Artykuł metodologiczny

Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w guzach z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji

20.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3334

⸱

25 października 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pathology, University of Edinburgh, 2HistoRx Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę ilościowego określania heterogeniczności molekularnej w przekrojach histologicznych materiału nowotworowego z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji, analizy obrazu oraz statystycznego miernika heterogeniczności. Metoda ta jest przeznaczona do zastosowania w opracowywaniu i analizie klinicznych biomarkerów.

Streszczenie

Heterogeniczność morfologiczna w obrębie pojedynczego guza jest dobrze znana histopatologom w praktyce chirurgicznej. Choć często przybiera ona formę obszarów o wyraźnym różnicowaniu w uznane podtypy histologiczne lub różny stopień złośliwości, często występują bardziej subtelne różnice fenotypowe, które wymykają się dokładnej klasyfikacji (Rycina 1). Ostatecznie, ponieważ morfologia jest determinowana przez podstawowy fenotyp molekularny, obszary z widocznymi różnicami prawdopodobnie wiążą się z różnicami w ekspresji białek sterujących funkcją i zachowaniem komórek, a tym samym ich wyglądem. Znaczenie widocznej i niewidocznej (molekularnej) heterogeniczności dla rokowań pozostaje nieznane, jednak niedawne dowody sugerują, że przynajmniej na poziomie genetycznym heterogeniczność występuje w guzie pierwotnym1,2, a niektóre z tych subklonów dają początek przerzutowej (a zatem śmiertelnej) chorobie.

Ponadto niektóre białka są mierzone jako biomarkery, ponieważ stanowią one cele terapii (na przykład ER i HER2 odpowiednio dla tamoksyfenu i trastuzumabu (Herceptin)). Jeśli białka te wykazują zmienną ekspresję w obrębie guza, odpowiedzi terapeutyczne również mogą być zmienne. Powszechnie stosowane schematy oceny histopatologicznej dla immunohistochemii albo pomijają, albo ujednolicają numerycznie kwantyfikację ekspresji białek. Podobnie w technikach destrukcyjnych, w których próbki guza są homogenizowane (takich jak profilowanie ekspresji genów), można uzyskać informacje ilościowe, ale tracone są informacje przestrzenne. Podejścia do mapowania heterogeniczności genetycznej w raku trzustki opierały się albo na generowaniu zawiesiny pojedynczych komórek3, albo na makrodysekcji4. W niedawnym badaniu wykorzystano kropki kwantowe w celu zmapowania heterogeniczności morfologicznej i molekularnej w tkance raka prostaty5, co stanowiło dowód koncepcji, że mapowanie morfologiczne i molekularne jest wykonalne, jednak nie doprowadziło do kwantyfikacji tej heterogeniczności. Ponieważ immunohistochemia jest w najlepszym razie jedynie półilościowa i obarczona błędem wewnątrz- i międzyobserwatorowym, wymagane są bardziej czułe i ilościowe metodologie, aby dokładnie mapować i kwantyfikować heterogeniczność tkanek in situ.

Opracowaliśmy i zastosowaliśmy eksperymentalną i statystyczną metodologię w celu systematycznego określenia stopnia heterogeniczności ekspresji białek w całych przekrojach tkanek nowotworowych, w oparciu o system Automated QUantitative Analysis (AQUA)6. Przekroje tkanek są znakowane specyficznymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko cytokeratynom oraz interesującym badacza celom, sprzężonym z wtórnymi przeciwciałami znakowanymi fluorochromami. Preparaty są obrazowane przy użyciu skanera fluorescencyjnego do całych slajdów. Obrazy są dzielone na setki lub tysiące kafelków, a każdemu kafelkowi przypisywany jest wynik AQUA, który stanowi miarę stężenia białka w obrębie komponentu nabłonkowego (nowotworowego) tkanki. Generowane są mapy ciepła reprezentujące ekspresję białek w tkance, a następnie przypisywany jest wynik heterogeniczności, przy użyciu statystycznej miary heterogeniczności pierwotnie stosowanej w ekologii, opartej na indeksie różnorodności biologicznej Simpsona7.

