W niniejszej pracy proponujemy proste metody testowania i oceny obecności reaktywnych form tlenu w komórkach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Produkcja i detekcja reaktywnych form tlenu (ROS) w nowotworach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Reaktywne formy tlenu obejmują szereg cząsteczek, które uszkadzają DNA i RNA oraz utleniają białka i lipidy (peroksydacja lipidów). Te reaktywne cząsteczki zawierają tlen i obejmują H2O2 (nadtlenek wodoru), NO (tlenek azotu), O2- (anion nadtlenkowy), perksonitryt (ONOO-), kwas podchlorawy (HOCl) oraz rodnik hydroksylowy (OH-).
Gatunki tlenowe powstają nie tylko w sytuacjach patologicznych (nowotwory, niedokrwienie/reperfuzja, patologie neurologiczne i sercowo-naczyniowe, choroby zakaźne, choroby zapalne 1, choroby autoimmunologiczne 2, itd…), lecz także w sytuacjach fizjologicznych (niepatologicznych), takich jak metabolizm komórkowy 3, 4Rzeczywiście, reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają istotną rolę w wielu szlakach sygnalizacji komórkowej (proliferacja, aktywacja komórek 5, 6, migracja 7 itd.). RWP mogą być szkodliwe (mówi się wówczas o „stresie oksydacyjnym i nitrosacyjnym”), gdy są wytwarzane w dużych ilościach w przedziałach wewnątrzkomórkowych; komórki zazwyczaj reagują na RWP poprzez zwiększenie poziomu przeciwutleniaczy, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza (CAT), peroksydaza glutationowa (GPx) oraz glutation (GSH), które chronią komórki, przekształcając niebezpieczne wolne rodniki w niezaszkodliwe cząsteczki (np. wodę). Witaminy C i E zostały również opisane jako zmiatacze RWP (antyoksydanty).
Wolne rodniki w niskich stężeniach są korzystne 3. Odpowiedzi odpornościowe pośredniczone przez makrofagi i neutrofile obejmują produkcję i uwalnianie NO, które hamuje wirusy, patogeny i proliferację nowotworów 8. NO reaguje również z innymi ROS, pełniąc tym samym rolę detoksykatora (wymiatywacza ROS). Wreszcie NO działa na naczynia krwionośne, regulując przepływ krwi, co jest istotne dla adaptacji mięśni do długotrwałego wysiłku 9, 10. W kilku publikacjach wykazano również, że ROS biorą udział w regulacji wrażliwości na insulinę 11, 12.
Dostępnych jest wiele metod oceny produkcji ROS. W niniejszym artykule proponujemy kilka prostych, szybkich i niedrogich testów; zostały one zwalidowane w wielu publikacjach i są rutynowo stosowane do wykrywania ROS lub ich efektów w komórkach ssaków. Podczas gdy niektóre z tych testów wykrywają wiele rodzajów ROS, inne wykrywają tylko jeden konkretny rodzaj ROS.
Protokół
1. Wykrywanie ROS przy użyciu carboxy-H2DCFDA
Carboxy-H2DCFDA nie wykazuje fluorescencji, jednak w obecności ROS, po utlenieniu tego odczynnika, staje się on zielono fluorescencyjny.
- Bezpośrednio przed użyciem przygotuj świeży roztwór zapasowy carboxy-H2DCFDA w sterylnym dimetylosulfotlenku (DMSO) lub 10% etanolu. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania barwnika.
- Przepłucz komórki solą buforową HEPES (HBSS) lub solą buforową z fosforanem (PBS), aby usunąć pozostałości pierwotnego medium.
- Obciąż komórki barwnikiem (oraz barwnikiem kontrolnym, patrz sekcja uwag). W tym badaniu zastosowano linię komórek białaczki ludzkiej Jurkat. Użyj carboxy-H2DCFDA w końcowym stężeniu 1μM w standardowym medium hodowlanym z obniżoną zawartością surowicy (2%).
- Inkubuj hodowle przez 30 minut w ciemności, w konwencjonalnym inkubatorze (37°C, 5% CO2). Wytierz wszystkie niewykorzystane roztwory barwnika.
