Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w nowotworach przy użyciu immunofluorescencji ilościowej

Summary

Tutaj opisujemy metodę ilościowego określania heterogeniczności molekularnej w histologicznych przekrojach materiału nowotworowego za pomocą ilościowej immunofluorescencji, analizy obrazu i statystycznej miary heterogeniczności. Metoda jest przeznaczona do stosowania w opracowywaniu i analizie biomarkerów klinicznych.

Abstract

Niejednorodność morfologiczna w obrębie pojedynczego guza jest dobrze rozpoznawana przez histopatologów w praktyce chirurgicznej. Chociaż często przybiera to formę obszarów wyraźnego różnicowania w rozpoznane podtypy histologiczne lub różne stopnie patologiczne, często występują bardziej subtelne różnice w fenotypie, które wymykają się dokładnej klasyfikacji (ryc. 1). Ostatecznie, ponieważ morfologia jest podyktowana przez podstawowy fenotyp molekularny, obszarom z widocznymi różnicami prawdopodobnie towarzyszą różnice w ekspresji białek, które koordynują funkcję i zachowanie komórek, a tym samym wygląd. Znaczenie widzialnej i niewidocznej (molekularnej) heterogeniczności dla rokowania jest nieznane, ale ostatnie dowody sugerują, że przynajmniej na poziomie genetycznym heterogeniczność istnieje w pierwotnym guzie^1,2, a niektóre z tych subklonów powodują przerzutową (a zatem śmiertelną) chorobę.

Ponadto, niektóre białka są mierzone jako biomarkery, ponieważ są celem terapii (na przykład ER i HER2 odpowiednio dla tamoksyfenu i trastuzumabu (Herceptin)). Jeśli białka te wykazują zmienną ekspresję w obrębie guza, odpowiedzi terapeutyczne mogą być również zmienne. Szeroko stosowane schematy punktacji histopatologicznej dla immunohistochemii albo ignorują, albo numerycznie homogenizują kwantyfikację ekspresji białek. Podobnie w technikach destrukcyjnych, w których próbki guza są homogenizowane (takich jak profilowanie ekspresji genów), informacje ilościowe mogą być wyjaśnione, ale informacje przestrzenne są tracone. Metody mapowania heterogeniczności genetycznej w raku trzustki opierały się albo na generowaniu zawiesiny pojedynczej^komórki3, albo na makrodysekcji⁴. W niedawnym badaniu wykorzystano kropki kwantowe w celu zmapowania morfologicznej i molekularnej heterogeniczności w tkance raka^{prostaty 5}, dostarczając dowodu na zasadę, że morfologia i mapowanie molekularne są wykonalne, ale nie udało się określić ilościowo heterogeniczności. Ponieważ immunohistochemia jest w najlepszym razie tylko półilościowa i podlega błędom systematycznym między obserwatorami i obserwatorami, potrzebne są bardziej czułe i ilościowe metodologie w celu dokładnego mapowania i ilościowego określenia niejednorodności tkanek in situ.

Opracowaliśmy i zastosowaliśmy eksperymentalną i statystyczną metodologię w celu systematycznego ilościowego określania niejednorodności ekspresji białek w całych sekcjach tkanek nowotworów, w oparciu o system Automatycznej Analizy Antytatywnej (AQUA)⁶. Skrawki tkanek są znakowane specyficznymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko cytokeratynom i celom zainteresowania, sprzężonymi z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem. Slajdy są obrazowane za pomocą skanera fluorescencyjnego całego slajdu. Obrazy są dzielone na setki do tysięcy kafelków, a następnie każdemu kafelkowi przypisywany jest wynik AQUA, który jest miarą stężenia białka w nabłonkowym (guzowym) składniku tkanki. Mapy cieplne są generowane w celu przedstawienia ekspresji tkanek białek i przypisanego wyniku niejednorodności, przy użyciu statystycznej miary heterogeniczności pierwotnie stosowanej w ekologii, w oparciu o wskaźnik bioróżnorodności^{Simpsona 7}.