Do tej pory nie podejmowano prób systematycznego mapowania i ilościowego określania tej zmienności w powiązaniu z ekspresją białek w preparatach histologicznych. W niniejszej pracy prezentujemy pierwsze zastosowanie tej metody w analizie ekspresji biomarkerów ER oraz HER2 w raku jajnika. Wykorzystanie tej metody otwiera drogę do analizy heterogeniczności jako niezależnej zmiennej w badaniach translacyjnych nad ekspresją biomarkerów, w celu ustalenia znaczenia heterogeniczności w prognozie i przewidywaniu odpowiedzi na terapię.

Protokół

1. Przygotowanie tkanki

  1. Mikrotomia
    1. Wyciąć przekroje z utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie bloków nowotworowych o grubości 4 μm przy użyciu mikrotomu obrotowego.
    2. Umieścić przekroje na pozytywnie naładowanych szkiełkach mikroskopowych.
    3. Inkubować szkiełka w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Przechowywanie
    1. Przechowywać przekroje w zamrażarce w temperaturze od -18 °C do -25 °C, aby zapobiec utracie antygenowości.

2. Immunofluorescencja przekrojów tkankowych

  1. Odwoskowanie i rehydratacja
    1. Odwoskować preparaty w ksylenie dwukrotnie przez 5 min.
    2. Rehydratować preparaty kolejno w etanolu 9%, 9%, 80%, 50% oraz w bieżącej wodzie z kranu przez 2 min w każdym kroku.
  2. Odmaskowanie antygenów
    1. Przeprowadzić termiczne odmaskowanie antygenów, używając buforu cytrynian sodu 0.15 mM o pH 6.0 w szybkowarze w kuchence mikrofalowej przez 5 min.
    2. Schłodzić preparaty przez 20 min.
    3. Przepłukać preparaty w 0.05% PBST przez 5 min na kołysce.
  3. Procedura blokowania
    1. Traktować skrawki 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 min.
    2. Przepłukać preparaty w 0.05% PBST przez 5 min na kołysce.
    3. Umieścić skrawki w statywie do barwienia immunohistochemicznego Sequenza.
    4. Traktować skrawki bezserowym blokerem białkowym przez 10 min.
  4. Inkubacja z przeciwciałami pierwszorzędowymi
    1. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi do optymalnego stężenia w rozcieńczalniku do przeciwciał Dako przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. Przepłukać w 0.05% PBST trzy razy po 5 min.
  5. Inkubacja maski nabłonkowej (cytokeratyny)
    1. Inkubować z przeciwciałem mysim anty-pan cytokeratyna, rozcieńczonym 1:50 w rozcieńczalniku do przeciwciał Dako przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Wizualizacja maski nabłonkowej
    1. Przygotować rozcieńczenie 1:25 przeciwciała wtórnego koziego anty-mysiego Alexa55 w uprzednio rozcieńczonym roztworze przeciwciała Envision koza-królik HRP. Inkubować preparaty w ciemności przez 1,5 h w temperaturze pokojowej.
    2. Przepłukać w 0.05% PBST trzy razy po 5 min.
  7. Wizualizacja celu
    1. Przenieść preparaty z urządzenia Sequenza do komory wilgotnościowej.
    2. Połączyć rozcieńczalnik do amplifikacji sygnału celu (HistoRx probówka E) i tyramid Cy5 (HistoRx probówka F) w stężeniu 1:50. Wymieszać za pomocą vortexa. Inkubować preparaty w ciemności przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    3. Przepłukać w 0.05% PBST trzy razy po 5 min.
    4. Odwodnić preparaty w 80% etanolu przez 1 min.
    5. Wysuszyć preparaty na powietrzu w ciemności.
  8. Kontrastowanie i nakładanie szkiełek cover-slip
    1. Nanieść medium montażowe DAPI na szkiełka cover-slip i nałożyć szkiełka na skrawki tkanki.
    2. Suszyć preparaty przez noc w ciemności.
    3. Po wyschnięciu preparatów zabezpieczyć je lakierem do paznokci, aby zapewnić długoterminową konserwację, i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.