- Usuń medium zawierające carboxy-H2DCFDA i przemyj komórki dwukrotnie za pomocą HBSS lub PBS. Od tego momentu chroń komórki przed światłem.
- Do komórek obciążonych carboxy-H2DCFDA dodaj świeże medium zawierające wybrany lek i inkubuj zgodnie z potrzebami. W tym przykładzie zastosowano H2O2 (0,03%) przez 1 godzinę.
- Oceń poziom ROS, analizując komórki natychmiast za pomocą cytometrii przepływowej w kanale FL1 (fluorescencja zielona), za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych lub mikroskopii fluorescencyjnej. Fluorescencję można wykryć, stosując długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednie dla fluorescencji zielonej.
Uwaga: Kontrole powinny obejmować niepoddane działaniu czynników komórki załadowane carboxy-H2DCFDA oraz niebarwione komórki niepoddane działaniu czynników. Wiadomo, że carboxy-H2DCFDA wykrywa nadtlenki, ale może być również utleniany przez inne reaktywne formy tlenu (ROS). Odczynnik ten może być również modyfikowany w inny sposób, dlatego w teście należy uwzględnić barwnik kontrolny niewrażliwy na utlenianie, taki jak 5-(i-6)-karboksy-2',7'-dichlorofluoresceina diestrycet (carboxy-DCFDA).
2. Pomiar produkcji tlenku azotu (NO)
Będą potrzebne roztwory sulfanilamidu oraz N-1-naftyloetylodiaminy dichlorowodoranu (NED) oraz standard azotynowy. Metoda ta jest nazywana testem Griessa.
Roztwór NED: przygotować 0,1% roztwór dichlorowodorku N-1-naftyloetylodiaminy rozpuszczonego w sterylnej wodzie. Roztwór sulfanilamidu: przygotować 1% roztwór sulfanilamidu rozpuszczonego w 5% kwasie fosforowym. Standard azotynów: rozcieńczyć standardowy roztwór stokowy azotynu sodu o stężeniu 0,1M do stężenia 10μM w sterylnym medium, a następnie wykonać rozcieńczenia seryjne w tym samym medium.
Warunki przechowywania: Odczynniki chemiczne należy przechowywać w temperaturze pokojowej, zgodnie z instrukcjami producenta. Po przygotowaniu, roztwory NED i sulfanilamidu przechowuje się bezpośrednio po użyciu w temperaturze 4°C, w ciemności, przez maksymalnie 3 miesiące.
- Hodować komórki w płytce 96-dołkowej, stosując triplikaty dla każdego wariantu i uwzględniając odpowiednie kontrole zgodnie z planem eksperymentu.
- Poddać komórki działaniu czynnika indukującego produkcję NO. W naszym doświadczeniu do stymulacji komórek wykorzystano lipopolisacharyd (LPS) (10 ng/ml) oraz rekombinowany IL-4. W niniejszym protokole zastosowano linię RAW 264.7, która jest linią makrofagów mysich (linia komórkowa monocytów i makrofagów białaczki mysiej).
- W dniu wykonania analizy doprowadzić oba odczynniki do temperatury pokojowej.
- Odwirować płytkę, zebrać supernatanty komórkowe i przenieść 50μl do nowej płytki 96-dołkowej. Przygotować w dołkach rozcieńczenia ograniczające roztworu standardowego w celu stworzenia krzywej wzorcowej.
- Do każdego dołka z próbką i kontrolą dodać 50μl roztworu sulfanilamidu i dokładnie wymieszać.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności.
- Do każdego dołka z próbką i kontrolą dodać 50μl roztworu dichlorowodoru N-1-naftyloetylodiaminy i dokładnie wymieszać.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności.
- Niezwłocznie zmierzyć absorbancję przy użyciu czytnika płytek z filtrem dla długości fal od 520nm do 50nm.
W przypadku stosowania płytek lub naczyń o innych rozmiarach, należy użyć objętości 1/1/1 dla każdego roztworu i supernatantu próbki.
W studzienkach pozytywnych pojawi się fioletowy kolor. Wyniki uzyskane przy użyciu standardu pomogą sprawdzić stabilność przygotowanych roztworów.
