Tradycyjne, dwuwymiarowe techniki hodowli komórkowej często prowadzą do zmian w charakterystyce markerów różnicowania, cytokin i czynników wzrostu. Trójwymiarowa hodowla komórkowa w rotacyjnym systemie hodowli komórkowej (RCCS) przywraca ekspresję wielu z tych czynników, co zaprezentowano tutaj na przykładzie linii komórkowej trofoblastu pozawillousowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rotacyjne systemy hodowli komórkowych dla hodowli ludzkich komórek: ludzkie komórki trofoblastyczne jako model
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania nad ludzkim trofoblastem pomagają w zrozumieniu złożonego środowiska powstającego podczas placentacji. Ze względu na naturę tych badań, eksperymenty in vivo na ludziach są niemożliwe. Połączenie kultur pierwotnych, kultur eksplantów oraz linii komórkowych trofoblastu1 pozwala na lepsze zrozumienie inwazji ściany macicy2 oraz przebudowy tętnic spiralnych macicy3,4 przez pozawłośniczkowe komórki trofoblastu (EVT), co jest niezbędne do pomyślnego utrzymania ciąży. Pomimo bogatej wiedzy pozyskanej z takich modeli, przyjmuje się, że modele hodowli komórkowych in vitro z wykorzystaniem linii komórkowych typu EVT wykazują zmienione właściwości komórkowe w porównaniu do ich odpowiedników in vivo5,6. Komórki hodowane w rotacyjnym systemie hodowli komórkowej (RCCS) wykazują cechy morfologiczne, fenotypowe i funkcjonalne linii komórkowych typu EVT, które bardziej przypominają różnicujące się in utero komórki EVT, z zwiększoną ekspresją genów pośredniczących w inwazji (np. metaloproteinaz macierzy (MMP)) i różnicowaniu trofoblastu7,8,9. Linia komórkowa łożyska Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (uprzejmie przekazana przez dr. Guya Whitley'ego i dr Judith Cartwright) jest linią komórkową typu EVT, która została wykorzystana do testów w systemie RCCS.
Konstrukcja naczynia hodowlanego RCCS opiera się na zasadzie, że organy i tkanki funkcjonują w środowisku trójwymiarowym (3-D). Dzięki dynamicznym warunkom hodowli w naczyniu, w tym warunkom fizjologicznie istotnego naprężenia ścinającego, komórki hodowane w trzech wymiarach tworzą agregaty w oparciu o naturalne powinowactwa komórkowe i różnicują się w organotypowe struktury przypominające tkanki10,11,12. Utrzymanie orbity płynu zapewnia środowisko o niskim naprężeniu ścinającym i niskiej turbulencji, podobne do warunków występujących in vivo. Sedymentacja hodowanych komórek jest przeciwdziałana poprzez regulację prędkości obrotowej RCCS, aby zapewnić stałe swobodne opadanie komórek. Wymiana gazowa odbywa się przez przepuszczalną membranę hydrofobową znajdującą się z tyłu bioreaktora. Podobnie jak ich macierzysta tkanka in vivo, komórki hodowane w systemie RCCS są w stanie reagować na gradienty chemiczne i molekularne w trzech wymiarach (tj. na swoich powierzchniach apikalnych, bazalnych i bocznych), ponieważ są hodowane na powierzchni porowatych mikronośników. Gdy są hodowane jako dwuwymiarowe monowarstwy na nieprzepuszczalnych powierzchniach, takich jak plastik, komórki są pozbawione tej istotnej komunikacji na powierzchni bazalnej. W konsekwencji ograniczenia przestrzenne narzucone przez środowisko głęboko wpływają na to, w jaki sposób komórki wyczuwają i dekodują sygnały z otaczającego mikrośrodowiska, co wskazuje na istotną rolę środowiska 3-D13.