3. Przechwytywanie obrazów za pomocą skanowania całych skrawków

  1. Włóż do pięciu szkiełek do kasety skanera slajdów Aperio ScanScope FL.
  2. Dla każdego szkiełka wybierz ogólny obszar do obrazowania za pomocą interfejsu w konsoli ScanScope Console. Wybierz obszar obejmujący całą tkankę na szkiełku, niezależnie od wzoru barwienia lub innych obserwowalnych aspektów próbki.
  3. Używając konsoli ScanScope Console, określ optymalną ekspozycję dla każdego kanału (DAPI, Cy3 i Cy5) w następujący sposób:
    1. Wybierz obszar tkanki do analizy – obszar ten powinien w idealnym przypadku znajdować się w obrębie tkanki nowotworowej, aby zapewnić najlepszą reprezentację.
    2. Używając funkcji autoekspozycji w konsoli ScanScope Console, oceń sugerowany czas ekspozycji dla każdego kanału oraz ostrość obrazu.
    3. Powtórz czynność w 3–5 obszarach każdej próbki, aby potwierdzić stabilność wartości.
  4. Wybierz dodatkowy obszar (oznaczony niebieskim rombem na obrazie w konsoli ScanScope), oddalony od tkanki, ale wciąż w obrębie obszaru przykrytego szkiełkiem podstawowym, aby zdefiniować obszar tła, w którym zostaną pozyskane obrazy do korekcji pola płaskiego dla każdego filtra.
  5. Przejrzyj te obrazy przed właściwym pozyskaniem obrazów. Jeśli obrazy wykazują wysokie tło lub inne artefakty, należy przenieść obszar obrazowania i pozyskać nowe obrazy.
  6. Pozyskane cyfrowe obrazy szkiełek są automatycznie przesyłane do bazy danych Aperio Spectrum.

