Artykuł metodologiczny

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

22.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3274

⸱

3 listopada 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1San Diego Regenerative Medicine Institute, 2Xcelthera, 3Department of Neurosurgery, Harvard Medical School, 4Division of SCI Research, VA Boston Healthcare System, 5Program in Stem Cell & Regenerative Biology, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6La Jolla IVF

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Streszczenie

Do tej pory brak odpowiedniego źródła ludzkich komórek serca stanowił główną przeszkodę w regeneracji ludzkiego mięśnia sercowego, zarówno poprzez transplantację komórkową, jak i inżynierię tkanki serca1-3. Kardiomiocyty ulegają terminalnemu różnicowaniu krótko po urodzeniu i tracą zdolność do proliferacji. Nie ma dowodów na to, że komórki macierzyste/progenitorowe pochodzące z innych źródeł, takich jak szpik kostny lub krew pępowinowa, są w stanie przekształcić się w kurczliwe komórki mięśnia sercowego po transplantacji do serca1-3. Potrzeba regeneracji lub naprawy uszkodzonego mięśnia sercowego nie została zaspokojona przez terapię dorosłymi komórkami macierzystymi, ani endogenną, ani poprzez dostarczanie komórek1-3. Genetycznie stabilne ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) posiadają nieograniczoną zdolność do ekspansji i nieograniczoną plastyczność, stanowiąc pluripotencyjny rezerwuar dla pochodnych in vitro dużych ilości ludzkich komórek somatycznych, ograniczonych do linii wymagającej naprawy i regeneracji4,5. Ze względu na powszechność chorób sercowo-naczyniowych na całym świecie i ostry niedobór organów od dawców, istnieje ogromne zainteresowanie opracowaniem terapii opartych na hESCs jako alternatywnego podejścia. Jednakże to, jak efektywnie i przewidywalnie nakierować szeroki potencjał różnicowania pluripotencyjnych hESCs na pożądany fenotyp, stanowiło główne wyzwanie zarówno dla badań rozwojowych, jak i translacji klinicznej. Konwencjonalne podejścia opierają się na wieloliniowym skłanianiu komórek pluripotencyjnych poprzez spontaniczne różnicowanie warstw zarodkowych, co skutkuje nieefektywnym i niekontrolowanym określeniem linii, któremu często towarzyszy heterogeniczność i niestabilność fenotypowa, a co za tym idzie, wysokie ryzyko tumorigeniczności6-8 (patrz schemat na Ryc. 1A). Ponadto nieokreślone obce/zwierzęce suplementy biologiczne i/lub komórki karmne, które zazwyczaj stosowano do izolacji, ekspansji i różnicowania hESCs, mogą sprawić, że bezpośrednie zastosowanie takich specjalistycznych przeszczepów komórkowych u pacjentów będzie problematyczne9-11. Aby pokonać te przeszkody, opracowaliśmy elementy zdefiniowanego systemu hodowlanego, które są niezbędne i wystarczające do utrzymania pluripotencji epiblastu hESCs, służąc jako platforma do pochodnych de novo klinicznie odpowiednich hESCs i efektywnego, jednolitego kierowania takich hESCs w stronę klinicznie istotnych linii za pomocą małych cząsteczek12 (patrz schemat na Ryc. 1B). Po przesianiu różnorodnych małych cząsteczek i czynników wzrostu odkryliśmy, że w takich zdefiniowanych warunkach nikotynamid (NAM) był wystarczający do indukcji specyfikacji kardiomezodermy bezpośrednio z pluripotencyjnych hESCs, która następnie przekształciła się w kardioblasty, generujące ludzkie, bijące kardiomiocyty z wysoką wydajnością (Ryc. 2). Zdefiniowaliśmy warunki indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencyjnych hESCs bez pośredniego etapu wieloliniowego ciała embrionalnego, co umożliwia dobrze kontrolowane i wydajne pozyskiwanie dużych ilości ludzkich komórek serca na różnych etapach rozwojowych dla zastosowań w terapiach komórkowych.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów i pożywek

