Artykuł metodologiczny

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

22.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3274

⸱

3 listopada 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1San Diego Regenerative Medicine Institute, 2Xcelthera, 3Department of Neurosurgery, Harvard Medical School, 4Division of SCI Research, VA Boston Healthcare System, 5Program in Stem Cell & Regenerative Biology, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6La Jolla IVF

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Streszczenie

Do tej pory brak odpowiedniego źródła ludzkich komórek serca stanowił główną przeszkodę w regeneracji ludzkiego mięśnia sercowego, zarówno poprzez transplantację komórkową, jak i inżynierię tkanki serca1-3. Kardiomiocyty ulegają terminalnemu różnicowaniu krótko po urodzeniu i tracą zdolność do proliferacji. Nie ma dowodów na to, że komórki macierzyste/progenitorowe pochodzące z innych źródeł, takich jak szpik kostny lub krew pępowinowa, są w stanie przekształcić się w kurczliwe komórki mięśnia sercowego po transplantacji do serca1-3. Potrzeba regeneracji lub naprawy uszkodzonego mięśnia sercowego nie została zaspokojona przez terapię dorosłymi komórkami macierzystymi, ani endogenną, ani poprzez dostarczanie komórek1-3. Genetycznie stabilne ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) posiadają nieograniczoną zdolność do ekspansji i nieograniczoną plastyczność, stanowiąc pluripotencyjny rezerwuar dla pochodnych in vitro dużych ilości ludzkich komórek somatycznych, ograniczonych do linii wymagającej naprawy i regeneracji4,5. Ze względu na powszechność chorób sercowo-naczyniowych na całym świecie i ostry niedobór organów od dawców, istnieje ogromne zainteresowanie opracowaniem terapii opartych na hESCs jako alternatywnego podejścia. Jednakże to, jak efektywnie i przewidywalnie nakierować szeroki potencjał różnicowania pluripotencyjnych hESCs na pożądany fenotyp, stanowiło główne wyzwanie zarówno dla badań rozwojowych, jak i translacji klinicznej. Konwencjonalne podejścia opierają się na wieloliniowym skłanianiu komórek pluripotencyjnych poprzez spontaniczne różnicowanie warstw zarodkowych, co skutkuje nieefektywnym i niekontrolowanym określeniem linii, któremu często towarzyszy heterogeniczność i niestabilność fenotypowa, a co za tym idzie, wysokie ryzyko tumorigeniczności6-8 (patrz schemat na Ryc. 1A). Ponadto nieokreślone obce/zwierzęce suplementy biologiczne i/lub komórki karmne, które zazwyczaj stosowano do izolacji, ekspansji i różnicowania hESCs, mogą sprawić, że bezpośrednie zastosowanie takich specjalistycznych przeszczepów komórkowych u pacjentów będzie problematyczne9-11. Aby pokonać te przeszkody, opracowaliśmy elementy zdefiniowanego systemu hodowlanego, które są niezbędne i wystarczające do utrzymania pluripotencji epiblastu hESCs, służąc jako platforma do pochodnych de novo klinicznie odpowiednich hESCs i efektywnego, jednolitego kierowania takich hESCs w stronę klinicznie istotnych linii za pomocą małych cząsteczek12 (patrz schemat na Ryc. 1B). Po przesianiu różnorodnych małych cząsteczek i czynników wzrostu odkryliśmy, że w takich zdefiniowanych warunkach nikotynamid (NAM) był wystarczający do indukcji specyfikacji kardiomezodermy bezpośrednio z pluripotencyjnych hESCs, która następnie przekształciła się w kardioblasty, generujące ludzkie, bijące kardiomiocyty z wysoką wydajnością (Ryc. 2). Zdefiniowaliśmy warunki indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencyjnych hESCs bez pośredniego etapu wieloliniowego ciała embrionalnego, co umożliwia dobrze kontrolowane i wydajne pozyskiwanie dużych ilości ludzkich komórek serca na różnych etapach rozwojowych dla zastosowań w terapiach komórkowych.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów i pożywek