4. Zautomatyzowana analiza obrazów AQUA

  1. Przeglądaj cyfrowe obrazy całych preparatów w bazie danych Spectrum i zaznaczaj obszary guza budzące zainteresowanie w kontekście całej tkanki i wzorców barwienia.
  2. Wybierz preparat do analizy za pomocą AQUAnalysis z listy cyfrowych preparatów w bazie danych Spectrum, dwukrotnie klikając miniaturę obrazu (alternatywnie zaznacz pole wyboru obok obrazu, a następnie wybierz „View Images” z menu u góry listy). Spowoduje to automatyczne otwarcie oprogramowania ImageScope oraz obrazu z nałożonymi kolorami próbki tkanki.
  3. Użyj tego oprogramowania do nawigacji po obrazie, korzystając z dostępnych narzędzi.
  4. Korzystając z towarzyszącego barwienia H&E (fizycznego preparatu lub opisanego obrazu), zaznacz obszar zainteresowania na obrazie fluorescencyjnym. Na jednej próbce można wybrać wiele obszarów zainteresowania w formie pojedynczych zakreślonych pól. Dostępne jest również narzędzie „negatywne”, służące do wykluczania obszarów w ramach wybranego regionu (np. uszkodzonej tkanki, obszarów o słabej histologii, obszarów pozaguzowych, zanieczyszczeń itp.).
  5. Zapisz warstwę (warstwy) adnotacji na obrazie.
  6. Powróć do menu głównego Spectrum i zaznacz pole wyboru obok obrazu, który został przed chwilą opisany. Wybierz „Analyze” z paska menu u góry listy.
  7. W wyświetlonym oknie analizy wybierz „HistoRx AQUA Analysis” z menu rozwijanego.
  8. Jeśli istnieje wiele warstw adnotacji, użyj pól wyboru, aby wybrać odpowiednią warstwę (warstwy) do analizy.
  9. Naciśnij przycisk „Analyze”, gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia.
  10. W tym momencie na pasku zadań systemu Windows pojawi się zminimalizowane okno konsoli. Będzie ono wyświetlać postęp przesyłania obrazów z bazy danych Spectrum na lokalny komputer PC (operacja „pull”).
  11. Po przesłaniu danych zostanie uruchomiony program AQUAnalysis. Użytkownik może wówczas korzystać z wszystkich wewnętrznych funkcji oprogramowania w celu przeglądania, nawigacji i analizy obrazów.
  12. Opisany obszar obrazu z bazy danych Spectrum jest dzielony na kafelki obrazu o rozmiarze 512x512 pikseli – z których każdy zostanie oceniony indywidualnie.
  13. W tej badaniu zastosowano nienadzorowany algorytm oceny AQUA, oparty na klastrowaniu danych8. W tym algorytmie wyniki AQUA są generowane w następujący sposób:
    1. Sygnał obrazu dla pan-cytokeratyny jest poddawany progowaniu powyżej tła, a piksele te są wykorzystywane do zdefiniowania „maski” guza, która służy do dalszych obliczeń. Piksele pan-cytokeratyny o wysokiej ekspresji definiują również regiony cytoplazmatyczne/pozajądrowe komórek nowotworowych.
    2. Piksele o wysokim sygnale w kanale DAPI, które znajdują się wewnątrz maski guza, są identyfikowane jako jądrowe.
    3. Algorytm klastrowania analizuje również piksele o niskiej intensywności barwienia DAPI lub ekspresji cytokeratyny i próbuje częściowo przypisać je do przedziałów jądrowych, cytoplazmatycznych lub do tła.
    4. Po przypisaniu wszystkich pikseli do jednego z przedziałów guza lub tła, obliczana jest intensywność sygnału z białka docelowego (ER lub HER2) w każdym z przedziałów i normalizowana do wielkości tych przedziałów, co pozwala na uzyskanie wyników AQUA.
    5. Obrazy, które nie posiadały wystarczającej reprezentacji guza (zdefiniowanej jako mniej niż 5% pikseli reprezentujących guz), nie były oceniane. Regiony te generują również wartość „Final Result” oznaczoną jako „Fail” i mogą zatem zostać usunięte w późniejszych analizach statystycznych.
    6. Dodatkowo, jeśli podczas przeglądu operator zidentyfikował pola, które nie nadawały się do oceny z powodu artefaktów próbki lub obrazowania (np. pofałdowana tkanka, zanieczyszczenia), pola te zostały wyłączone z oceny i otrzymały wynik „Final Result” określony jako „Fail”.
  14. Wynikami oceny AQUA są tabele wyników przypisanych do każdego kafelka o rozmiarze 512x512 pikseli w obszarze zainteresowania w ramach próbki całego przekroju tkanki. Pliki te, w formacie .CSV, mogą być następnie wykorzystane do dalszej analizy statystycznej.

