Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z indukcją małych cząsteczek

Podsumowanie

Ustaliliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w określonych warunkach z małymi cząsteczkami, co umożliwia uzyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych i typów komórek nerwowych w rozwijającym się OUN w celu naprawy neuronów.

Streszczenie

Istnieje duże niezaspokojone zapotrzebowanie na klinicznie odpowiednie źródło ludzkich komórek nerwowych do naprawy lub regeneracji struktury i obwodów uszkodzonego ośrodkowego układu nerwowego (CNS) w dzisiejszym przemyśle opieki zdrowotnej. Terapie komórkowe są bardzo obiecujące, jeśli chodzi o przywrócenie utraconej tkanki nerwowej i funkcji w zaburzeniach OUN. Jednak terapie komórkowe oparte na nerwowych komórkach macierzystych pochodzących z OUN napotkały ograniczenia podaży i trudności w stosowaniu w warunkach klinicznych ze względu na ich ograniczoną zdolność do ekspansji w hodowli i niezadowalającą plastyczność po rozległym pasażowaniu^1-3. Pomimo pewnych korzystnych wyników, ludzkie nerwowe komórki macierzyste (hNSC) pochodzące z OUN wydają się wywierać swoje efekty terapeutyczne głównie poprzez ich nieneuronalne potomstwo poprzez wytwarzanie cząsteczek troficznych i neuroprotekcyjnych w celu ratowania komórek endogennych^1-3. Alternatywnie, pluripotencjalne ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) oferują leki na szeroki zakres zaburzeń neurologicznych, dostarczając różnorodność typów ludzkich komórek nerwowych w rozwijającym się OUN w celu regeneracji^1,4-7. Jednak skuteczne i przewidywalne ukierunkowanie szerokiego potencjału różnicowania pluripotencjalnych hESC do pożądanego fenotypu było głównym wyzwaniem zarówno dla badań rozwojowych, jak i translacji klinicznej. Konwencjonalne podejścia opierają się na wieloliniowej inklinacji komórek pluripotencjalnych poprzez spontaniczne różnicowanie listka rozrodczego, co skutkuje nieefektywnym i niekontrolowanym zaangażowaniem w linię, po którym często następuje niejednorodność i niestabilność fenotypowa, a tym samym wysokie ryzyko rakotwórczości^7-10. Ponadto, niezdefiniowane zagraniczne/zwierzęce suplementy biologiczne i/lub karmniki, które zwykle były używane do izolacji, ekspansji i różnicowania hESC, mogą bezpośrednio wykorzystywać takie wyspecjalizowane w komórkach przeszczepy u pacjentów problematycznych^11-13. Aby przezwyciężyć te przeszkody, rozwiązaliśmy elementy zdefiniowanego systemu hodowli niezbędne i wystarczające do podtrzymania pluripotencji epiblastów hESC, służąc jako platforma do wyprowadzania de novo klinicznie odpowiednich hESC i skutecznie kierując takie hESC jednolicie w kierunku klinicznie istotnych linii przez małe cząsteczki¹⁴ (patrz schemat na ryc. 1). Kwas retinowy (RZS) nie indukuje różnicowania neuronalnego niezróżnicowanych hESC utrzymywanych na karmach^{1, 14}. W przeciwieństwie do mysich ESC, leczenie ciał embrionalnych zróżnicowanych przez hESC (EB) tylko nieznacznie zwiększa niską wydajność neuronów^{1, 14, 15}. Jednak po przeprowadzeniu badań przesiewowych różnych małych cząsteczek i czynników wzrostu stwierdziliśmy, że tak zdefiniowane warunki sprawiły, że kwas retinowy (RA) był wystarczający do wywołania specyfikacji neuroektodermy bezpośrednio z pluripotencjalnych hESC, które dalej rozwijały się do neuroblastów, które generowały ludzkie neuronalne komórki progenitorowe i neurony w rozwijającym się OUN z wysoką wydajnością (ryc. 2). Określiliśmy warunki indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych hESC bez interweniującego wieloliniowego stadium ciała zarodkowego, umożliwiając dobrze kontrolowane, wydajne wyprowadzanie dużej ilości ludzkich komórek nerwowych w całym spektrum etapów rozwoju dla terapii opartych na komórkach.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu i podłoża