Do tej pory nie podjęto żadnych prób systematycznego mapowania i ilościowego określenia tej zmienności w połączeniu z ekspresją białek w preparatach histologicznych. W tym miejscu przedstawiono pierwsze zastosowanie metody zastosowanej do ekspresji biomarkerów ER i HER2 w raku jajnika. Zastosowanie tej metody toruje drogę do analizy heterogeniczności jako zmiennej niezależnej w badaniach ekspresji biomarkerów w badaniach translacyjnych, w celu ustalenia znaczenia heterogeniczności w rokowaniu i przewidywaniu odpowiedzi na terapię.

Protocol

1. Przygotowanie tkanek

1. Mikrotomia
   1. Wycinaj bloki nowotworowe osadzone w parafinie w formalinie o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu obrotowego.
   2. Umieść skrawki na dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych.
   3. Szkiełka inkubować w piekarniku o temperaturze 37 °C przez noc.
2. składowanie
   1. Przechowywać skrawki w zamrażarce o temperaturze od -18 °C do -25 °C, aby zapobiec utracie antygenowości.

2. Immunofluorescencja skrawków tkanek

1. Deparafiacja i nawodnienie
   1. Odwoskowanie wsuwa ksylen dwa razy przez 5 minut.
   2. Nawilżaj wsuwki w 99%, 99%, 80%, 50% etanolu i bieżącej wody z kranu przez 2 minuty każdego z nich.
2. Pobieranie antygenu
   1. Przeprowadzić indukowane ciepłem pobieranie antygenu przy użyciu 0,15 mM cytrynianu sodu, buforu pH 6,0 w szybkowarze przez 5 minut w kuchence mikrofalowej.
   2. Schładzanie zjeżdżalni przez 20 min.
   3. Płucz szkiełka w 0,05% PBST przez 5 minut na bujaku.
3. Procedura blokowania
   1. Traktuj skrawki w 3% nadtlenku wodoru przez 10 minut.
   2. Płucz szkiełka w 0,05% PBST przez 5 minut na bujaku.
   3. Dodaj skrawki do stojaka Sequenza Immunostaining.
   4. Traktuj skrawki w bloku białkowym wolnym w surowicy przez 10 minut.
4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
   1. Inkubować przeciwciało pierwotne rozcieńczone do optymalnego rozcieńczenia w rozcieńczalniku przeciwciał Dako przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   2. Płukać w 0,05% PBST trzy razy przez 5 minut każdy.
5. Inkubacja maski nabłonkowej (Cytokeratyna)
   1. Inkubować mysią cytokeratynę anty-pan, rozcieńczoną w stosunku 1:50 w rozcieńczalniku przeciwciał Dako przez noc w temperaturze 4 °C.
6. Wizualizacja maski nabłonkowej
   1. Przygotować rozcieńczenie 1:25 koziego przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszemu Alexa555 we wstępnie rozcieńczonym roztworze przeciwciała HRP kozy-królika Envision. Inkubuj szkiełka w ciemności przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
   2. Płukać w 0,05% PBST trzy razy przez 5 minut każdy.
7. Wizualizacja docelowa
   1. Przenieś szkiełka z Sequenzy do komory wilgotnościowej.
   2. Połączyć rozcieńczalnik wzmacniający sygnał docelowy (wanna HistoRx E) i tyramid Cy5 (lampa HistoRx F) w stężeniu 1:50. Wirować, aby dokładnie wymieszać. Inkubować szkiełka w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Płukać w 0,05% PBST trzy razy przez 5 minut każdy.
   4. Odwodnić szkiełka w 80% etanolu przez 1 min.
   5. Suche ślizgi na powietrzu w ciemności.
8. Przeciwbarwienie i szkiełko nakrywkowe
   1. Nałóż podłoże mocujące DAPI na szkiełka nakrywkowe i umieść szkiełka nakrywkowe na skrawkach tkanki.
   2. Suszyć zjeżdżalnie przez noc w ciemności.
   3. Po wyschnięciu szkiełek zabezpiecz je lakierem do paznokci, aby zapewnić długotrwałą konserwację i przechowuj w lodówce o temperaturze 4 °C.