  1. Roztwór do powlekania żelatyną: 0,1% (w/v) żelatyny w ddH2O, autoklawowany i przechowywany w 4°C.
  2. Roztwory do powlekania Matrigelem. Roztwór stokowy: powolne rozmrażanie Matrigelu (10 ml) w 4°C przez noc, dodanie 10 ml lodowatego DMEM lub DMEM/F12, dokładne wymieszanie i rozdzielenie na alikwoty 1 ml/probówkę w sterylnej komorze do hodowli tkanek, przechowywanie w -20°C. Roztwór roboczy: powolne rozmrażanie alikwoty 1 ml Matrigelu w 4°C przez 1-2 h, przeniesienie do 14 ml schłodzonego DMEM lub DMEM/F12 i dokładne wymieszanie w sterylnej komorze do hodowli tkanek bezpośrednio przed powlekaniem.
  3. Roztwór do powlekania ludzką lamininą: rozcieńczenie 1 ml roztworu ludzkiej lamininy (0,5 mg/ml w buforze Tris-NaCl, przechowywanym w -80°C, powoli rozmrażanym w 4°C przez 1-2 h) lodowatym DMEM lub DMEM/F12 do 12,5 ml roztworu roboczego (40 μg/ml) w sterylnej komorze do hodowli tkanek bezpośrednio przed powlekaniem.
  4. Roztwory stokowe czynników wzrostu (500-1000X): rozpuszczenie czynnika wzrostu do stężenia 10 μg/ml w sterylnym buforze (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerolu, 1XPBS) i przechowywanie w alikwotach 50-100 μl/probówkę w -80°C.
  5. Pożywka dla HESC: DMEM/F12 lub KO-DMEM (80%), zamiennik surowicy KO (20%), L-alanylo-L-glutamina lub L-glutamina (2 mM), nieessentialne aminokwasy MEM (MNAA, 1X) oraz β-merkaptoetanol (100 μM), przefiltrowana i przechowywana w 4°C, uzupełniona o bFGF (20 ng/ml) przed użyciem. Alternatywnie, zastąpienie „zamiennika surowicy KO” zdefiniowanymi składnikami: DMEM/F12 lub KO-DMEM (100%), L-alanylo-L-glutamina lub L-glutamina (2 mM), MNAA (1X), essentialne aminokwasy MEM (MEAA, 1X) oraz β-merkaptoetanol (100 μM), przefiltrowana i przechowywana w 4°C, uzupełniona przed użyciem o bFGF (20 ng/ml), ludzką insulinę (20 μg/ml), kwas askorbinowy (50 μg/ml), ludzką aktywinę A (50 ng/ml), ludzką albuminę/Albumax (10 mg/ml) oraz ludzką transferrynę (8 μg/ml).
  6. Pożywka do różnicowania kardiologicznego HESC: DMEM/F12 (90%), zdefiniowana FBS (10%) oraz L-alanylo-L-glutamina lub L-glutamina (2 mM).
  7. Pożywki zawierające nikotynamid (NAM): dodanie NAM do pożywki dla HESC lub pożywki do różnicowania kardiologicznego HESC do stężenia końcowego 10 mM, przefiltrowanie, przechowywanie w 4°C i użycie w ciągu 2 tygodni od przygotowania.

2. Powlekanie płytek

  1. Pokrycie płytek żelatyną: do studni płytek 6-dołkowych dodać 2,5 ml/studnię roztworu żelatyny i inkubować przez noc w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C.
  2. Pokrycie płytek lamininą: schłodzić płytki pokryte żelatyną i usunąć żelatynę, a następnie do schłodzonych wcześniej płytek 6-dołkowych z żelatyną dodać 2,5 ml/studnię roboczego roztworu do pokrywania Matrigel lub ludzką lamininą i inkubować w temperaturze 4°C przez noc.