Wykorzystaliśmy system RCCS do opracowania biologicznie istotnych modeli 3D różnych ludzkich tkanek nabłonkowych7,14,15,16. W rzeczywistości wiele wcześniejszych doniesień wykazało, że komórki hodowane w systemie RCCS mogą przyjmować fizjologicznie istotne fenotypy, co nie było możliwe w przypadku innych modeli10,17-21. Podsumowując, hodowla w systemie RCCS stanowi prostą, powtarzalną i wysokoprzepustową platformę, która dostarcza dużej liczby zróżnicowanych komórek podatnych na różnorodne manipulacje eksperymentalne. W poniższym protokole, posługując się trofoblastami pozapłodowymi (EVTs) jako przykładem, szczegółowo opisujemy kroki niezbędne do trójwymiarowej hodowli komórek adherentnych w systemie RCCS.
Protokół
1. Przygotowanie kulek kolagenowych
- Przed załadowaniem EVT do hodowli komórkowej 3D należy przygotować mikronośniki Cytodex-3:
- Odważyć odpowiednią ilość kulek Cytodex-3 wymaganą do eksperymentu. Niniejszy protokół został dostosowany do naczynia RCCS o pojemności 10ml, w którym potrzebne jest 0,05g kulek. W przypadku naczynia RCCS o pojemności 50ml należy odpowiednio przeskalować ilość. W 50mL autoklawowalnej probówce stożkowej wymieszać 250 mg kulek Cytodex-3 z 12mL roztworem DPBS (Dulbecco phosphate buffered solution). Taka ilość jest wystarczająca dla 5 naczyń RCCS.
- Należy upewnić się, że w probówce stożkowej znajduje się odpowiednia objętość cieczy, ponieważ proces autoklawowania spowoduje parowanie. Luźno zakręcić probówkę i autoklawować przez 10 min w temperaturze 110°C.
- Po zakończeniu cyklu autoklawowania wyjąć probówkę stożkową i pozwolić roztworowi z kulkami Cytodex-3 ostygnąć.
- Po ostygnięciu probówki stożkowej do temperatury pokojowej, stosując technikę sterylną, uzupełnić całkowitą objętość do 12,5mL za pomocą 1X DPBS.
- Zakręcić i przechowywać przygotowane kulki Cytodex-3 w temperaturze pokojowej. Przed użyciem pozwolić przygotowanym kulkom napęcznieć i ostygnąć do temperatury pokojowej. Powyższe przygotowanie kulek Cytodex-3 wystarczy dla pięciu naczyń RCCS o pojemności 10mL. Zaobserwowaliśmy, że długotrwałe przechowywanie kulek Cytodex-3 w temperaturze pokojowej prowadzi do pogorszenia ich właściwości, ponieważ kolagen ulega destabilizacji po około miesiącu. Wielkość kulek Cytodex-3 mieści się w zakresie 133-215 μm.
2. Przygotowanie pożywek
Przygotować 1L zoptymalizowanej pożywki GTSF-2 dla RCCS (zaadaptowanej z 22), która składa się z 40% pożywki MEM alpha wraz z suplementami oraz 60% pożywki L-15 Leibovitz's (zaadaptowanej z 22). Najpierw przygotować łącznie 400mL pożywki MEM alpha uzupełnionej o:
21.2mM wodorowęglanu sodu
0.06% peptonu
0.7mM fruktozy
1.4mM galaktozy
5.6mM glukozy
1% HEPES
1% L-glutaminy
0.5% ITS
10% FBS- Aby przygotować roztwór stokowy ITS, rozpuścić go w 5mL sterylnej zakwaszonej wody H2O, przygotowanej poprzez dodanie octu lodowatego (ok. 0.05mL). Zamieszać do rozpuszczenia, a następnie dodać 45mL sterylnej wody.
- Odważyć ilość proszku pożywki L-15 Leibovitz's odpowiednią dla 600ml pożywki, rozpuszczając go w wodzie H2O klasy do hodowli tkankowej.
- Dopełnić całkowitą objętość pożywki do hodowli komórkowych do 1L za pomocą pożywki L-15 Leibovitz's. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze 4°C w ciemności. Do każdej użytej alikwoty pożywki indywidualnie dodać 1% penicyliny-streptomycyny.
- W systemie RCCS z powodzeniem przetestowano wiele innych składów pożywek poza pożywką GTSF-2. Poszczególne laboratoria muszą samodzielnie zdecydować, która pożywka jest optymalna dla prowadzonego eksperymentu.