3. Przechwytywanie obrazu za pomocą skanowania całego przekroju

1. Załaduj do pięciu slajdów do kasety na slajdy skanera do slajdów Aperio ScanScope FL.
2. Dla każdego slajdu wybierz region ogólny, który chcesz wykonać zdjęcie, korzystając z interfejsu w konsoli ScanScope. Wybierz obszar, który ma objąć całą tkankę na szkiełku, niezależnie od wzoru barwienia lub innych obserwowalnych aspektów próbki.
3. Korzystając z konsoli ScanScope Console, dla każdego kanału (DAPI, Cy3 i Cy5) określ optymalną ekspozycję w następujący sposób:
   1. Wybierz obszar tkanki do zbadania - ten obszar powinien najlepiej znajdować się w obszarze guza tkanki, aby zapewnić najlepszą reprezentację.
   2. Korzystając z funkcji automatycznej ekspozycji w konsoli ScanScope, oceń sugerowany czas ekspozycji dla każdego kanału wraz z ostrością obrazu.
   3. Powtórz do 3-5 obszarów każdej próbki, aby potwierdzić stabilność wartości.
4. Wybierz dodatkowy obszar (pokazany przez niebieski romb na obrazie konsoli skanera) z dala od tkanki, ale nadal w zakrytym obszarze szkiełka, aby zdefiniować obszar tła, w którym zostaną uzyskane obrazy korekcji płaskiego pola dla każdego filtra.
5. Przejrzyj te obrazy przed ich pobraniem. Jeśli obrazy wydają się mieć wysokie tło lub inne artefakty obrazu, obszar obrazu powinien zostać przesunięty i uzyskane nowe obrazy.
6. Pozyskane obrazy slajdów cyfrowych są automatycznie przesyłane do bazy danych Aperio Spectrum.

4. Automatyczna analiza obrazu AQUA

1. Przeglądaj cyfrowe obrazy całych slajdów w bazie danych Spectrum i dodawaj adnotacje do obszarów zainteresowania guza w kontekście całej tkanki i wzorów barwienia.
2. Wybierz slajd do analizy za pomocą AQUAnalysis z cyfrowej listy slajdów w bazie danych Spectrum, klikając dwukrotnie obraz miniatury (alternatywnie zaznacz pole wyboru obok obrazu, a następnie wybierz opcję "Wyświetl obrazy" z menu u góry listy). Spowoduje to automatyczne otwarcie oprogramowania ImageScope i scalonego kolorystycznie obrazu próbki tkanki.
3. Użyj tego oprogramowania, aby poruszać się po obrazie za pomocą dostarczonych narzędzi.
4. Korzystając z dołączonego H&E (fizycznego slajdu lub obrazu z adnotacjami), opisz obszar zainteresowania na obrazie fluorescencyjnym. Wiele obszarów zainteresowania, pojedynczych obszarów zakreślonych, można wybrać w jednej próbce. Istnieje również narzędzie "negatywne", które służy do wykluczania obszarów w obrębie wybranego regionu (np. uszkodzonej tkanki, obszarów o słabej histologii, obszarów nienowotworowych, gruzów itp.).
5. Zapisz warstwy adnotacji na obrazie.
6. Wróć do menu głównego Spectrum i zaznacz pole wyboru obok obrazu, który właśnie został opisany. Wybierz "Analizuj" z paska menu u góry listy.
7. W oknie Analiza, które się pojawi, wybierz "HistoRx AQUA Analysis" z menu rozwijanego.
8. Jeśli istnieje wiele warstw adnotacji, użyj pól wyboru, aby wybrać odpowiednie warstwy do analizy.
9. Naciśnij przycisk "Analizuj", gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia.
10. W tym momencie na pasku zadań systemu Windows pojawi się zminimalizowane okno konsoli. Spowoduje to wyświetlenie postępu przesyłania obrazów z bazy danych Spectrum do lokalnego komputera (operacja "pull").
11. Po przesłaniu danych zostanie uruchomiony program AQUAnalysis. Użytkownik może następnie korzystać ze wszystkich wewnętrznych funkcji oprogramowania do przeglądania, nawigacji i analizowania obrazów.
12. Obszar obrazu z adnotacjami z bazy danych Spectrum jest podzielony na kafelki obrazu o wymiarach 512x512 pikseli - każdy z nich będzie oceniany indywidualnie.
13. W tym badaniu wykorzystano nienadzorowany algorytm punktacji AQUA, oparty na grupowaniu danych⁸. W tym algorytmie wyniki AQUA są generowane w następujący sposób:
    1. Sygnał obrazu pan-cytokeratyny jest przenoszony powyżej tła, a te piksele są używane do zdefiniowania "maski" guza, która jest następnie wykorzystywana do dalszych obliczeń. Piksele pan-cytokeratyny o wysokiej ekspresji definiują również cytoplazmatyczne / niejądrowe regiony komórek nowotworowych.
    2. Piksele o wysokim sygnale w kanale DAPI, które znajdują się w masce nowotworowej, są identyfikowane jako jądrowe.
    3. Algorytm grupowania bada również piksele, które mają niską intensywność barwienia DAPI lub ekspresji cytokeratyny i próbuje częściowo przypisać je do przedziałów jądrowych lub cytoplazmatycznych lub tła.
    4. Gdy wszystkie piksele zostaną przypisane do jednego z przedziałów nowotworowych lub tła, intensywność sygnału z białka docelowego (ER lub HER2) jest następnie obliczana w każdym z przedziałów i normalizowana do wielkości przedziałów, tworząc w ten sposób wyniki AQUA.
    5. Obrazy, które nie miały wystarczającej reprezentacji guza, nie były oceniane (zgodnie z definicją tych, które miały mniej niż 5% pikseli reprezentujących guz). Regiony te generują również wartość "Wyniku końcowego" o nazwie "Niepowodzenie" i w ten sposób mogą zostać usunięte w kolejnych analizach statystycznych.
    6. Ponadto, jeśli po przeglądzie operator zidentyfikował pola, które nie nadawały się do oceny ze względu na artefakty próbki lub obrazowania (np. pofałdowana tkanka, szczątki), pola te były usuwane z punktacji i generowały "wynik końcowy" o nazwie "Niepowodzenie".
14. Wyniki punktacji AQUA to tabele wyników powiązanych z każdym kafelkiem pikseli o wymiarach 512x512 pikseli w obszarze zainteresowania w całej próbce przekroju tkanki. Te pliki, w . w formacie CSV, może być następnie wykorzystany do późniejszej analizy statystycznej.