  1. Roztwór do powlekania żelatyną: 0,1% (w/v) żelatyny w ddH2O, autoklawowany i przechowywany w temperaturze 4°C.
  2. Roztwory do powlekania Matrigelem. Roztwór stokowy: powolne rozmrażanie Matrigelu (10 ml) w temperaturze 4°C przez noc, dodanie 10 ml schłodzonego do temperatury lodu DMEM lub DMEM/F12, dokładne wymieszanie i rozdzielenie na aliquoty po 1 ml/probówkę pod sterylnym dygestorium do hodowli tkankowych, przechowywanie w temperaturze -20°C. Roztwór roboczy: powolne rozmrażanie aliquoty 1 ml Matrigelu w temperaturze 4°C przez 1-2 godziny, przeniesienie do 14 ml schłodzonego DMEM lub DMEM/F12 i dokładne wymieszanie pod sterylnym dygestorium do hodowli tkankowych bezpośrednio przed powlekaniem.
  3. Roztwór do powlekania ludzką lamininą: rozcieńczenie 1 ml roztworu ludzkiej lamininy (0,5 mg/ml w buforze Tris NaCl, przechowywanym w temperaturze -80°C, powolne rozmrażanie w temperaturze 4°C przez 1-2 godziny) schłodzonym do temperatury lodu DMEM lub DMEM/F12 do uzyskania 12,5 ml roztworu roboczego (40 μg/ml) pod sterylnym dygestorium do hodowli tkankowych bezpośrednio przed powlekaniem.
  4. Roztwory stokowe czynników wzrostu (50-100X): rozpuszczenie czynnika wzrostu w stężeniu 10 μg/ml w sterylnym buforze (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerolu, 1XPBS) i przechowywanie w aliquotach 50-10 μl/probówkę w temperaturze -80°C.
  5. Pożywka HESC: DMEM/F12 lub KO-DMEM (80%), zamiennik surowicy KO (20%), L-alanylo-L-glutamina lub L-glutamina (2 mM), nieessentialne aminokwasy MEM (MNAA, 1X) oraz β-merkaptoetanol (10 μM), przefiltrowana i przechowywana w temperaturze 4°C, suplementowana bFGF w stężeniu 20 ng/ml przed użyciem. Alternatywnie, po zastąpieniu „zamiennika surowicy KO” składnikami zdefiniowanymi: DMEM/F12 lub KO-DMEM (10%), L-alanylo-L-glutamina lub L-glutamina (2 mM), MNAA (1X), niezbędne aminokwasy MEM (MEAA, 1X) oraz β-merkaptoetanol (10 μM), przefiltrowana i przechowywana w temperaturze 4°C, suplementowana przed użyciem bFGF (20 ng/ml), ludzką insuliną (20 μg/ml), kwasem askorbinowym (50 μg/ml), ludzką aktywiną A (50 ng/ml), ludzką albuminą/Albumaxem (10 mg/ml) oraz ludzką transferryną (8 μg/ml).
  6. Pożywka do różnicowania kardiologicznego HESC: DMEM/F12 (90%), zdefiniowane FBS (10%) oraz L-alanylo-L-glutamina lub L-glutamina (2 mM).
  7. Pożywka zawierająca nikotynamid (NAM): dodanie NAM do pożywki HESC lub pożywki do różnicowania kardiologicznego HESC do końcowego stężenia 10 mM, przefiltrowanie, przechowywanie w temperaturze 4°C i zużycie w ciągu 2 tygodni od przygotowania.

2. Powlekanie płytek

  1. Powlekanie płytek żelatyną: do płytek 6-dołkowych dodać 2,5 ml/dołek roztworu żelatyny i inkubować przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C.
  2. Powlekanie płytek lamininą: schłodzić płytki powleczone żelatyną i usunąć żelatynę, następnie do schłodzonych, żelatynizowanych płytek 6-dołkowych dodać 2,5 ml/dołek roboczego roztworu do powlekania Matrigel lub ludzką lamininą i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.