3. Inkubacja komórek i kulek
- Namnażać EVT do około 80% konfluencji, poddać trypsynizacji i policzyć zgodnie z przyjętymi zasadami hodowli komórkowych.
- Resuspendować 1x106 EVT w 4mL ogrzanej pożywki.
- Delikatnie wymieszać przygotowane kuleczki Cytodex-3. Stosując techniki sterylne, pobrać 2,5mL przygotowanych kuleczek za pomocą szerokiej końcówki pipety serologicznej o objętości 10mL i przenieść do nowej probówki stożkowej o pojemności 15mL. Należy pamiętać, że może dojść do niewielkiej utraty kuleczek w wyniku ich przywierania do pipety.
- Pozostawić kuleczki Cytodex-3 do osadzenia się na dnie probówki. Po sedymentacji usunąć za pomocą pipety górną warstwę DPBS, nie naruszając osadu kuleczek Cytodex-3.
- Wymieszać 1x106 przygotowanych EVT w pożywce z przygotowanymi kuleczkami Cytodex-3.
- Inkubować mieszaninę komórek i kuleczek w temperaturze pokojowej przez 30 min. Okresowo i delikatnie mieszać. Inkubować przez kolejne 30 min w temperaturze 37°C i 5% CO2, okresowo i delikatnie mieszając.
4. Załadunek RWV
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza wyjmij 10mL RCCS z opakowania i umieść go w sterylnej płytce hodowlanej z 6 dołkami dla stabilności. Schemat RCCS z opisem znajduje się na Rysunku 1.
- Zdejmij duży korek z portu.
- Dopełnij całkowitą objętość inkubowanej mieszaniny komórek i kulek do 10mL za pomocą ogrzanej pożywki.
- Wprowadź mieszaninę komórek/kulek do RCCS przez duży port. Podczas ładowania RCCS powinien być nachylony pod kątem 45° (dużym portem do góry), aby ułatwić usunięcie potencjalnych pęcherzyków powietrza. Aby zapobiec wzrostowi ciśnienia dodatniego, napełniaj naczynie powoli i jednostajnie.
- Załóż korek z powrotem do dużego portu.
- Wyjmij tłoki z strzykawek 3-mL i umieść puste strzykawki na małych portach. Do każdej strzykawki dodaj 1-3mL pożywki. Powoli otwórz oba zawory. Delikatnie włóż tłoki z powrotem do strzykawek. Dodawaj pożywkę z jednej strzykawki, aż wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte z komory wewnętrznej.
- Podnieś RCCS i delikatnie opukaj go z boku, obracając przed sobą, aby sprawdzić obecność pęcherzyków. Jeśli wystąpią jakiekolwiek pęcherzyki, należy je usunąć z komory, ponieważ pęcherzyki powietrza będą zakłócać tworzenie się agregatów komórkowych i wprowadzą siły ścinające. Usuń pęcherzyki, obracając RCCS, aż znajdą się one pod małym portem. Następnie delikatnie naciśnij tłok strzykawki po przeciwnej stronie, aby wypchnąć pęcherzyki do portu i poza komorę.
- Zamknij jeden port boczny. Delikatnie naciśnij tłok drugiej strzykawki, aby wprowadzić do naczynia niewielką ilość ciśnienia dodatniego, co zapobiega tworzeniu się pęcherzyków. Zamknij drugi zawór.
- Zamocuj RCCS na rotorze. Rozpocznij rotację z prędkością 19rpm w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C.
5. Wymiana medium
- Wymieniaj pożywkę co drugi dzień przez pierwsze trzy dni, a następnie codziennie.
- Wyłącz rotor i wyjmij RCCS. Pociągnij tłoki do góry, aby wytworzyć podciśnienie, wyjmij strzykawki z każdego małego portu i ustaw RCCS pod kątem tak, aby kulek osadziły się po przeciwnej stronie niż duży port.
- Po osadzeniu się wszystkich kulek otwórz jeden z małych zaworów i pozwól pożywce wypłynąć z RCCS do pojemnika na odpady. W ten sposób usuń 2/3 pożywki. Należy uważać, aby nie poruszyć kulek i nie usunąć żadnych agregatów.