5. Analiza statystyczna: Wszystkie analizy statystyczne są wykonywane w SPSS (IBM)

1. Tam, gdzie to możliwe, w przypadku dużych operacji należy wygenerować pliki kodów składni SPSS (.sps) w celu wykonywania czynności związanych z manipulacjami danymi i etapami analizy. Przykładowy kod składni jest dostarczany jako pliki uzupełniające.
2. Wczytywanie plików danych do programu SPSS. Usuń nieużywane zmienne z surowych danych (np. parametry specyficzne dla instrumentu, wyniki AQUA z niewykorzystanych przedziałów).
3. W przypadku regionów, w których "Wynik końcowy" to "Niepowodzenie" (patrz wyżej), należy oznaczyć te wartości jako SYSMIS, co spowoduje usunięcie ich z analiz numerycznych.
4. Zagreguj wszystkie dane dla wszystkich slajdów dla każdego znacznika (ER lub HER2) w jeden zestaw danych podstawowych w formacie SPSS. Ten plik główny jest używany do wszystkich kolejnych obliczeń.
5. Korzystając z pliku składni SPSS (po jednym dla każdego markera: ER lub HER2 (patrz dodatkowe pliki składniowe), dane zostały poddane dalszej walidacji, a wskaźniki różnorodności Simpsona obliczono w następujący sposób:
   1. Wygeneruj główny plik analityczny, aby zapobiec modyfikacji wcześniej wygenerowanego zestawu danych podstawowych.
   2. Sprawdź poprawność zestawu danych podstawowych względem wygenerowanych danych pierwotnych i obrazów.
   3. Tworzenie statystyk podsumowujących dla wyników AQUA dla każdej próbki (liczba pól, średni wynik, mediana wyniku, minimalny wynik, maksymalny wynik i odchylenie standardowe wyników dla próby).
   4. Sprawdź losową próbkę wyników z oryginalnymi plikami wyjściowymi danych nieprzetworzonych i z ocenionymi nieprzetworzonymi danymi obrazu.
6. Aby wygenerować obrazy mapy cieplnej (pokazane na rysunkach 2 i 3):
   1. "Podziel" dane punktacji AQUA (za pomocą funkcji "Visual Binning" w SPSS) na osiem indywidualnych poziomów. W przypadku ER zastosowano wyniki jądrowe, w przypadku HER2 zastosowano wyniki cytoplazmatyczne.
   2. Wyznacz pojemniki w taki sposób, aby każdy kosz reprezentował równy procent dostępnych obserwacji z całego zestawu danych.
   3. Użyj funkcji SPSS "Podziel plik", aby wszystkie kolejne dane wyjściowe były na poziomie "na slajd/próbkę".
   4. Wykreśl każdy region (odpowiadający kafelkowi o wymiarach 512x512) według jego współrzędnych x,y i pokoloruj go wartością odpowiadającą pojemnikowi, do którego został przydzielony (patrz rysunki 2 i 3).
7. Aby wygenerować wyniki heterogeniczności, napisano kod generujący indeks różnorodności Simpsona przy użyciu wyników AQUA.
   1. Używany tutaj indeks różnorodności Simpsona jest zdefiniowany jako:
      