3. Pasażowanie i wysiewanie niezróżnicowanych hESC w warunkach zdefiniowanych

  1. Pozostaw kolonie hESC do wzrostu przez 5-7 dni, a następnie przenieś płytkę z hodowlą hESC pod mikroskop stereowy (podgrzej stoлик mikroskopu do 37°C) wewnątrz sterylnego komina laminarnego.
  2. Wybierz kolonie hESC do rozdzielenia. Pod względem morfologicznym kolonie te powinny zawierać > 75% niezróżnicowanych hESC (małe, zwarte komórki), zazwyczaj lekko nieprzezroczyste (bez białych skupisk komórek, bez przezroczystych komórek zróżnicowanych) z wyraźną krawędzią widoczną pod mikroskopem stereowym. Starannie obrysuj wybrane kolonie i usuń otaczającą je warstwę zróżnicowanych fibroblastów oraz wszelkie zróżnicowane części kolonii (jeśli występują), używając krawędzi sterylnej końcówki pipety P2 lub wyciągniętej kapilary szklanej.
  3. Usuń starą pożywkę zawierającą pływające, odspojone komórki zróżnicowane poprzez aspirację. Przemyj raz pożywką hESC (bez bFGF). Dodaj 3 ml/dołek świeżej pożywki hESC zawierającej 20 ng/ml bFGF.
  4. Podziel niezróżnicowane kolonie hESC na małe fragmenty i odspój je za pomocą sterylnej końcówki pipety lub wyciągniętej kapilary szklanej.
  5. Zbierz pożywkę zawierającą odspojone fragmenty kolonii do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przemyj płytkę raz, używając 1 ml/dołek pożywki hESC zawierającej 20 ng/ml bFGF, i połącz z pozostałym materiałem.
  6. Odsuń aspiracją roztwór Matrigelu lub lamininy ludzkiej z nowo przygotowanych, pokrytych płyt. Przenieś 4 ml/dołek pożywki hESC zawierającej fragmenty kolonii do płytki 6-dołkowej. Ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora, unikając wstrząsania, i pozostaw fragmenty kolonii do przylegnięcia na noc w wilgotnym inkubatorze przy 37°C i atmosferze 5% CO2.

4. Indukcja kardiogenna hESC w zdefiniowanym systemie hodowlanym z nikotynamidem

  1. W 3. dniu po wysianiu usunąć większość starej pożywki z każdej studzienki płytki, pozostawiając ilość wystarczającą do zanurzenia kolonii hESC (nigdy nie dopuszczać do wyschnięcia hESC). Zastąpić ją 4 ml/well świeżej pożywki hESC zawierającej 20 ng/ml bFGF oraz 10 mM nikotynamidu (NAM).
  2. Wymieniać starą pożywkę na świeżą pożywkę hESC zawierającą 20 ng/ml bFGF i 10 mM NAM co drugi dzień, pozwalając na wzrost kolonii hESC indukowanych w kierunku kardiogenicznym do 8–10. dnia. Po wystawieniu na działanie NAM wszystkie komórki w kolonii przejdą zmiany morfologiczne w duże komórki zróżnicowane, które będą nadal się mnożyć. Kolonie zwiększą swój rozmiar, a w 8–10. dniu komórki zaczną spiętrzać się w niektórych obszarach kolonii.

5. Kontynuacja różnicowania kardiomiocytów w hodowli zawiesinowej

  1. Przenieś płytkę z hodowlą hESC pod sterylny dygestorium do mikroskopu stereoskopowego (wstępnie podgrzej stół mikroskopu do 37°C). Starannie obrysuj kolonie i usuń warstwę fibroblastów otaczającą kolonię (zróżnicowane komórki, które wywędrowały z kolonii), używając krawędzi sterylnego tipsa P2 lub wyciągniętej kapilary szklanej.
  2. Usuń starą pożywkę zawierającą pływające, oderwane komórki fibroblastów poprzez aspirację. Przepłucz raz pożywką hESC (bez bFGF). Dodaj 3 ml/studzienkę świeżej pożywki hESC (bez bFGF).
  3. Podziel kolonie hESC indukowane w kierunku kardiomiocytów na małe fragmenty i oddziel je za pomocą sterylnego tipsa lub wyciągniętej kapilary szklanej.
  4. Zbierz pożywkę zawierającą oderwane fragmenty kolonii do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przepłucz płytkę raz, używając 1 ml/studzienkę pożywki hESC (bez bFGF), i połącz z pozostałym materiałem.
  5. Przenieś a laikwoty po 4 ml/studzienkę bezserumowej pożywki hESC zawierającej fragmenty kolonii na płytkę 6-dołkową o ultraniskim stopniu przylegania (ultralow attachment plate) i inkubuj w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C przez 4-5 dni, aby umożliwić formowanie się pływających skupisk komórkowych (kardioblastów).