3. Pasażowanie i wysiewanie nieróżnicujących się hESC w warunkach zdefiniowanych

  1. Pozostaw kolonie hESC do momentu, gdy osiągną wiek 5-7 dni, a następnie przenieś płytkę z kulturą hESC pod sterylnym dygestorium do mikroskopu stereoskopowego (wcześniej podgrzej stolik mikroskopu do 37°C).
  2. Wybierz kolonie hESC do pasażowania. Pod mikroskopem stereoskopowym kolonie te powinny morfologicznie składać się w > 75% z niezróżnicowanych hESC (małe, zwarte komórki), być zazwyczaj lekko mętne (bez białych skupisk komórek i bez przeźroczystych komórek zróżnicowanych) i posiadać wyraźne krawędzie. Ostrożnie obrysuj wybrane kolonie i usuń krawędzią sterylnej końcówki do pipety P2 lub wyciągniętej kapilary szklanej otaczającą kolonię warstwę zróżnicowanych fibroblastów oraz wszystkie zróżnicowane części kolonii (jeśli występują).
  3. Usuń starą pożywkę zawierającą pływające, oddzielone zróżnicowane komórki poprzez aspirację. Przepłucz raz pożywką do hESC (bez bFGF). Dodaj 3 ml/dołek świeżej pożywki do hESC zawierającej 20 ng/ml bFGF.
  4. Podziel niezróżnicowane kolonie hESC na małe fragmenty i oddziel je za pomocą sterylnej końcówki do pipety lub wyciągniętej kapilary szklanej.
  5. Zbierz pożywkę zawierającą oddzielone fragmenty kolonii do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłucz płytkę raz, używając 1 ml/dołek pożywki do hESC zawierającej 20 ng/ml bFGF, i połącz z resztą zawiesiny.
  6. Odsącz roztwór Matrigelu lub lamininy ludzkiej z nowo pokrytych płytek. Rozlej po 4 ml/dołek pożywki do hESC zawierającej fragmenty kolonii na płytkę 6-dołkową. Ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora, unikając wstrząsania, i pozostaw fragmenty kolonii do osiadania przez noc, nie zakłócając ich, w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C i atmosferą 5% CO2.

4. Indukcja kardiogenna hESC w zdefiniowanym systemie hodowlanym z nikotynamidem

  1. W 3. dniu po wysiewie usunąć większość starej pożywki z każdego dołka płytki, pozostawiając ilość wystarczającą do zanurzenia kolonii hESC (nigdy nie dopuszczać do wyschnięcia hESC). Zastąpić ją 4 ml/well świeżej pożywki hESC zawierającej 20 ng/ml bFGF oraz 10 mM nikotynamidu (NAM).
  2. Wymieniać starą pożywkę na świeżą pożywkę hESC zawierającą 20 ng/ml bFGF i 10 mM NAM co drugi dzień i pozwolić koloniom hESC indukowanym w kierunku kardiomiocytów rosnąć do 8-10 dnia. Po wystawieniu na działanie NAM wszystkie komórki w kolonii ulegną zmianom morfologicznym, przekształcając się w duże komórki zróżnicowane, które będą nadal się namnażać. Kolonie zwiększą swoją wielkość, a do 8-10 dnia komórki zaczną spiętrzać się w niektórych obszarach kolonii.