1. Żelatynowy roztwór powlekający: 0,1% (w/v) żelatyna w ddH₂O, autoklawizowana i przechowywana w temperaturze 4°C.
2. Rozwiązania w zakresie powlekania Matrigel. Roztwór podstawowy: powoli rozmrażać Matrigel (10 ml) w temperaturze 4°C przez noc, dodać 10 ml lodowatego DMEM lub DMEM/F12, dobrze wymieszać i podać 1 ml/probówkę pod wysterylizowanym kapturem do hodowli tkankowych, przechowywać w temperaturze -20°C. Roztwór roboczy: powoli rozmrażać 1 ml podwielokrotności Matrigel w temperaturze 4°C przez 1-2 godziny, przenieść do 14 ml schłodzonego DMEM lub DMEM/F12 i dobrze wymieszać pod wysterylizowanym kapturem do hodowli tkanek bezpośrednio przed powlekaniem.
3. Roztwór powlekający ludzką lamininę: rozcieńczyć 1 ml roztworu ludzkiej lamininy (0,5 mg/ml w Tris Buffered NaCl, przechowywać w temperaturze -80°C, powoli rozmrażać w temperaturze 4°C przez 1-2 godziny) lodowatym DMEM lub DMEM/F12 do 12,5 ml roztworu roboczego (40 μg/ml) pod wysterylizowanym kapturem do hodowli tkanek bezpośrednio przed powlekaniem.
4. Roztwory podstawowe czynnika wzrostu (500-1000X): rozpuścić czynnik wzrostu w stężeniu 10 μg/ml w wysterylizowanym buforze (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerol, 1XPBS) i przechowywać w podwielokrotnościach 50-100 μl/probówkę w temperaturze -80°C.
5. Roztwór roboczy kwasu all-trans-retinowego (1000X): 10 mM w DMSO, przechowywać w porcjach w temperaturze -80°C.
6. Pożywki HESC: DMEM/F12 lub KO-DMEM (80%), zamiennik surowicy KO (20%), L-alanyl-L-gln lub L-gln (2 mM), aminokwasy endogenne MEM (MNAA, 1X) i β-merkaptoetanol (100 μM), przefiltrowane i przechowywane w temperaturze 4°C, uzupełnione 20 ng/ml bFGF przed użyciem. Lub zastąpienie "zamiennika surowicy nokautującej (KO)" zdefiniowanymi składnikami: DMEM/F12 lub KO-DMEM (100%), L-alanylo-L-gln lub L-gln (2 mM), MNAA (1X), aminokwasami egzogennymi MEM (MEAA, 1X) i β-merkaptoetanolem (100 μM), przefiltrowanymi i przechowywanymi w temperaturze 4°C, uzupełnionymi bFGF (20 ng/ml), insuliną ludzką (20 μg/ml), kwasem askorbinowym (50 μg/ml), ludzka aktywina A (50 ng/ml), albumina ludzka/Albumax (10 mg/ml) i ludzka transferyna (8 μg/ml) przed użyciem.
7. Pożywki NSC: DMEM/F12 (100%), suplement N-2 (1X), heparyna (8 μg/ml).

2. Powłoka płyty

1. Pokryć płytki żelatyną: dodać 2,5 ml/dołek roztworu żelatyny do 6-dołkowych płytek i inkubować przez noc w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37°C.
2. Pokryć płytki lamininą: schłodzić płytki pokryte żelatyną i usunąć żelatynę, dodać 2,5 ml/dołek Matrigel lub ludzki roztwór roboczy powlekający lamininę do wstępnie schłodzonych żelowatych 6-dołkowych płytek i inkubować w temperaturze 4°C przez noc.