6. Dojrzewanie fenotypu bijących kardiomiocytów w hodowli adhezyjnej

  1. Połączyć pożywki zawierające pływające kardioblasty w probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Wirować przy 1400 rpm przez 5 min. Odessać jak najwięcej starej pożywki i dodać taką samą objętość świeżej pożywki do różnicowania kardiologicznego hESC zawierającej 10 mM NAM.
  2. Wymieszać pływające kardioblasty poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie nanieść po 4 ml/dołek na płytki 6-dołkowe. Przenieść płytki do inkubatora z wilgotnym powietrzem w temperaturze 37°C, aby umożliwić przyleganie kardioblastów przez noc.
  3. Wymieniać pożywkę do różnicowania kardiologicznego hESC zawierającą 10 mM NAM co drugi dzień.
  4. W 8. dniu zastąpić pożywkę pożywką do różnicowania kardiologicznego hESC bez NAM i kontynuować wymianę pożywki do różnicowania kardiologicznego hESC co drugi dzień. Bijące kardiomiocyty zaczną pojawiać się po około 1-2 tygodniach ciągłej hodowli po odstawieniu NAM; ich liczba będzie z czasem wzrastać, a komórki mogą zachować silne i rytmiczne skurcze przez ponad 3 miesiące.

7. Reprezentatywne wyniki:

Nikotynamid (NAM) w odpowiednim stężeniu indukuje przejście ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) utrzymywanych w zdefiniowanym systemie hodowlanym ze stanu pluripotencji wyłącznie w kierunku fenotypu kardiomezodermalnego (Ryc. 2B). Po wystawieniu niezróżnicowanych hESCs na NAM, wszystkie komórki w kolonii przechodzą zmiany morfologiczne w duże zróżnicowane komórki, które wykazują obniżoną ekspresję Oct-4 i zaczynają ekspresować specyficzny dla serca czynnik transkrypcyjny (Csx) Nkx2.5 oraz α-aktyninę, co jest zgodne z fenotypem kardiomezodermy (Ryc. 2B). Zróżnicowane komórki te nadal się mnożą, a kolonie zwiększają swój rozmiar. Zwiększoną intensywność Nkx2.5 obserwuje się zazwyczaj w obszarach kolonii, w których komórki zaczynają się spiętrzać (Ryc. 2B). Po odklejeniu, hESCs traktowane NAM tworzą pływające skupiska komórkowe (kardioblasty) w hodowli zawiesinowej, aby kontynuować proces różnicowania w kierunku tkanki serca. Po umożliwieniu przyczepienia się kardioblastów i kontynuowaniu traktowania NAM przez 1 tydzień, bijące kardiomiocyty zaczynają pojawiać się w ciągu około 1-2 tygodni ciągłej hodowli po wycofaniu NAM, z drastycznym wzrostem wydajności w porównaniu do spontanicznego różnicowania wieloliniowego hESCs bez traktowania w tym samym okresie czasu (Ryc. 2C). Komórki w skupiskach bijących kardiomiocytów będą wykazywać markery charakterystyczne dla kardiomiocytów, w tym Nkx2.5 i α-aktyninę (Ryc. 2C). Skurcze bijących kardiomiocytów zostały potwierdzone profilami elektrycznymi jako silne, rytmiczne, dobrze skoordynowane i zsynchronizowane, z regularnymi impulsami przypominającymi kompleksy p-QRS-T widoczne z elektrod powierzchniowych w klinicznych elektrokardiogramach (Ryc. 2C, patrz również w Video). Kardiomiocyty mogły zachować silną kurczliwość przez ponad 3 miesiące.