5. Kontynuacja różnicowania kardiomiocytów w hodowli zawiesinowej

  1. Przenieś płytkę z kulturą hESC pod sterylną komorę przepływu laminarnego, do mikroskopu stereoskopowego (podgrzej wcześniej stolik mikroskopu do 37°C). Ostrożnie obrysuj kolonie i usuń warstwę fibroblastów otaczającą kolonię (zróżnicowane komórki, które wywędrowały z kolonii) za pomocą krawędzi sterylnego końcówki do pipety P2 lub wyciągniętej kapilary szklanej.
  2. Usuń stare medium zawierające pływające, oddzielone komórki fibroblastów poprzez aspirację. Przepłucz raz medium do hESC (bez bFGF). Dodaj 3 ml/studzienkę świeżego medium do hESC (bez bFGF).
  3. Podziel indukowane w kierunku kardiologicznym kolonie hESC na małe fragmenty i oddziel je za pomocą sterylnej końcówki do pipety lub wyciągniętej kapilary szklanej.
  4. Zbierz medium zawierające oddzielone fragmenty kolonii do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłucz płytkę raz za pomocą 1 ml/studzienkę medium do hESC (bez bFGF) i połącz z resztą materiału.
  5. Przenieś po 4 ml/studzienkę bezzserwatkowego medium do hESC zawierającego fragmenty kolonii na płytkę 6-dołkową o ultra niskiej adhezji i inkubuj w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C przez 4-5 dni, aby umożliwić formowanie się pływających skupisk komórkowych (kardioblastów).

6. Dojrzewanie fenotypowe bijących kardiomiocytów w hodowli adhezyjnej

  1. Połączyć pożywki zawierające pływające kardioblasty w probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Wirować przy 1400 rpm przez 5 min. Odessać jak najwięcej starej pożywki i dodać taką samą ilość świeżej pożywki do różnicowania kardiologicznego hESC zawierającej 10 mM NAM.
  2. Wymieszać pływające kardioblasty poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie rozdzielić po 4 ml/dołek do płytek 6-dołkowych. Przenieść płytki do inkubatora z nawilżaniem w temperaturze 37°C, aby umożliwić przyleganie kardioblastów przez noc.
  3. Wymieniać pożywkę do różnicowania kardiologicznego hESC zawierającą 10 mM NAM co drugi dzień.
  4. W 8. dniu zastąpić ją pożywką do różnicowania kardiologicznego hESC bez NAM i kontynuować wymianę pożywki do różnicowania kardiologicznego hESC co drugi dzień. Bijące kardiomiocyty zaczną pojawiać się po około 1-2 tygodniach ciągłej hodowli po odstawieniu NAM i będą zwiększać swoją liczbę z czasem, zachowując silne i rytmiczne skurcze przez ponad 3 miesiące.

7. Reprezentatywne wyniki:

Nikotynamid (NAM) w dostatecznym stężeniu indukuje przejście hESC utrzymywanych w zdefiniowanym systemie hodowlanym ze stanu pluripotencji wyłącznie w kierunku fenotypu kardiomezodermalnego (Rys. 2B). Po wystawieniu nieróżnicowanych hESC na działanie NAM wszystkie komórki w kolonii ulegają zmianom morfologicznym, przekształcając się w duże komórki zróżnicowane, które wykazują obniżoną ekspresję Oct-4 i zaczynają eksprimować specyficzny dla serca czynnik transkrypcyjny (Csx) Nkx2.5 oraz α-aktyninę, co jest zgodne z fenotypem kardiomezodermy (Rys. 2B). Zróżnicowane komórki te nadal się namnażają, a kolonie zwiększają swoją wielkość. Zwiększona intensywność sygnału Nkx2.5 jest zazwyczaj obserwowana w obszarach kolonii, w których komórki zaczynają się spiętrzać (Rys. 2B). Po odłączeniu hESC traktowane NAM tworzą pływające skupiska komórkowe (kardioblasty) w hodowli zawiesinowej, aby kontynuować proces różnicowania kardiologicznego. Po umożliwieniu przyczepienia się kardioblastów i kontynuowaniu traktowania NAM przez 1 tydzień, bijące kardiomiocyty zaczynają pojawiać się w ciągu około 1-2 tygodni ciągłej hodowli po odstawieniu NAM, wykazując drastyczny wzrost wydajności w porównaniu do spontanicznego różnicowania wieloliniowego hESC bez traktowania w tym samym okresie czasu (Rys. 2C). Komórki w skupiskach bijących kardiomiocytów eksprimują markery charakterystyczne dla kardiomiocytów, w tym Nkx2.5 i α-aktyninę (Rys. 2C). Potwierdzono za pomocą profili elektrycznych, że skurcze bijących kardiomiocytów są silne, rytmiczne, dobrze skoordynowane i dobrze zsynchronizowane, z regularnymi impulsami przypominającymi kompleksy p-QRS-T obserwowane z elektrod powierzchniowych w klinicznych elektrokardiogramach (Rys. 2C, patrz również Wideo). Kardiomiocyty te zachowały silną zdolność skurczową przez ponad 3 miesiące.