5. Analiza statystyczna: Wszystkie analizy statystyczne zostały wykonane w programie SPSS (IBM)

  1. W miarę możliwości, w przypadku dużych operacji, należy generować pliki z kodem składni SPSS (.sps) w celu wykonania manipulacji danymi i etapów analizy. Przykładowy kod składni został udostępniony w plikach uzupełniających.
  2. Wczytaj pliki danych do programu SPSS. Usuń z surowych danych zmienne, które nie są wykorzystywane (np. parametry specyficzne dla urządzenia, wyniki AQUA z nieużytkowanych przedziałów).
  3. W obszarach, w których „Wynik końcowy” (Final Result) brzmi „Błąd” (Fail) (patrz wyżej), wartości te należy oznaczyć jako SYSMIS, co wykluczy je z analiz numerycznych.
  4. Zgromadzić wszystkie dane ze wszystkich slajdów dla każdego markera (ER lub HER2) w jednym głównym zbiorze danych w formacie SPSS. Tego pliku głównego należy używać do wszystkich późniejszych obliczeń.
  5. Przy użyciu pliku składni SPSS (osobnego dla każdego markera: ER lub HER2 (patrz: uzupełniające pliki składni)) dokonano dalszej walidacji danych i obliczono wskaźniki różnorodności Simpsona w następujący sposób:
    1. Należy wygenerować główny plik analityczny, aby zapobiec modyfikacji wcześniej utworzonego głównego zbioru danych.
    2. Zweryfikuj główny zestaw danych w odniesieniu do wygenerowanych danych surowych i obrazów.
    3. Oblicz statystyki podsumowujące dla wyników AQUA dla każdej próbki (liczbę pól, średnią, medianę, wartość minimalną, wartość maksymalną oraz odchylenie standardowe wyników dla próbki).
    4. Należy sprawdzić losową próbkę wyników pod kątem zgodności z oryginalnymi plikami danych wyjściowych oraz z surowymi danymi obrazowymi poddanymi ocenie.
  6. Aby wygenerować obrazy map ciepła (przedstawione na Rysunkach 2 i 3):
    1. Podziel dane dotyczące wyniku AQUA na osiem poszczególnych poziomów (używając funkcji „Visual Binning” w programie SPSS). W przypadku ER wykorzystano wyniki jądrowe, a w przypadku HER2 wyniki cytoplazmatyczne.
    2. Wyznacz przedziały w taki sposób, aby każdy przedział reprezentował równy procent dostępnych przypadków z całego zbioru danych.
    3. Użyj funkcji „Split File” w programie SPSS, aby wszystkie kolejne wyniki były prezentowane na poziomie „każdego preparatu/próbki”.
    4. Nanieś każdy obszar (odpowiadający kafelkowi o wymiarach 512x512) na wykres zgodnie z jego współrzędnymi x,y i pokoloruj go wartością odpowiadającą koszykowi, do którego został przydzielony (patrz ryc. 2 i 3).
  7. W celu wygenerowania wyników heterogeniczności napisano kod służący do obliczenia wskaźnika różnorodności Simpsona z wykorzystaniem wyników AQUA.
    1. Wskaźnik różnorodności Simpsona, zastosowany w niniejszym opracowaniu, jest definiowany jako:
      wzór na wskaźnik różnorodności Simpsona, równanie równowagi statycznej, koncepcja matematyki edukacyjnej
      Gdzie N to całkowita liczba wyników/pól wykorzystanych dla danej próbki, a n to liczba wyników/pól w danej grupie wyników zestandaryzowanych (wyznaczonych zgodnie z poniższym opisem).
  8. W celu uzyskania źródła danych należy użyć opisanego powyżej głównego pliku analitycznego. W przedstawionych przykładach wszystkie obliczenia ER oparto na jądrowym wyniku AQUA, a obliczenia HER2 na cytoplazmatycznym wyniku AQUA. Przeprowadź poniższe obliczenia dla każdej próbki/preparatu.
  9. Ponieważ dane fluorescencyjne są podatne na niestabilność wariancji, w wyniku czego wielkość błędu propaguje wraz z intensywnością, należy zastosować normalizację logarytmiczną (podstawą 2) dla wszystkich wyników AQUA.
  10. Następnie przekształć znormalizowane (poddane transformacji logarytmicznej) dane w wyniki z (wyniki standaryzowane).
    1. Przekształcenie Z-score oblicza się następująco: Z = (wynik AQUA - średnia wszystkich wyników dla próbki)/odchylenie standardowe wyników dla próbki. Pozwala to przełożyć rozkład wyników na rozkład odchyleń względem centralnej wartości zerowego odchylenia.
  11. Podziel te wartości Z-score na sześć grup (<-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2, >2).
  12. Oblicz liczbę wartości przypisanych do każdego koszyka i zsumuj je dla każdego koszyka. Wykorzystaj tę wartość, wraz z całkowitą liczbą pól, aby obliczyć wartość dla każdego z sześciu koszyków wykorzystanych do indeksu.
  13. Zsumuj te wartości i odejmij wynik od jedynki, aby otrzymać wskaźnik różnorodności.
  14. Wskaźnik różnorodności stanowi miernik rozrzutu wyników wokół średniej dla danej próbki. Zatem wyższe wartości wskaźnika wskazują na szerszy rozrzut wyników lub zwiększoną heterogeniczność ekspresji. I odwrotnie, niższe wartości wskazują na mniejszą zmienność pomiaru ekspresji oraz homogeniczną ekspresję w próbce. Zostało to zilustrowane na rysunkach 2 i 3.