Schemat różnicowania komórek pluripotencjalnych; metoda indukcji; proces rozwoju specyficzny dla danej linii komórkowej.
Rysunek 1Ogólne schematy podejścia konwencjonalnego w porównaniu z podejściem opartym na indukcji małymi cząsteczkami w celu różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w wyspecjalizowane komórki funkcjonalne. (A) Schemat konwencjonalnego podejścia wykorzystującego wieloliniowe różnicowanie ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych poprzez spontaniczną różnicowanie warstw zarodkowych. (B) Schemat kontrolowanej i wydajnej indukcji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych wyłącznie w kierunku konkretnej, istotnej klinicznie linii komórkowej poprzez proste podanie cząsteczek sygnałowych.

Proces różnicowania kardiogennego; barwienie Oct-4, Nkx2.5; wyniki skupisk kardiomiocytów; wykres osi czasu.
Rycina 2. Nikotynamid indukuje bezpośrednią specyfikację linii sercowej z pluripotencji w określonych warunkach oraz progresję w kierunku bijących kardiomiocytów. (A) Schemat przedstawiający oś czasu protokołu ukierunkowanego różnicowania hESCs w kierunku kardiologicznym. (B) Po poddaniu nieróżnicujących się hESC działaniu nikotyniamidu (NAM) w zdefiniowanym systemie hodowlanym, w obrębie kolonii zaczęły pojawiać się duże różnicujące się komórki wykazujące brak ekspresji Oct-4 (czerwony), w porównaniu z kontrolnymi hESC poddanymi pozornej obróbce (DMSO). Komórki Oct-4-ujemne indukowane przez NAM zaczęły wykazywać ekspresję Nkx2.5 (zielony) oraz $\alpha$-aktyniny (czerwony), co jest zgodne z wczesną różnicą sercową. Stopniowy wzrost intensywności sygnału Nkx2.5 zazwyczaj obserwowano w obszarach kolonii, w których komórki zaczęły się spiętrzać. Wszystkie komórki są zaznaczone barwieniem ich jąder DAPI (niebieski). (C) hESC ukierunkowane na linię kardiologiczną pod wpływem NAM dały bijące kardiomiocyty z drastycznym wzrostem wydajności, co oceniono na podstawie skupisk komórkowych wykazujących rytmiczne skurcze (patrz profil elektrofizjologiczny i filmy) oraz immunoreaktywności w stosunku do Nkx2.5 (zielony) i α-aktyniny (czerwony). Przedstawiono obrazy fazokontrastowe reprezentatywnych dużych bijących skupisk kardiomiocytów oraz obrazy przy większym powiększeniu reprezentatywnych kurczących się mięśni sercowych (patrz również odpowiadające im filmy). Strzałki wskazują duże bijące skupisko kardiomiocytów wykorzystane do rejestracji elektrofizjologicznej. Profil elektrofizjologiczny bijących kardiomiocytów wykazuje regularne, zsynchronizowane, rytmiczne impulsy przypominające kompleksy p-QRS-T obserwowane w klinicznych elektrokardiogramach. Paski skali: 0,1 mm.

Filmy: Kurczące się kardiomiocyty zróżnicowane z hESC indukowanych NAM. Filmy 1 i 2 przedstawiają reprezentatywne duże, bijące skupiska kardiomiocytów około 1 i 3 miesiąca po przytwierdzeniu. Filmy 3 i 4 pokazują reprezentatywne kurczące się mięśnie serca przy większym powiększeniu. Film 5 przedstawia typowe małe, bijące skupisko kardiomiocytów, które zróżnicowało się spontanicznie z hESC bez zastosowania NAM w celu kontroli.

Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 1.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 2.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 3.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 4.
Kliknij tutaj, aby obejrzeć Wideo 5.