figure-protocol-1
Rycina 1. Ogólne schematy podejścia konwencjonalnego w porównaniu do podejścia z indukcją za pomocą małych cząsteczek w celu różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w wyspecjalizowane komórki funkcjonalne. (A) Schemat podejścia konwencjonalnego wykorzystującego wieloliniowe nachylenie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez spontaniczne różnicowanie blaszek zarodkowych. (B) Schemat dobrze kontrolowanej, wydajnej indukcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych wyłącznie w kierunku konkretnej, istotnej klinicznie linii za pomocą prostego dostarczenia małych cząsteczek.

figure-protocol-2
Rycina 2. Nikotynamid indukuje bezpośrednią specyfikację linii kardiologicznej z pluripotencji w określonych warunkach oraz progresję do etapu bijących kardiomiocytów. (A) Schemat przedstawiający oś czasu protokołu kierowanej różnicowania hESC w kierunku kardiologicznym. (B) Po poddaniu nieróżnicowanych hESC działaniu nikotynamidu (NAM) w określonym systemie hodowlanym, w obrębie kolonii zaczęły pojawiać się duże, zróżnicowane komórki negatywne pod kątem Oct-4 (czerwone), w porównaniu do kontrolnych hESC traktowanych pozornie (DMSO). Indukowane przez NAM komórki Oct-4-ujemne zaczęły wykazywać ekspresję Nkx2.5 (zielony) i α-aktyniny (czerwony), co jest spójne z wczesnym różnicowaniem kardiologicznym. Stopniowo zwiększona intensywność Nkx2.5 była zazwyczaj obserwowana w obszarach kolonii, w których komórki zaczęły się spiętrzać. Wszystkie komórki są wskazane przez barwienie jąder DAPI (niebieski). (C) Indukowane przez NAM hESC skierowane na linię kardiologiczną doprowadziły do powstania bijących kardiomiocytów z drastycznym wzrostem wydajności, co oceniono na podstawie klastrów komórkowych wykazujących rytmiczne skurcze (patrz profil elektrofizjologiczny i filmy), wykazujących dodatni wynik immunobarwienia dla Nkx2.5 (zielony) i α-aktyniny (czerwony). Przedstawiono obrazy fazowe reprezentatywnych dużych klastrów bijących kardiomiocytów oraz obrazy o większym powiększeniu reprezentatywnych kurczących się mięśni sercowych (patrz również odpowiadające im filmy). Strzałki wskazują duży klaster bijących kardiomiocytów wykorzystany do zapisu elektrofizjologicznego. Profil elektrofizjologiczny bijących kardiomiocytów wykazuje regularne, zsynchronizowane, rytmiczne impulsy przypominające kompleksy p-QRS-T obserwowane w klinicznych elektrokardiogramach. Paski skali: 0.1 mm.

Filmy: Kurczące się kardiomiocyty zróżnicowane z hESC indukowanych NAM. Filmy 1 i 2 przedstawiają reprezentatywne duże, bijące skupiska kardiomiocytów około 1 i 3 miesiąca po przyleganiu. Filmy 3 i 4 przedstawiają reprezentatywne kurczące się mięśnie serca przy większym powiększeniu. Film 5 przedstawia typowe małe, bijące skupisko kardiomiocytów spontanicznie zróżnicowane z hESC bez zastosowania NAM jako kontrolę.

Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 1.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 2.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 3.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 4.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 5.

Dyskusja

Jednym z głównych wyzwań zarówno dla badań rozwojowych, jak i translacji klinicznej było znalezienie sposobu, aby efektywnie i przewidywalnie nakierować szeroki potencjał różnicowania pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych na pożądany fenotyp. Chociaż komórki te mogą różnicować się spontanicznie in vitro w komórki wszystkich trzech listków zarodkowych, przechodząc przez etap agregatów wieloliniowych, w agregatach wieloliniowych pochodzących z hESC (ciałach zarodkowych) tylko bardzo mała frakcja komórek (<2%) różnicuje się spontanicznie w kardiomiocyty13-15 (Ryc. 1A). Po immunoselekcji wzbogacone populacje kardiomiocytów były w stanie pełnić funkcję biologicznych rozruszników serca, przywracając funkcję uszkodzonego mięśnia sercowego mechanicznie i elektronicznie po wstrzyknięciu do serca modeli zwierzęcych13. W modelach niedokrwiennych u gryzoni wszczepione progenitory sercowe pochodzące z hESC były w stanie przeżyć i dojrzewać do 12 tygodni, a także częściowo remuskularyzować uszkodzone serce i poprawić funkcję skurczową14,15. Jednakże niska wydajność generowania ludzkich komórek zdeterminowanych na linię sercową poprzez różnicowanie wieloliniowe komórek pluripotencjalnych oraz wysokie ryzyko tumorigeniczności po transplantacji utrudniały dalszą translację kliniczną. Opracowanie strategii pozwalających na wyłączne i przewidywalne nakierowanie szerokiego potencjału różnicowania pluripotencjalnych hESC na fenotyp sercowy jest kluczowe dla wykorzystania potencjału biologii hESC w obszarze serca. Aby osiągnąć jednolitą konwersję ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w konkretną linię, zastosowaliśmy zdefiniowany system hodowli zapewniający proliferację nieróżnicowanych hESC, aby zidentyfikować warunki dobrze kontrolowanej i wydajnej indukcji hESC wyłącznie w konkretną, istotną klinicznie linię poprzez proste podanie małych cząsteczek (Ryc 1B). Stwierdzono, że nikotynamid indukuje determinację linii sercowej bezpośrednio z pluripotencjalnych hESC w zdefiniowanej hodowli, co prowadzi do powstania bijących kardiomiocytów z wysoką wydajnością (Ryc. 2). Nkx2.5 jest ewolucyjnie konserwatywnym czynnikiem transkrypcyjnym homeoboksowym, niezbędnym do prawidłowego rozwoju serca, a mutacje w tym genie są związane z wrodzonymi wadami serca (CHD) u ludzi, które stanowią najczęstszą wadę wrodzoną16. Ekspresja Nkx2.5 jest najwcześniejszym markerem komórek prekursorowych serca u wszystkich dotychczas badanych kręgowców i jest niezbędna do prawidłowego przegrodzenia serca oraz formowania i dojrzewania układu przewodzącego16. U kręgowców początek i wzorzec wczesnej ekspresji Nkx2.5 mniej więcej pokrywają się z czasem i obszarem specyfikacji serca we wczesnej embriogenezie, a gen Nkx2.5 pozostaje eksponowany w sercu przez cały okres rozwoju16. W naszym modelu hESC NAM wydawał się wyzwalać indukcję sercową bezpośrednio z pluripotencjalnych hESC poprzez promowanie ekspresji specyficznego dla serca czynnika transkrypcyjnego Nkx2.5 w procesie, który może naśladować specyfikację kardiomezodermy z pluripotencjalnego epiblastu w ludzkiej embriogenezie serca. Przyszłe badania ujawnią genetyczne i epigenetyczne cząsteczki kontrolne w rozwoju ludzkiego serca jako alternatywy, co może utorować drogę do bezpośredniej kontroli i modulacji losu hESC za pomocą małych cząsteczek podczas wyprowadzania linii istotnych klinicznie dla terapii regeneracyjnych. Bez zastosowania NAM < 2% hESC ulegnie spontanicznej różnicowaniu w bijące kardiomiocyty12-15. Dzięki zastosowaniu NAM byliśmy w stanie wygenerować > 95% embrionalnych prekursorów serca i > 50% bijących kardiomiocytów z hESC utrzymywanych w zdefiniowanej hodowli, w procesie, który może naśladować ludzki embrionalny rozwój serca12. Niedawno znane geny determinujące los serca zostały wykorzystane do transdyferencjacji fibroblastów mysich w postnatalne bijące kardiomiocyty z niską wydajnością wynoszącą < 0,5%17, 18. Jednakże przeprogramowane komórki somatyczne były historycznie kojarzone z nieprawidłową ekspresją genów i przyspieszoną senescencją, co upośledzało ich użyteczność terapeutyczną19-21. Wreszcie, opracowany tutaj protokół ogranicza się do pluripotencjalnych hESC pochodzących z wewnętrznej masy komórkowej (ICM) lub epiblastu ludzkiego blastocysty4,5 i może nie mieć zastosowania do innych komórek pluripotencjalnych, w tym do ESC pochodzenia zwierzęcego, ESC pochodzących z wcześniejszego stadium moruli (osiem komórek)22 oraz komórek przeprogramowanych sztucznie23.