6. Reprezentatywne wyniki:

Terapie celowane z wykorzystaniem czynników o stosunkowo niskiej toksyczności, takich jak tamoksyfen i trastuzumab, nie stanowią standardu leczenia pacjentek z rakiem jajnika. Istnieją przekonujące dowody na to, że chemioterapia pierwszej linii oparta na platynach i taksanach jest skuteczniejsza niż inne schematy chemioterapii w leczeniu raka jajnika9-13, a choć 70-80% pacjentek początkowo reaguje na leczenie, większość z nich doświadcza nawrotu i umiera z powodu choroby. Pomiar biomarkerów, które mogłyby przewidzieć odpowiedź na alternatywne terapie, byłby przydatny w doborze zindywidualizowanego leczenia dla każdej pacjentki. Ponieważ chemioterapia wywiera presję selekcyjną na guz, przeżywające komórki nowotworowe mogą posiadać inne charakterystyki i reprezentować subpopulację guza sprzed terapii; ilościowe określenie tej zmiany mogłoby zatem być pomocne. Zastosowaliśmy naszą metodę mapowania heterogeniczności do analizy ekspresji ER i HER2 w próbkach raka jajnika przed i po chemioterapii, aby zmierzyć ilościowe zmiany w ekspresji oraz ocenić związek między ekspresją biomarkerów przed i po terapii. Zarówno ER, jak i HER2 wykazują wyraźną heterogeniczność w obrębie pojedynczych guzów, a w niektórych nowotworach indeks Simpsona zmienia się po terapii z relatywnie wysokiej na niską heterogeniczność, co objawia się spadkiem wartości indeksu Simpsona (patrz Ryc. 2 i 3). Wspiera to teorię, że w odpowiedzi na cytotoksyczną chemioterapię dochodzi do selekcji klonalnej; co ważniejsze, zjawisko to można wykorzystać w terapii celowanej przeciwko pozostałej populacjom komórek, aby lepiej spersonalizować leczenie pacjentek onkologicznych.

Histologia tkanki piersi pod mikroskopem; morfologia komórkowa w badaniu patologicznym.
Rycina 1. Mikrofotografie z barwieniem hematoksyliną i eozyną przedstawiające różne obszary tego samego raka jajnika o zmiennej morfologii. (A) Mikrofotografia z powiększeniem x40 pokazuje dwa sąsiadujące obszary guza o różnej morfologii. Widoki przy dużym powiększeniu (x20) ujawniają komórki z przejaśnieniem cytoplazmy i litym wzorcem wzrostu w górnej części guza (B), podczas gdy dolna część tkanki (C) wykazuje bardziej jednorodną, eozynofilną cytoplazmę i brodawkowaty wzorzec wzrostu. Guz ten zostałby jednak sklasyfikowany jako surowiczy podtyp histologiczny brodawkowaty w celu dalszego postępowania terapeutycznego.

Analiza receptorów estrogenowych; mapa cieplna wpływu terapii; porównanie danych; ekspresja od wysokiej do niskiej.
Rycina 2. Mapy ciepła heterogeniczności ekspresji białka ER w tkance raka jajnika wykazującej obecność cytokeratyny, przed (panel górny) i po (panel dolny) zastosowaniu terapii.

Poziomy ekspresji białka HER2 przedstawione na mapie ciepła przed i po terapii; wykres intensywności z kodowaniem kolorystycznym.
Rysunek 3. Mapy ciepła heterogeniczności ekspresji białka HER2 w tkance raka jajnika wykazującej pozytywny wynik w kierunku cytokeratyn, przed (panel górny) i po (panel dolny) terapii.