3. Przekazywanie i wysiewanie niezróżnicowanych hESC w określonych warunkach

1. Pozwól koloniom hESC urosnąć do wieku 5-7 dni i zabierz płytkę hodowlaną hESC do mikroskopu preparacyjnego (wstępnie ciepły etap preparacji do 37°C) pod wysterylizowanym kapturem preparacyjnym
.
2. Wybierz kolonie hESC do podziału. Morfologicznie kolonie te powinny mieć > 75% niezróżnicowanych hESC (małych zwartych komórek), zwykle lekko nieprzezroczystych (nie komórki z białym stosem, nie z wyraźnie różnicowanymi komórkami) z zaznaczoną krawędzią pod mikroskopem preparacyjnym. Ostrożnie obrysuj wybrane kolonie i usuń zróżnicowaną warstwę fibroblastów otaczającą kolonię i wszystkie zróżnicowane części (jeśli występują) kolonii krawędzią sterylnej końcówki pipety P2 lub ciągniętą szklaną kapilarną. (Należy pamiętać, że pluripotencjalne hESC są w stadium przejściowym, ulegają spontanicznemu różnicowaniu nawet w optymalnych warunkach, chociaż jest to preferowane, trudno jest stwierdzić, że komórki te są w 100% niezróżnicowane pod mikroskopem preparacyjnym, >75% niezróżnicowanych są zwykle uważane za punkt przejścia. Zróżnicowane komórki zwykle nie wysiewają się i nadal rosną, eliminowane w procesie pasażowania)
3. Usunąć stare pożywki zawierające pływające, odłączone, zróżnicowane komórki przez aspirację. Przemyć pożywką hESC (bez bFGF) raz. Dodać 3 ml/dobrze świeżą pożywkę z ludzkimi aktywnymi komórkami ESC zawierającą 20 ng/ml bFGF.
4. Pokrój niezróżnicowane kolonie hESC na małe kawałki i odłącz sterylną końcówką pipety lub ciągniętą szklaną kapilarną.
5. Zebrać pożywkę zawierającą oderwane kawałki kolonii w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umyć płytkę raz pożywką 1 ml/studzienkę z izoenzymem hESC zawierającą 20 ng/ml bFGF i połączyć je w jedną grupę.
6. Odessać Matrigel lub ludzki roztwór lamininy z powlekanych świeżych płytek. Podwielokrotność 4 ml/basenik pożywki hESC zawierające kawałki kolonii na płytkę 6-dołkową. Delikatnie przenieś płytkę do inkubatora bez wstrząsania i pozostaw kawałki kolonii na noc do wysiewu nasion w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37°C z atmosferą 5% CO_{2 .}

4. Neuronalna indukcja hESC w zdefiniowanym systemie hodowli z kwasem retinowym

1. W 3 dniu po wysiewie usuń większość starych pożywek z każdej studzienki płytki i pozostaw wystarczającą ilość pożywki, aby umożliwić zanurzenie kolonii hESC (nigdy nie pozwól, aby hESC wyschły). Zastąp 4 ml/dołk, świeżą pożywką hESC zawierającą 20 ng/ml bFGF i 10 μM kwasu retinowego.
2. Zastąp stare pożywki świeżymi pożywkami hESC zawierającymi 20 ng/ml bFGF i 10 μM kwasu retinowego co drugi dzień i pozwól koloniom hESC indukowanym przez neurony rosnąć do 7 lub 8 dnia. Wszystkie komórki w kolonii ulegną zmianom morfologicznym w duże, zróżnicowane komórki, które będą się nadal namnażać. Kolonie zwiększą swój rozmiar, aby pokryć płytkę do 7 lub 8 dnia, a komórki zaczną gromadzić się w niektórych obszarach kolonii.

5. Ciągłe różnicowanie neuronów w hodowli zawiesinowej

1. Weź płytkę hodowlaną hESC do mikroskopu preparacyjnego (wstępny etap preparacji w temperaturze 37°C) pod wysterylizowanym kapturem do preparacji. Ostrożnie obrysuj kolonie i usuń warstwę fibroblastów otaczającą kolonię (zróżnicowane komórki wyemigrowały z kolonii) krawędzią sterylnej końcówki pipety P2 lub wyciągniętą szklaną kapilarną.
2. Usuń stare podłoże zawierające pływające oderwane komórki fibroblastów przez zasysanie. Przemyć pożywką hESC (bez bFGF) raz. Dodać 3 ml/dobrze świeżą pożywkę z hESC (bez bFGF).
3. Pokrój indukowane nerwowo kolonie hESC na małe kawałki i odłącz sterylną końcówką pipety lub ciągniętą szklaną kapilarą.
4. Zebrać pożywkę zawierającą oderwane kawałki kolonii w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umyć płytkę raz 1 ml/studzienkę pożywką hESC (bez bFGF) i połączyć je w pulę.
5. Podwielokrotność 4 ml/dołek pożywki hESC bez surowicy zawierającej fragmenty kolonii na 6-dołkową płytkę przyłączeniową o bardzo niskim poziomie i inkubować w inkubatorze nawilżanym w temperaturze 37°C, aby umożliwić tworzenie się pływających klastrów komórkowych (neuroblastów) przez 4-5 dni.