Oświadczenia

Autorzy deklarują konflikt interesów. XHP jest założycielem firmy Xcelthera. XHP i EYS posiadają prawa własności intelektualnej związane z hESC.

Podziękowania

XHP otrzymał wsparcie z grantów National Institute of Health (NIH) przyznanych przez National Institute on Aging (NIHK01AG024496) oraz The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ŻelatynaSigma-AldrichG1890
MatrigelBD Biosciences356231z obniżoną zawartością czynników wzrostu
Ludzka lamininaSigma-AldrichL6274
NikotynamidSigma-AldrichN0636
DMEM/F12Invitrogen10565042
DMEMInvitrogen31053036
DMEM-KOInvitrogen10829018
Zamiennik surowicy Knock-outInvitrogen10828028
roztwór nieessentialnych aminokwasów MEM (MNAA, 100X)Invitrogen11140050
roztwór aminokwasów MEM (MEAA, 100X)Invitrogen11130050
β-merkapto–etanolInvitrogen21985023
AlbumaxInvitrogen11020021
Kwas askorbinowySigma-AldrichA4403
Transferryna ludzkaSigma-AldrichT8158
Ludzki bFGFPeproTech IncAF-100-18B
Insulina ludzkaInvitrogen12585014
Ludzka aktywina APeproTech Inc120-14E
Zdefiniowana surowica wołowia (FBS)HycloneSH30073-03
płytka 6-dołkowa o ultraniskim przywieraniuCorning3471
płytka 6-dołkowaCorning3516

Bibliografia

  1. Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. Myocardial tissue engineering: a review. J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).
  2. Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453, 322-329 (2008).
  3. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).
  4. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells. Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).
  5. J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. , 282-1145 (1998).
  6. Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).
  7. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).
  8. Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).
  9. Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
  10. Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
  11. Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2, 185-190 (2005).
  12. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells. Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).
  13. Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
  14. Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  15. Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts. J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).
  16. Akazawa, H., Komuro, I. Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases. Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).
  17. Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  18. Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy. Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).
  19. Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, 285-290 (2010).
  20. Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  21. Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence. Stem Cells. 28, 704-712 (2010).
  22. Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres. Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).
  23. Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie kardiologicznetraktowanie nikotynamidemgenerowanie kardiomiocyt wpluripotencjalne kom rki macierzystezdefiniowany system hodowlianaliza immunofluorescencyjnarejestracja elektrofizjologicznahodowla w zawiesinie

Powiązane artykuły