Dyskusja

Metoda opisana w niniejszym opracowaniu umożliwia ilościowe określenie heterogeniczności molekularnej w standardowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie przekrojach histologicznych materiału nowotworowego. Metoda ta pozwala na przypisanie wartości do stopnia heterogeniczności w przekroju tkankowym, dzięki czemu może ona zostać uwzględniona jako zmienna w opracowaniu i analizie biomarkerów. Choć ogólnie preferowane jest, aby biomarkery tkankowe były homogeniczne pod względem ekspresji, co zmniejsza podatność testu na błędy próbkowania lub obciążenia, w pewnych okolicznościach ilościowe określenie heterogeniczności jako parametru może być przydatne. Na przykład, jak pokazano w przykładowym zestawieniu dla ER i HER2, powszechne biomarkery wykazują znaczną heterogeniczność ekspresji i obecnie nie jest wiadomo, czy stanowi to niezależny czynnik prognostyczny lub predykcyjny w odniesieniu do wyniku klinicznego lub odpowiedzi na terapię. Podobnie, jak zilustrowano, sama terapia może dynamicznie zmieniać składowe populacje komórek, w związku z czym pomiar wzbogacenia celu może być przydatny w podejmowaniu decyzji terapeutycznych.

Technika ta jest jednak ograniczona przez te same czynniki, które ograniczają tradycyjne analizy histopatologiczne lub analizy biomarkerów (np. immunohistochemiczne). Wynik zależy od rodzaju, wielkości i jakości analizowanej tkanki, w związku z czym pojedynczy przekrój tkanki może nie być reprezentatywny dla całego guza. W rzeczywistości indeks Simpsona może być nadmiernie obciążony wielkością tkanki (liczbą zarejestrowanych klatek i zmierzonymi wynikami AQUA). Immunogenność mierzonych epitopów może podlegać niekontrolowanym czynnikom przedanalitycznym, które w sposób artefaktowy zmieniają ich ekspresję w przekroju tkanki (takim jak czas zimnego niedokrwienia, czas utrwalania oraz artefakty brzeżne). Jest to szczególnie problematyczne w przypadku fosfo-epitopów, które są znane z dużej labilności14, 15. Z tego powodu technika ta może być lepiej dostosowana do materiałów z resekcji niż do małych biopsji i powinna być wykonywana na wielu przekrojach, a nie tylko na jednym. Ostatecznie techniki obrazowania 3D mogą stworzyć możliwość dokładniejszego określenia ilościowego tego parametru.

Przedstawiona technika może być również ograniczona przez czynniki biologiczne, takie jak zmienność w ekspresji epitopu maskującego cytokeratynę. Może to być szczególnie istotne w przypadku nowotworów, w tym raka jajnika i piersi, które ulegają przejściu nabłonkowo-mezenchymalnemu (EMT) lub są wzbogacone w komponenty nienabłonkowe bądź komórki macierzyste16, co wykazano niedawno w przypadku raka jajnika leczonego chemioterapią in vitro17 oraz u pacjentek z rakiem piersi w odpowiedzi na terapię18. Ograniczenie to można pokonać, stosując alternatywne przeciwciała maskujące (lub koktajle przeciwciał), takie jak cytokeratyna wraz z wimentyną, której ekspresja wzrasta podczas EMT16. Ponadto, ponieważ inne komponenty tkanki (mikrośrodowisko), takie jak fibroblasty lub komórki śródbłonka naczyniowego, są również coraz częściej celem terapii biologicznych, technikę tę można rozszerzyć w celu oceny tych komponentów, stosując specyficzne maski dla interesujących przedziałów, np. PECAM/ CD31 do barwienia komórek śródbłonka naczyniowego.

Choć w niniejszym protokole ze względu na prostotę zastosowano adaptację indeksu Simpsona jako miarę heterogeniczności, można by użyć innych miar, takich jak proste pomiary tendencji centralnej (średnia, wariancja, mediana itp.). Dodatkowo obliczenia indeksu Simpsona można zmodyfikować, aby lepiej dostosować je do konkretnej populacji badawczej. Zastosowanie transformacji Z-score sprawia, że punktacja jest bardziej odpowiednia dla wielu markerów, ponieważ heterogeniczność opiera się na odchyleniu od średniej dla danego zestawu danych. Jednakże całkowity zakres punktacji może być ograniczony w tego typu transformacji. W niektórych projektach badań bardziej odpowiednie może być proste pogrupowanie (binning) rzeczywistych wyników AQUA dla wszystkich próbek danego zestawu markerów. Wybór liczby przedziałów i wartości progowych stanowi również ograniczenie w zakresie uzyskiwanych wartości i może zostać zoptymalizowany pod kątem alternatywnych projektów eksperymentalnych.