      Gdzie N jest całkowitą liczbą wyników/pól wykorzystanych dla danej próby, a n jest liczbą wyników/pól w danej grupie standaryzowanych wyników (uzyskanych w sposób opisany poniżej).
8. Użyj głównego pliku analitycznego opisanego powyżej jako źródła danych. W przedstawionych przykładach we wszystkich obliczeniach ER wykorzystano jądrowy wynik AQUA, a w obliczeniach HER2 wykorzystano cytoplazmatyczny wynik AQUA. Wykonaj poniższe obliczenia dla każdej próbki/szkiełka.
9. Ponieważ dane fluorescencji podlegają niestabilności wariancji, tak że wielkość błędu rozchodzi się wraz z intensywnością, należy zastosować normalizację logarytmiczną (o podstawie 2) do wszystkich wyników AQUA.
10. Dalej przekształcaj znormalizowane (przekształcone logarytmicznie) dane w wyniki z (standardowe).
    1. Transformację Z-score oblicza się w następujący sposób: Z = (wynik AQUA - średnia wszystkich wyników dla próby)/odchylenie standardowe wyników dla próby. Przekłada to rozkład wyników na rozkład odchyleń wokół centralnej wartości zerowego odchylenia.
11. Podziel te wartości wskaźnika Z na sześć grup (<-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2, >2).
12. Oblicz liczbę wartości przydzielonych do każdego pojemnika i zsumuj dla każdego pojemnika. Użyj tej wartości wraz z łączną liczbą pól, aby obliczyć wartość dla każdego z sześciu pojemników używanych dla indeksu.
13. Zsumuj te wartości i odejmij od jednej, aby uzyskać indeks różnorodności.
14. Indeks różnorodności stanowi wskaźnik rozkładu wyników wokół średniej dla danej próby. W związku z tym wyższe indeksy wskazują na szerszy rozrzut wyników lub zwiększoną heterogeniczność ekspresji. I odwrotnie, niższe wskaźniki wskazują na mniejszą zmienność w pomiarze ekspresji i jednorodną ekspresję w próbie. Zostało to zilustrowane na rysunkach 2 i 3.

6. Reprezentatywne wyniki:

Terapia celowana środkami o stosunkowo niskiej toksyczności, takimi jak tamoksyfen i trastuzumab, nie jest standardem opieki dla pacjentek z rakiem jajnika. Istnieją dobre dowody na to, że chemioterapia pierwszego rzutu platyną i taksanem jest lepsza od innych schematów chemioterapii raka jajnika^9-13 i chociaż 70-80% pacjentek początkowo reaguje na leczenie, większość z nich nawraca i umiera z powodu choroby. Pomiar biomarkerów, które mogą przewidywać odpowiedź na alternatywne terapie, byłby przydatny w doborze zindywidualizowanej terapii dla każdego pacjenta, a ponieważ chemioterapia wywiera presję selekcyjną na guz, komórki nowotworowe, które przeżyły, mogą mieć różne cechy i reprezentować subpopulację guza przed terapią; Kwantyfikacja tej zmiany może być zatem przydatna. Zastosowaliśmy nasze podejście do mapowania heterogeniczności do ekspresji ER i HER2 w próbkach raka jajnika przed i po chemioterapii, w celu zmierzenia ilościowych zmian ekspresji i oceny związku między ekspresją biomarkerów przed i po terapii. Zarówno ER, jak i HER2 wykazują wyraźną heterogeniczność w obrębie poszczególnych nowotworów, a w niektórych nowotworach indeks Simpsona zmienia się po terapii ze stosunkowo wysokiej heterogeniczności na niską heterogeniczność, reprezentowaną przez malejące wyniki indeksu Simpsona (patrz ryc. 2 i 3). Potwierdza to pogląd, że selekcja klonalna zachodzi w odpowiedzi na chemioterapię cytotoksyczną; Co ważniejsze, można to wykorzystać za pomocą terapii celowanej przeciwko pozostałej populacji, w celu lepszej personalizacji terapii dla pacjentów z rakiem.