3. Wykrywanie działania ROS: utlenione białka
Inną metodą identyfikacji produkcji ROS jest analiza wyników końcowych poprzez wykrywanie utleniania białek. Rzeczywiście, ROS modyfikują glutation, przeciwutleniacz obecny w większości komórek, który pełni rolę ochronną przeciwko ROS. W wyniku utleniania przez ROS, modyfikacja zredukowanego glutationu (GSH) prowadzi do połączenia grupy sulfhydrylowej (tiolowej) jego cysteiny z drugim glutationem za pomocą mostka disiarczkowego. Prowadzi to do powstania zdymeryzowanego białka (utlenionego białka GSSG). GSH może zostać przywrócone poprzez modyfikację GSSG przez enzym reduktaza glutationowa. Wzrost stosunku GSSG/GSH odzwierciedla stres oksydacyjny. Poniższy test opiera się na detekcji i ilościowym oznaczeniu tych utlenionych białek. Metoda ta nie jest selektywna dla konkretnych ROS, lecz wykrywa efekty działania NO, H2O2, O2- oraz innych ROS. W tym przypadku mierzymy całkowitą ilość utlenionego (GSSG) i zredukowanego (GSH) glutationu przy użyciu sygnałów bioluminescencyjnych.
- Zasiać komórki w płytce 96-dołkowej (biała/przezroczysta, z płaskim dnem) w sposób rutynowy. W naszym eksperymencie zastosowano 1x104 komórek na dołek dla adherentnych komórek Raw 264.7 i A549 oraz dla komórek Jurkat w zawiesinie. W zależności od wielkości komórek wartości te mogą wymagać dostosowania. Zaleca się wysiewanie komórek adherentnych dzień przed testem, aby umożliwić im przytwierdzenie się do płytki. Należy przygotować odpowiednią liczbę dołków do detekcji białek utlenionych i zredukowanych, a także dla komórek w samym medium oraz komórek nieleczonych jako kontroli. Dla wszystkich warunków należy zastosować triplikaty.
- Traktować komórki lekiem przez wymagany czas. W tym przypadku komórki Jurkat i A549 traktowano H2O2 przez 1 h (odpowiednio w stężeniach 5 mM i 2,5 mM). Komórki Raw 264.7 traktowano LPS w stężeniu 20 ng/ml przez 16 h. W czasie tej inkubacji należy doprowadzić wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej (RT). Wszystkie odczynniki należy przygotować nie wcześniej niż 30 minut przed wykonaniem testu. Tabela poniżej przedstawia objętości odczynników na jeden dołek. Jeśli to możliwe, przed przystąpieniem do testu ważne jest usunięcie medium zawierającego czynnik redukujący.
| Komórki adherentne | Komórki w zawiesinie | |||
| Całkowita lizy Glu | Utleniona lizy Glu | Całkowita lizy Glu | Utleniona lizy Glu | |
| NEM, 25mM | brak | 0.5μl | brak | 0.5μl |
| Luciferin-NT | 1 μl | 1 μl | 1 μl | 1 μl |
| Bufor do pasywnej lizy, 5X | 10μl | 10μl | 10μl | 10μl |
| Woda destylowana | 39.0μl | 38.5μl | 14μl | 13.5μl |
| Objętość końcowa na studzienkę | 50μl | 50μl | 25μl | 25μl |
- Usunąć medium z dołków zawierających komórki przylegające. Nie usuwać medium z dołków z komórkami w zawiesinie.