6. Dojrzewanie fenotypu neuronalnego w kulturze adhezyjnej

1. Zebrać pożywkę zawierającą pływające neuroblasty w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wirować z prędkością 1400 obr./min przez 5 min. Odessać starą pożywkę tak bardzo, jak to możliwe i dodać równą ilość świeżej pożywki NSC zawierającej VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) i BDNF (10 ng / ml).
2. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać pływające neuroblasty i podamy 4 ml / dołek do płytek 6-dołkowych. Neuroblasty mogą być również wysiewane w 3-wymiarowej matrycy spolimeryzowanej lamininą / kolagenem (Matrigel) lub ludzką lamininą w pożywce NSC bez surowicy zawierającej VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) i BDNF (10 ng / ml). Przenieś płytki do inkubatora z wilgotnością 37°C, aby umożliwić przyczepienie się neuroblastów przez noc.
3. Pożywki NSC zawierające VEGF (20 ng/ml), NT-3 (10 ng/ml) i BDNF (10 ng/ml) należy wymieniać co drugi dzień. Rozległe sieci komórek neuronalnych zawierających neuryty i komórek barwnikowych zaczną pojawiać się w ciągu 2 tygodni ciągłej hodowli i wzrostu liczby z czasem i mogą utrzymywać się przez ponad 3 miesiące.

7. Reprezentatywne wyniki:

Kwas retinowy (RA) jest wystarczający do wywołania hESC utrzymywanych w zdefiniowanym systemie hodowli do przejścia z pluripotencji wyłącznie do fenotypu neuroektodermalnego (ryc. 2A). Po ekspozycji niezróżnicowanych hESC na RZS wszystkie komórki w kolonii ulegną zmianom morfologicznym w dużych zróżnicowanych komórkach, które przestają wyrażać markery związane z pluripotencją, jak wskazuje Oct-4, i zaczynają wyrażać różne markery związane z neuroektodermą, takie jak HNK1, AP2 i TrkC (ryc. 2B). Te duże zróżnicowane komórki będą się nadal namnażać, a kolonie będą się powiększać, przechodząc spontanicznie do ekspresji wczesnego markera neuronalnego β-III-tubuliny (ryc. 2B). Bardziej dojrzały marker neuronalny Map-2 zacznie pojawiać się w obszarach kolonii, w których nagromadziły się komórki (ryc. 2B). Równolegle z pojawieniem się komórek neuroektodermalnych i różnicowaniem neuronów, specyficzny dla neuronów czynnik transkrypcyjny Nurr1, zaangażowany w dopaminergiczne różnicowanie neuronów i aktywację genu hydroksylazy tyrozynowej (TH)¹⁶, będzie przemieszczał się do jądra (ryc. 2B). Po odłączeniu, hESC traktowane RZS utworzą pływające klastry komórkowe (neuroblasty) w kulturze zawiesinowej, aby kontynuować proces różnicowania neuronalnego. Po usunięciu bFGF i po umożliwieniu neuroblastom przyłączenia się do płytki do hodowli tkankowej lub wysiania w 3-wymiarowej matrycy spolimeryzowanej lamininą/kolagenem w zdefiniowanym pożywce wolnej od surowicy, zaczną pojawiać się komórki zawierające neuryty i komórki barwnikowe wykazujące ekspresję β-III-tubuliny i Map-2 z drastycznym wzrostem wydajności w porównaniu ze spontanicznym wieloliniowym różnicowaniem hESC bez leczenia w tym samym okresie, i może utrzymywać się przez ponad 3 miesiące (ryc. 2C).

