowanych komórek poprzez indukcję listków zarodkowych z komórek pluripotencjalnych oraz wysokie ryzyko tumorigeniczności po transplantacji utrudniły dalszą translację kliniczną.

Linie hESC zostały początkowo wyizolowane i utrzymywane w kokulturze z fibroblastami zarodkowymi myszy (MEFs) o zahamowanym wzroście4. Choć dla hESC opracowano kilka systemów hodowli z ludzkimi komórkami wspierającymi (feeder), systemów bezkomórkowych oraz systemów o zdefiniowanym składzie chemicznym11-13, elementy niezbędne i wystarczające do podtrzymania samoodnowy ludzkich komórek pluripotencjalnych pozostają nieznane. Te egzogenne komórki wspierające oraz odczynniki biologiczne pomagają utrzymać długoterminowy stabilny wzrost niezróżnicowanych hESC, jednocześnie maskując zdolność komórek pluripotencjalnych do reagowania na sygnały rozwojowe. Utrzymanie niezróżnicowanych hESC w zdefiniowanym systemie hodowli wolnym od substancji biologicznych, który pozwala na wierną ekspansję i kontrolowane bezpośrednie różnicowanie, jest jednym z kluczy do ich użyteczności i potencjału terapeutycznego. RA nie było wystarczające do indukowania różnicowania neuronalnego niezróżnicowanych hESC utrzymywanych w wcześniej opisanych warunkach zawierających egzogenne komórki wspierające. Choć linie neuronalne pojawiają się na stosunkowo wczesnym etapie różnicowania hESC, traktowanie zróżnicowanych wieloliniowo agregatów hESC (ciał zarodkowych) za pomocą RA jedynie nieznacznie zwiększyło niską wydajność uzyskiwania neuronów1, 14, 15. Aby osiągnąć jednolitą konwersję ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w konkretną linię, zastosowaliśmy zdefiniowany system hodowli zdolny do zapewnienia proliferacji niezróżnicowanych hESC, aby zidentyfikować warunki dobrze kontrolowanej i wydajnej indukcji pluripotencjalnych hESC wyłącznie w konkretną linię istotną klinicznie poprzez proste podanie małych cząsteczek (Fig. 1, Fig. 2). Przyszłe badania ujawnią cząsteczki kontroli genetycznej i epigenetycznej w rozwoju ludzkiego OUN jako alternatywy, co może utorować drogę do bezpośredniej kontroli i modulacji losu pluripotencjalnego hESC za pomocą małych cząsteczek podczas wywodzenia linii istotnych klinicznie dla terapii regeneracyjnych. Bez traktowania RA, 1-5% hESC ulegnie spontanicznemu różnicowaniu w neurony1, 14, 15. Dzięki traktowaniu RA byliśmy w stanie wygenerować > 95% embrionalnych progenitorów neuronalnych i neuronów z hESC utrzymywanych w zdefiniowanej hodowli w procesie, który może naśladować ludzki rozwój embrionalny14. Niedawno znane geny determinujące los neuronalny zostały wykorzystane do transróżnicowania fibroblastów mysich w dorosłe progenitory neuronalne i neurony z niską wydajnością w zakresie 0,5-8%17, 18. Jednakże przeprogramowane komórki somatyczne były historycznie wiązane z nieprawidłową ekspresją genów i przyspieszoną senescencją z upośledzoną użytecznością terapeutyczną19-21. Wreszcie, opracowany tutaj protokół jest ograniczony do pluripotencjalnych hESC wywodzących się z wewnętrznej masy komórkowej (ICM) lub epiblastu ludzkiego blastocysty4 i może nie mieć zastosowania do innych komórek pluripotencjalnych, w tym ESC pochodzenia zwierzęcego, ESC wywodzących się z wcześniejszych embrionów w stadium moruli (osiem komórek)22 oraz komórek przeprogramowanych sztucznie23.

Oświadczenia

Autorzy deklarują konflikt interesów. XHP jest założycielem firmy Xcelthera. XHP i EYS posiadają prawa własności intelektualnej związane z hESC.

Podziękowania

XHP był wspierany przez granty National Institute of Health (NIH) z National Institute on Aging (NIHK01AG024496) oraz The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ŻelatynaSigma-AldrichG1890
MatrigelBD Biosciences356231Zredukowana zawartość czynników wzrostu
Ludzka lamininaSigma-AldrichL6274
wszystkie-Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.-Kwas retinowySigma-AldrichR2625
DMEM/F12Invitrogen10565018
DMEMInvitrogen31053036
DMEM-KOInvitrogen10829018
Zamiennik surowicy Knock-outInvitrogen10828028
roztwór nieessentialnych aminokwasów MEM (MNAA, 100X)Invitrogen11140050
roztwór aminokwasów MEM (MEAA, 100X)Invitrogen11130050
β-merkapto–etanolInvitrogen21985023
AlbumaxInvitrogen11020021
Kwas askorbinowySigma-AldrichA4403
Ludzka transferynaSigma-AldrichT8158
Ludzki bFGFPeproTech IncAF-100-18B
Insulina ludzka Invitrogen12585014
Ludzka aktywina APeproTech Inc120-14E
Ludzki BDNFPeproTech IncAF-450-02
Ludzki VEGFPeproTech IncAF-100-20
Ludzki NT-3PeproTech Inc450-03
HeparynaSigma-AldrichH5284
suplement N-2 (100X)Invitrogen17502048
płytka 6-dołkowa o ultraniskim stopniu przylegania (ultra-low attachment)Corning3471
płytka 6-dołkowaCorning3516

Bibliografia

  1. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells. Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).
  2. Redmond, D. E., Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Ourednik, V., Ourednik, J., Wakeman, D. R., Parsons, X. H., Gonzalez, R., Blanchard, B. C., Kim, S. U. Behavioral improvement in a primate Parkinson's model is associated with multiple homeostatic effects of human neural stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 12175-12180 (2007).
  3. Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nature Rev. 7, 395-406 (2006).
  4. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  5. Zhang, S., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  6. Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
  7. Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy, G., Socci, N. D., Tabar, V., Studer, L. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes. Dev. 22, 152-165 (2008).
  8. Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).
  9. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nature. Medicine. 12, 1259-1268 (2006).
  10. Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).
  11. Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
  12. Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
  13. Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature. Methods. 2, 185-190 (2005).
  14. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells. Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).
  15. Schuldiner, M., Eiges, R., Eden, A., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Goldstein, R. S., Benvenisty, N. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain. Res. 913, 201-205 (2001).
  16. Perrier, A. L., Tabar, V., Barberi, T., Rubio, M. E., Bruses, J., Topf, N., Harrison, N. L., Studer, L. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  17. Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
  18. Kim, J., Efe, J. A., Zhu, S., Talantova, M., Yuan, X., Wang, S., Lipton, S. A., Zhang, K., Ding, S. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7838-7843 (2011).
  19. Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, 285-290 (2010).
  20. Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  21. Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence. Stem. Cells. 28, 704-712 (2010).
  22. Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres. Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).
  23. Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obróbka kwasem retinowymtworzenie neuroblastówhodowla w zawiesinieanaliza immunofluorescencyjnamikroskopia konfokalnazdefiniowany system hodowliróżnicowanie OUN
Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.