Rysunek 1. Mikrofotografie barwione hematoksyliną i eozyną różnych obszarów tego samego raka jajnika o zmiennej morfologii. (A) mikrofotografia x40 pokazuje dwa sąsiadujące ze sobą obszary guza o różnej morfologii. Widoki o dużej mocy (x200) ujawniają komórki z oczyszczaniem cytoplazmatycznym i solidnym wzorcem wzrostu w górnej części guza (B), podczas gdy dolna część tkanki (C) ma bardziej jednorodną cytoplazmę eozynofilową i brodawkowaty wzór wzrostu. Guz ten zostałby jednak sklasyfikowany jako surowiczy brodawkowaty podtyp histologiczny dla celów dalszego leczenia.

Rysunek 2. Heterogeniczne mapy cieplne ekspresji białka ER w tkance raka jajnika z dodatnim cytokeratyną, przed (górny panel) i po (dolny panel) terapii.

Rysunek 3. Heterogeniczne mapy cieplne ekspresji białka HER2 w tkance cytokeratyno-dodatniego raka jajnika, przed (górny panel) i po (dolny panel) terapii.

Discussion

Opisana tu metoda pozwala na ilościowe określenie niejednorodności molekularnej w standardowych utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie przekrojach histologicznych materiału nowotworowego. Metoda ta pozwala na przypisanie wartości do stopnia niejednorodności w przekroju tkanki, tak aby można ją było następnie uwzględnić jako zmienną w opracowywaniu i analizie biomarkerów. Chociaż ogólnie rzecz biorąc, zaleca się, aby biomarkery tkankowe były jednorodne pod względem ekspresji, tak aby test był mniej podatny na błąd próbkowania lub błąd systematyczny, w pewnych okolicznościach przydatne może być ilościowe określenie niejednorodności jako parametru. Na przykład, jak pokazano w przykładzie ilustracyjnym dla ER i HER2, powszechne biomarkery wykazują znaczną niejednorodność ekspresji i obecnie nie wiadomo, czy stanowi to niezależny czynnik prognostyczny czy predykcyjny w odniesieniu do, odpowiednio, wyniku klinicznego lub odpowiedzi na leczenie. Podobnie, jak pokazano, sama terapia może dynamicznie zmieniać populacje składowe komórek, a zatem pomiar docelowego wzbogacenia może być przydatny w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia.

Technika ta jest jednak ograniczona tymi samymi czynnikami, które ograniczają tradycyjne analizy histopatologiczne lub biomarkerowe (takie jak immunohistochemiczne). Wynik zależy od rodzaju, wielkości i jakości analizowanej tkanki, dlatego pojedynczy wycinek tkanki może nie być reprezentatywny dla całego guza. Rzeczywiście, indeks Simpsona może być nadmiernie obciążony rozmiarem tkanki (liczba przechwyconych klatek i zmierzone wyniki AQUA). Immunogenność mierzonych epitopów może podlegać niekontrolowanym czynnikom przedanalitycznym, które sztucznie zmieniają ich ekspresję w całym wycinku tkanki (takich jak czas zimnego niedokrwienia lub długość utrwalenia i artefakt krawędzi). Jest to szczególnie problematyczne w przypadku fosfoepitopów, które są notorycznie labilne^{14, 15}. W związku z tym technika ta może być lepiej dopasowana do resekcji próbek niż małych biopsji i wykonywana na wielu sekcjach, a nie tylko na jednej. Ostatecznie techniki obrazowania 3D mogą dać możliwość lepszego ilościowego określenia tego parametru.