Dyskusja

Jednym z głównych wyzwań zarówno dla badań rozwojowych, jak i translacji klinicznej było znalezienie sposobu, aby efektywnie i przewidywalnie nakierować szeroki potencjał różnicowania pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych na pożądany fenotyp. Chociaż komórki te mogą różnicować się spontanicznie in vitro w komórki wszystkich trzech listków zarodkowych, przechodząc przez etap agregatów wieloliniowych, w agregatach wieloliniowych pochodzących z hESC (ciałach zarodkowych) tylko bardzo mała frakcja komórek (<2%) różnicuje się spontanicznie w kardiomiocyty13-15 (Ryc. 1A). Po immunoselekcji wzbogacone populacje kardiomiocytów były w stanie pełnić funkcję biologicznych rozruszników serca, przywracając funkcję uszkodzonego mięśnia sercowego mechanicznie i elektronicznie po wstrzyknięciu do serca modeli zwierzęcych13. W modelach niedokrwiennych u gryzoni wszczepione progenitory sercowe pochodzące z hESC były w stanie przeżyć i dojrzewać do 12 tygodni, a także częściowo remuskularyzować uszkodzone serce i poprawić funkcję skurczową14,15. Jednakże niska wydajność generowania ludzkich komórek zdeterminowanych na linię sercową poprzez różnicowanie wieloliniowe komórek pluripotencjalnych oraz wysokie ryzyko tumorigeniczności po transplantacji utrudniały dalszą translację kliniczną. Opracowanie strategii pozwalających na wyłączne i przewidywalne nakierowanie szerokiego potencjału różnicowania pluripotencjalnych hESC na fenotyp sercowy jest kluczowe dla wykorzystania potencjału biologii hESC w obszarze serca. Aby osiągnąć jednolitą konwersję ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w konkretną linię, zastosowaliśmy zdefiniowany system hodowli zapewniający proliferację nieróżnicowanych hESC, aby zidentyfikować warunki dobrze kontrolowanej i wydajnej indukcji hESC wyłącznie w konkretną, istotną klinicznie linię poprzez proste podanie małych cząsteczek (Ryc 1B). Stwierdzono, że nikotynamid indukuje determinację linii sercowej bezpośrednio z pluripotencjalnych hESC w zdefiniowanej hodowli, co prowadzi do powstania bijących kardiomiocytów z wysoką wydajnością (Ryc. 2). Nkx2.5 jest ewolucyjnie konserwatywnym czynnikiem transkrypcyjnym homeoboksowym, niezbędnym do prawidłowego rozwoju serca, a mutacje w tym genie są związane z wrodzonymi wadami serca (CHD) u ludzi, które stanowią najczęstszą wadę wrodzoną16. Ekspresja Nkx2.5 jest najwcześniejszym markerem komórek prekursorowych serca u wszystkich dotychczas badanych kręgowców i jest niezbędna do prawidłowego przegrodzenia serca oraz formowania i dojrzewania układu przewodzącego16. U kręgowców początek i wzorzec wczesnej ekspresji Nkx2.5 mniej więcej pokrywają się z czasem i obszarem specyfikacji serca we wczesnej embriogenezie, a gen Nkx2.5 pozostaje eksponowany w sercu przez cały okres rozwoju16. W naszym modelu hESC NAM wydawał się wyzwalać indukcję sercową bezpośrednio z pluripotencjalnych hESC poprzez promowanie ekspresji specyficznego dla serca czynnika transkrypcyjnego Nkx2.5 w procesie, który może naśladować specyfikację kardiomezodermy z pluripotencjalnego epiblastu w ludzkiej embriogenezie serca. Przyszłe badania ujawnią genetyczne i epigenetyczne cząsteczki kontrolne w rozwoju ludzkiego serca jako alternatywy, co może utorować drogę do bezpośredniej kontroli i modulacji losu hESC za pomocą małych cząsteczek podczas wyprowadzania linii istotnych klinicznie dla terapii regeneracyjnych. Bez zastosowania NAM < 2% hESC ulegnie spontanicznej różnicowaniu w bijące kardiomiocyty12-15. Dzięki zastosowaniu NAM byliśmy w stanie wygenerować > 95% embrionalnych prekursorów serca i > 50% bijących kardiomiocytów z hESC utrzymywanych w zdefiniowanej hodowli, w procesie, który może naśladować ludzki embrionalny rozwój serca12. Niedawno znane geny determinujące los serca zostały wykorzystane do transdyferencjacji fibroblastów mysich w postnatalne bijące kardiomiocyty z niską wydajnością wynoszącą < 0,5%17, 18. Jednakże przeprogramowane komórki somatyczne były historycznie kojarzone z nieprawidłową ekspresją genów i przyspieszoną senescencją, co upośledzało ich użyteczność terapeutyczną19-21. Wreszcie, opracowany tutaj protokół ogranicza się do pluripotencjalnych hESC pochodzących z wewnętrznej masy komórkowej (ICM) lub epiblastu ludzkiego blastocysty4,5 i może nie mieć zastosowania do innych komórek pluripotencjalnych, w tym do ESC pochodzenia zwierzęcego, ESC pochodzących z wcześniejszego stadium moruli (osiem komórek)22 oraz komórek przeprogramowanych sztucznie23.