Wykres 1 Schemat dobrze kontrolowanej, efektywnej indukcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych wyłącznie do określonej klinicznie istotnej linii poprzez proste dostarczanie małych cząsteczek.

Rycina 2 Kwas retinowy indukuje specyfikację linii neuronalnej i progresję neuronów bezpośrednio pluripotencji w określonych warunkach. (A) Schemat przedstawiający linię czasu protokołu ukierunkowanego różnicowania neuronalnego hESC. (B) Po wystawieniu niezróżnicowanych hESC na kwas retinowy (RA) w określonym systemie hodowli, w kolonii zaczęły pojawiać się duże, zróżnicowane komórki Oct-4 (czerwone) ujemne, w porównaniu z hESC traktowanymi pozorowo (DMSO) jako kontrolą. Indukowane przez RZS zróżnicowane komórki Oct-4-ujemne zaczęły wyrażać HNK-1 (czerwony), AP2 (czerwony), TrkC (zielony), a następnie β-III-tubulinę (czerwony), zgodnie z wczesnym różnicowaniem neuroektodermalnym. Komórki te nadal dojrzewały, ostatecznie wyrażając marker neuronalny Map-2 (zielony), zwykle w obszarach, w których komórki zaczęły się gromadzić. Równolegle z pojawieniem się komórek neuroektodermalnych i różnicowaniem neuronalnym, specyficzny dla neuronów czynnik transkrypcyjny Nurr1 (zielony), zaangażowany w dopaminergiczne różnicowanie neuronów i aktywację genu hydroksylazy tyrozynowej (TH), przemieszcza się do jądra. Wszystkie komórki są pokazane przez barwienie DAPI ich jąder (kolor niebieski). (C) Leczenie RZS indukuje różnicowanie w kierunku linii neuronalnej o wysokiej skuteczności, co oceniano za pomocą rozległych sieci komórek zawierających neuryty eksprymujące β-III-tubulinę (czerwoną) i Map-2 (zieloną, pokazaną w matrycy 3-wymiarowej). Strzałki wskazują komórki barwnikowe typowe dla komórek w OUN. Wszystkie komórki są pokazane przez barwienie DAPI ich jąder (na niebiesko) we wstawkach. Podziałka: 0,1 mm.

Dyskusja

Jednym z głównych wyzwań zarówno dla badań rozwojowych, jak i translacji klinicznej było skuteczne i przewidywalne ukierunkowanie szerokiego potencjału różnicowania pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych do pożądanego fenotypu. Chociaż takie komórki mogą spontanicznie różnicować się in vitro w komórki wszystkich listków rozrodczych, przechodząc przez etap agregacji wieloliniowej, tylko niewielka część komórek dąży do danej linii^1,4. W tych agregatach pochodzących z hESC jednoczesne pojawienie się znacznej ilości bardzo rozbieżnych niepożądanych typów komórek, które mogą znajdować się w trzech embrionalnych listkach rozrodczych, często sprawia, że pojawienie się pożądanych fenotypów jest nie tylko nieefektywne, ale także niekontrolowane i niewiarygodne. Chociaż w poprzednich raportach wyprowadzono linie sercowe i nerwowe, jednak nieefektywność w generowaniu wyspecjalizowanych komórek poprzez indukcję listków zarodkowych komórek pluripotencjalnych i wysokie ryzyko rakotwórczości po przeszczepie utrudniły dalszą translację kliniczną.