Przedstawiona technika może być również ograniczona przez czynniki biologiczne, takie jak zmienność ekspresji epitopu maskującego cytokeratynę. Może to być szczególnie niepokojące w przypadku tych nowotworów, w tym raka jajnika i raka piersi, które przechodzą przemianę nabłonkowo-mezenchymalną (EMT) lub są wzbogacone o składniki nienabłonkowe lub komórki macierzyste¹⁶, jak ostatnio wykazano w raku jajnika leczonym chemioterapią in vitro¹⁷ oraz u pacjentek z rakiem piersi w odpowiedzi na terapię¹⁸. To ograniczenie można przezwyciężyć za pomocą alternatywnych przeciwciał maskujących (lub koktajli przeciwciał), takich jak cytokeratyna plus wimentyna, która jest regulowana w górę w EMT¹⁶. Ponadto, ponieważ inne składniki tkanki (mikrośrodowisko), takie jak fibroblasty lub komórki śródbłonka naczyń krwionośnych, są również coraz częściej celem terapii biologicznych, technika ta może zostać również rozszerzona o ocenę tych składników, przy użyciu specjalnych masek dla interesujących przedziałów, takich jak PECAM/CD31 do barwienia komórek śródbłonka naczyń krwionośnych.

Chociaż adaptacja indeksu Simpsona została wykorzystana jako miara heterogeniczności w obecnym protokole ze względu na jego prostotę, można zastosować inne miary niejednorodności, takie jak proste pomiary tendencji centralnej (średnia, wariancja, mediana itp.). Ponadto obliczenia indeksu Simpsona mogą być modyfikowane, aby lepiej pasowały do konkretnej populacji testowej. Zastosowanie transformacji Z-score pozwala na lepsze zastosowanie punktacji dla wielu markerów, ponieważ niejednorodność opiera się na odchyleniu wokół średniej dla zbioru danych. Jednak ogólny zakres punktacji może być ograniczony w tego typu transformacji. Niektóre projekty mogą być lepiej przystosowane do prostego wrzucania rzeczywistych wyników AQUA do kosza dla wszystkich próbek określonego zestawu markerów. Wybór liczby przedziałów i punktów odcięcia jest również ograniczeniem w zakresie wartości, które mogą wynikać i mogą być zoptymalizowane dla alternatywnych projektów eksperymentalnych.

W obecnym badaniu wykorzystaliśmy ER i HER2 jako potencjalne biomarkery, ponieważ są one już stosowane w klinice, pomagają odpowiedzieć na istotne pytania kliniczne dotyczące skuteczności terapii celowanych i wiadomo, że wykazują znaczną heterogeniczność i zmiany w chorobie pierwotnej i odległej¹⁹. Nie do ustalenia pozostaje jednak optymalny marker heterogeniczności. Inne możliwości mogą obejmować cytogenetyczne markery klonalności, takie jak te wcześniej wykorzystywane w międzyfazowych badaniach FISH²⁰. Podejście to wymaga dalszej walidacji w dużych, dobrze opisanych kohortach klinicznych lub badaniach klinicznych w celu dalszego ustalenia znaczenia tego parametru w biologii nowotworów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ScanScope FL	Aperio Technologies	ScanScope FL	Używany zgodnie z wyposażeniem dostawcy
Spectrum	Aperio Technologies	Konfiguracja widma	i numery katalogowe będą się różnić w zależności od tego, jak lokalne instytucje konfigurują swoje bazy danych i strukturę IT.
AQUAnalysis, w połączeniu z AQUAjustment	HistoRx	V2.3	Pakiet AQUAjustment umożliwia AQUAnalysis korzystanie z obrazów przechowywanych w Spectrum.
HER2	Dako	A0485	1 na 400
mysia cytokeratyna o	Dako	M3515	Rozcieńczalnik 1 na 50
Rozcieńczalnik przeciwciał		Dako S0809
Envision kozio-królik HRP	Dako	K4003
Blok białkowy	Dako	X0909
Koza anty-mysz Alexa555	Invitrogen	A21422
Nośnik montażowy DAPI	Invitrogen	P36931
Cy5 Tyramid	HistoRx	AQ-EMR1-00001
Centrum barwienia immunologicznego Sequenza	Thermo Fisher Scientific, Inc.	73300001	Używany tutaj do barwienia immunofluorescencyjnego na stole