- Dodać odczyn lizujący zredukowanym glutationem lub odczyn lizujący z utlenionym glutationem do odpowiednich dołków i mieszać przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Dodać odczyn do generowania lucyferyny i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Dodać odczyn do detekcji lucyferyny i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Odczytać sygnał bioluminescencyjny przy czasie całkowania od 0,25 do 1 sekundy na dołek, używając luminometru z czytnikiem płytek.
| Komórki adherentne | Komórki w zawiesinie | |
| Liczba komórek w studzience | 1x104 | 1x104 |
| zawiesina komórek na studzienkę + lek | 100 μldo usunięcia przed sekcją 3.4 | 25μl, nie usuwać |
| Odczynnik do lizy zredukowanym glutationem | 50 μl | 25μl |
| Odczynnik do lizy z utlenionym glutationem | 50 μl | 25μl |
| Odczynnik do generowania lucyferyny | 50 μl | 50 μl |
| Odczynnik do detekcji lucyferyny | 100 μl | 100 μl |
4. Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1 Wykrywanie ROS przy użyciu carboksy-barwnik H2DCFDAKomórki Jurkat (linia komórkowa białaczki ludzkiej) traktowane H2O2 porównano z komórkami niepoddanymi działaniu preparatu. ROS indukuje modyfikację grupy karboksy-H2DCFDA wykazujący zieloną fluorescencję w pomiarach cytometrii przepływowej, szczyt fluorescencji w H2O2 przesunięcie komórek poddanych działaniu preparatu w porównaniu do pików w kontrolach (H2O2 komórki poddane działaniu czynnika zabarwione barwnikiem niewrażliwym na utlenianie oraz komórki niepoddane działaniu czynnika zabarwione carboxy-H2(DCFDA). Wyniki potwierdzają obecność RC w komórkach poddanych działaniu preparatu.
Rysunek 2 Wykrywanie NO przy użyciu odczynników GriessaKomórki RAW 264.7 (makrofagi mysie) poddano działaniu LPS oraz IL-4. W komórkach traktowanych stwierdzono istotny wzrost produkcji NO w porównaniu z niepoddanymi działaniu czynników komórkami kontrolnymi.
| Linie komórkowe | Niepoddane działaniu | Poddane działaniu |
| Raw 264.7 | 13.0 | 8.3 |
| A549 | 21.6 | 10.5 |
| Jurkat | 5.2 | 2.8 |
Tabela 1 Wykrywanie utleniania białek indukowanego przez ROS. Komórki RAW 264.7 poddano działaniu LPS, natomiast komórki Jurkat i A549 (ludzki rak płuca) poddano działaniu H2O2. Wyniki wyrażono jako stosunek zredukowanego (GSH) do utlenionego (GSSG) glutationu. W komórkach traktowanych stwierdzono niższe wartości stosunku glutationu (GSH)/(GSSG) w porównaniu do nie traktowanych komórek kontrolnych, co wskazuje na większy stopień utlenienia białek w komórkach traktowanych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wiele stanów patologicznych, takich jak choroby zapalne, nowotwory, niedokrwienie/reperfuzja, a także zastosowane leczenie, np. radioterapia lub chemioterapia (np. cisplatyna), indukuje nadprodukcję ROS. W związku z tym wykrywanie i pomiar poziomów ROS jest istotne w wielu badaniach podstawowych, przedklinicznych i klinicznych. Jednakże ROS mają bardzo krótki okres półtrwania, co może utrudniać ich wykrywanie. W niniejszej pracy proponujemy proste testy, które są rutynowo stosowane i powszechnie akceptowane w celu wykryw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Otrzymaliśmy wsparcie firmy Promega przy opracowaniu tej publikacji.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (CA142664).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5-(i-6)-karboksy-2’,7’-dichlorofluoresceiny dioctan (carboxy-DCFDA) | Molecular Probes, Life Technologies | C369 | kontrola |
| carboxy-H2DCFDA | Molecular Probes, Life Technologies | C400 | |
| Sulfanilamid | Sigma-Aldrich | S9251-100G | |
| N-1-naftyloetylodiaminy dichlorowodorek | Sigma-Aldrich | N9125-10G | |
| Wzorzec azotynowy | Sigma-Aldrich | 237213-100G | |
| Zestaw GSH/GSSG-Glo Assay | Promega Corp. | V6612 | Do ilościowego oznaczenia utlenionego, zredukowanego lub stosunku utlenionego do zredukowanego glutationu |
Bibliografia
- Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).
- Perl, A., Gergely, P., Banki, K. Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus. Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).
- Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).
- Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).
- Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).
- Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species. Blood. 104, 2385-2393 (2004).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).
- Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 10, 260-272 (2009).
- Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes. 54, 311-321 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