Linie hESC początkowo pochodziły i były utrzymywane w kokulturze z zahamowanymi wzrostami mysich fibroblastów embrionalnych (MEF)⁴. Chociaż dla hESC^11-13 opracowano kilka systemów hodowli żywienia przez ludzi, bez karmników i zawierających formuły chemiczne, pierwiastki niezbędne i wystarczające do podtrzymania samoodnawiania się ludzkich komórek pluripotencjalnych pozostają nierozwiązane. Te egzogenne komórki zasilające i odczynniki biologiczne pomagają utrzymać długoterminowy stabilny wzrost niezróżnicowanych hESC, jednocześnie maskując zdolność komórek pluripotencjalnych do reagowania na sygnały rozwojowe. Utrzymanie niezróżnicowanych hESC w zdefiniowanym systemie hodowli wolnej od leków biologicznych, który umożliwia wierną ekspansję i kontrolowane bezpośrednie różnicowanie, jest jednym z kluczy do ich użyteczności i potencjału terapeutycznego. RZS nie było wystarczające do indukowania różnicowania neuronalnego niezróżnicowanych komórek hESC utrzymywanych w wcześniej opisanych warunkach zawierających egzogenne komórki żywicielskie. Chociaż linie nerwowe pojawiają się na stosunkowo wczesnym etapie różnicowania hESC, leczenie RZS zróżnicowanych przez hESC agregatów wieloliniowych (ciał embrionalnych) tylko nieznacznie zwiększyło niską wydajność neuronów^{1, 14, 15}. W celu osiągnięcia jednolitej konwersji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do określonej linii, zastosowaliśmy zdefiniowany system hodowli zdolny do zapewnienia proliferacji niezróżnicowanych hESC w celu zidentyfikowania warunków dla dobrze kontrolowanej, efektywnej indukcji pluripotencjalnych hESC wyłącznie do określonej klinicznie istotnej linii poprzez proste dostarczenie małych cząsteczek (ryc. 1, ryc. 2). Przyszłe badania ujawnią, że genetyczne i epigenetyczne cząsteczki kontrolne w rozwoju ośrodkowego układu nerwowego u ludzi są alternatywą, co może utorować drogę do bezpośredniej kontroli i modulacji losu pluripotencjalnych komórek ludzkich komórek macierzystych za pośrednictwem małych cząsteczek podczas wyprowadzania klinicznie istotnych linii dla terapii regeneracyjnych. Bez leczenia RZS 1-5% hESC ulegnie spontanicznemu różnicowaniu w neurony^{1, 14, 15}. Dzięki leczeniu RZS byliśmy w stanie wygenerować > 95% embrionalnych neuronalnych komórek progenitorowych i neuronów z hESC utrzymywanych w określonej kulturze w procesie, który może naśladować rozwój embrionalny człowieka¹⁴. Ostatnio znane geny determinujące los neuronów zostały wykorzystane do transróżnicowania fibroblastów myszy w dorosłe neuronalne komórki progenitorowe i neurony z niską wydajnością w zakresie 0,5-8%^{17, 18}. Jednak przeprogramowane komórki somatyczne były historycznie związane z nieprawidłową ekspresją genów i przyspieszonym starzeniem się z upośledzoną użytecznością terapeutyczną^19-21. Wreszcie, protokół, który tutaj ustaliliśmy, jest ograniczony do pluripotencjalnych hESC pochodzących z wewnętrznej masy komórkowej (ICM) lub epiblastu ludzkiej blastocysty⁴, może nie mieć zastosowania do innych komórek pluripotencjalnych, w tym ESC pochodzenia zwierzęcego, ESC pochodzących z wcześniejszych zarodków w stadium morula (ośmiokomórkowym)²² i sztucznie przeprogramowanych komórek²³.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Żelatyna	Sigma-Aldrich	G1890
Matrigel	BD Biosciences	356231	Zredukowany czynnik wzrostu
Ludzka laminina	Sigma-Aldrich	L6274
all-trans-retinowy	kwas Sigma-Aldrich	R2625
DMEM/F12	Invitrogen	10565018
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM-KO	Invitrogen	10829018
Zamiennik surowicy nokautującej	Invitrogen	10828028
MEM nieistotny roztwór aminokwasów (MNAA, 100X)	Invitrogen	11140050
roztwór aminokwasów MEM(MEAA, 100X)	Invitrogen	11130050
β-Mercapt– thanol	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
Kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	A4403
Transferyna ludzka	Sigma-Aldrich	T8158
Ludzka bFGF	PeproTech Inc	AF-100-18B
Insulina ludzka	Invitrogen	12585014
Ludzka activin A	PeproTech Inc	120-14E
Human BDNF	PeproTech Inc	AF-450-02
Human VEGF	PeproTech Inc	AF-100-20
Human NT-3	PeproTech Inc	450-03
Heparyna	Sigma-Aldrich	H5284
N-2 suplement (100X)	Invitrogen	17502048
6- dobrze niska płytka mocująca	Corning	3471
Płytka 6-dołkowa	Corning	3516