Oświadczenia

Autorzy deklarują konflikt interesów. XHP jest założycielem firmy Xcelthera. XHP i EYS posiadają prawa własności intelektualnej związane z hESC.

Podziękowania

XHP otrzymał wsparcie z grantów National Institute of Health (NIH) przyznanych przez National Institute on Aging (NIHK01AG024496) oraz The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ŻelatynaSigma-AldrichG1890
MatrigelBD Biosciences356231z obniżoną zawartością czynników wzrostu
Ludzka lamininaSigma-AldrichL6274
NikotynamidSigma-AldrichN0636
DMEM/F12Invitrogen10565042
DMEMInvitrogen31053036
DMEM-KOInvitrogen10829018
Zamiennik surowicy Knock-outInvitrogen10828028
roztwór nieessentialnych aminokwasów MEM (MNAA, 100X)Invitrogen11140050
roztwór aminokwasów MEM (MEAA, 100X)Invitrogen11130050
β-merkapto–etanolInvitrogen21985023
AlbumaxInvitrogen11020021
Kwas askorbinowySigma-AldrichA4403
Transferryna ludzkaSigma-AldrichT8158
Ludzki bFGFPeproTech IncAF-100-18B
Insulina ludzkaInvitrogen12585014
Ludzka aktywina APeproTech Inc120-14E
Zdefiniowana surowica wołowia (FBS)HycloneSH30073-03
płytka 6-dołkowa o ultraniskim przywieraniuCorning3471
płytka 6-dołkowaCorning3516

Bibliografia

  1. Jawad, H., Ali, N. N., Lyon, A. R., Chen, Q. Z., Harding, S. E., Boccaccini, A. R. Myocardial tissue engineering: a review. J. Tissue. Eng. Regen. Med. 1, 327-342 (2007).
  2. Passier, P., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453, 322-329 (2008).
  3. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev. 23, 53-68 (2009).
  4. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells. Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).
  5. J, J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. , 282-1145 (1998).
  6. Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).
  7. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nature Medicine. 12, 1259-1268 (2006).
  8. Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).
  9. Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
  10. Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
  11. Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2, 185-190 (2005).
  12. Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells. Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).
  13. Kehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber, I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
  14. Laflamme, M. A., Chen, K. Y., Naumova, A. V., Muskheli, V., Fugate, J. A., Dupras, S. K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O'Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E. A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C. E. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infracted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  15. Caspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson, L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts. J. Am. Coll. Cardiol. 50, 1884-1893 (2007).
  16. Akazawa, H., Komuro, I. Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5: Its role in cardiac development and diseases. Pharmacol. Ther. 107, 252-268 (2005).
  17. Leda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B. G., Srivastava, D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  18. Efe, J. A., Hilcove, S., Kim, J., Zhou, H., Ouyang, K., Wang, G., Chen, J., Ding, S. Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy. Nat. Cell. Biol. 13, 215-222 (2011).
  19. Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, 285-290 (2010).
  20. Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  21. Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence. Stem Cells. 28, 704-712 (2010).
  22. Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres. Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).
  23. Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Różnicowanie kardiologicznetraktowanie nikotynamidemgenerowanie kardiomiocytówpluripotencjalne komórki macierzystezdefiniowany system hodowlianaliza immunofluorescencyjnarejestracja elektrofizjologicznahodowla w zawiesinie
Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.