W niniejszym badaniu jako potencjalne biomarkery wykorzystaliśmy ER i HER2, ponieważ są one już stosowane w praktyce klinicznej, pomagają odpowiedzieć na istotne pytania kliniczne dotyczące skuteczności terapii celowanych oraz wiadomo, że wykazują znaczną heterogeniczność i zmienność w chorobie pierwotnej i rozsianej19. Jednakże optymalny marker heterogeniczności pozostaje do ustalenia. Inne możliwości mogą obejmować cytogenetyczne markery klonalności, takie jak te wykorzystywane wcześniej w badaniach FISH w fazie interfazy20. Podejście to wymaga dalszej walidacji w dużych, dobrze opisanych kohortach klinicznych lub w badaniach klinicznych, aby dokładniej określić znaczenie tego parametru w biologii nowotworów.

Oświadczenia

JC, MG, CJ i CS są pracownikami firmy HistoRx, Inc.

Podziękowania

Niniejsza praca została częściowo sfinansowana przez Scottish Funding Council (grant nr HR07005; http://www.sfc.ac.uk/), Medical Research Scotland (http://www.medicalresearchscotland.org.uk/), Cancer Research UK Experimental Cancer Medicine Centre (http://www.cancerresearchuk.org/) oraz Breakthrough Breast Cancer (http://breakthrough.org.uk/).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ScanScope FLAperio TechnologiesScanScope FLUżywany w konfiguracji dostarczonej przez producenta
SpectrumAperio TechnologiesSpectrumKonfiguracja i numery katalogowe będą różnić się w zależności od tego, jak lokalne instytucje skonfigurowały swoją bazę danych i strukturę IT.
AQUAnalysis, w połączeniu z AQUAjustmentHistoRxV2.3Pakiet AQUAjustment umożliwia programowi AQUAnalysis korzystanie z obrazów przechowywanych w programie Spectrum.
HER2DakoA0485rozcieńczenie 1 w 400
mysi przeciwciała anty-pan cytokeratynaDakoM3515rozcieńczenie 1 w 50
Rozcieńczalnik przeciwciałDakoS0809
Envision kozi-króliczy HRPDakoK4003
Blokada białkowaDakoX0909
Kozie przeciwciała anty-mysie Alexa555InvitrogenA21422
Medium montażowe DAPIInvitrogenP36931
Tyramida Cy5HistoRxAQ-EMR1-00001
Sequenza Immunostaining CenterThermo Fisher Scientific, Inc.73300001Użyty tutaj do immunofluorescencyjnego barwienia na blacie laboratoryjnym

Bibliografia

  1. Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution. Histopathology. 58, 486-497 (2011).
  2. Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
  3. Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution. Histopathology. 58, 486-497 (2011).
  4. Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
  5. Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots. ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).
  6. Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays. Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).
  7. Simpson, E. H. Measurement of biodiversity. Nature. 163, 688-68 (1949).
  8. Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).
  9. Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial. Lancet. 360, 505-515 (2002).
  10. McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer. N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).
  11. Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study. J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).
  12. Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results. J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).
  13. Cannistra, S. A. Cancer of the ovary. N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).
  14. Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling. Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).
  15. Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).
  16. Klymkowsky, M. W., Savagner, P. Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe. Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).
  17. Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells. Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).
  18. Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).
  19. Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases. Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).
  20. Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis. J. Pathol. 221, 308-319 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Heterogeniczność ekspresji białekzautomatyzowana analiza ilościowaskaner fluorescencyjny całych preparatówwskaźnik AQUAwskaźnik różnorodności Simpsonamapowanie ekspresji biomarkerówanaliza przekrojów tkankowychmikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie tkanki nowotworowej
Mapowanie heterogeniczności ekspresji białek w guzach z wykorzystaniem ilościowej immunofluorescencji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.