- Zamknij mały zawór i otwórz duży port. Dolej pożywkę z powrotem do RCCS przez duży port. Załóż korek w dużym porcie.
- Powtórz kroki 4.6 - 4.9.
- Wraz ze wzrostem rozmiaru agregatów należy zwiększyć prędkość obrotową, aby stale utrzymywać je w zawieszeniu, idealnie w niewielkim wzorcu cyrkulacyjnym przy optymalnej prędkości. Zazwyczaj zwiększaj prędkość o 0,3-0,7 rpm po każdym karmieniu, gdy agregaty zaczną widocznie rosnąć.
6. Zbieranie namnożonych komórek
- Wyjmij RCCS z rotora. Wyjmij strzykawki z każdego z małych portów i ustaw RCCS pod kątem, aby kuleczki osiadły po przeciwnej stronie dużego portu.
- Po osiadnięciu wszystkich kuleczek otwórz jeden z małych zaworów i pozwól medium wypłynąć z RCCS do pojemnika na odpady. W ten sposób usuń 1/3 medium.
- Zamknij mały zawór i otwórz duży port. Delikatnie zakręć naczyniem, aby ponownie zdyspergować agregaty w roztworze. Przelej mieszaninę ciekłą do sterylnej probówki stożkowej 50ml. Pozostaw zebrane agregaty do osiadania w probówce stożkowej, a następnie wykorzystaj nadsącz do dokładnego wypłukania naczynia hodowlanego, aby zmaksymalizować odzysk agregatów. Agregaty można natychmiast wykorzystać w dalszych analizach, takich jak cytometria przepływowa, testy inwazyjności, immunofluorescencja i inne.
7. Reprezentatywne wyniki
Przykład komórek o fenotypie EVT (linia komórkowa trofoblastu SGHPL-4) hodowanych w systemie RCCS na kuletkach Cytodex-3 przedstawiono na Rysunku 2. Linia komórek o fenotypie EVT wykazuje wypustki odchodzące od głównego skupiska i przyczepiające się do sąsiednich skupisk. Wiele kuletek jest całkowicie pokrytych namnażającymi się komórkami. Po usunięciu z systemu RCCS i wysianiu na macierz zewnątrzkomórkową, hodowane w 3-D komórki o fenotypie EVT agresywnie naciekają i/lub migrują (Rysunek 3). Dane RT-PCR potwierdzają zwiększoną ekspresję MMP widoczną w agregatach 3-D w przeciwieństwie do tradycyjnych monowarstw hodowli komórkowych (Rysunek 4). Co ciekawe, w systemie RCCS upregulowane są również geny niezwiązane z inwazją (Tabela 1), co może pomóc w określeniu takich obszarów, jak interakcje immunologiczne z naciekającymi komórkami trofoblastu.
Rycina 1. Schematyczny rysunek Rotującego Systemu Hodowli Komórkowych (RCCS).
Rycina 2. Mikrograf w kontraście fazowym reprezentatywnego agregatu po 5 dniach wzrostu w RCCS. Strzałki wskazują naciekające komórki, a symbol * oznacza mikronośniki Cytodex-3.
Rycina 3. Wyhodowane agregaty RCCS zatopiono w żelach fibrynowych. Inwazję przez żel fibrynowy zaobserwowano już (A) 24 godziny po zatopieniu w fibrynie, a proces ten (B) trwał do 48 godzin. Strzałki wskazują komórki naciekające, a symbol * oznacza mikronośniki Cytodex-3 (Adaptowano za zgodą z Ref. 7).
Rycina 4. Porównawczy zymogram żelatynowy komórek SGHPL-4 typu EVT namnażanych w monowarstwie oraz w RCCS. Formy pro- i aktywne MMP-2 i MMP-9 były wydzielane przez komórki trofoblastyczne hodowane w RCCS (Zaadaptowano za zgodą z Ref. 7).
Tabela 1. Podsumowanie wyników mikromacierzy z komórek SGHPL-4 hodowanych w RCCS (Adaptowano za zgodą, z Ref. 7).
- Krotność indukcji w agregatach 3D obliczono w następujący sposób: znormalizowana wartość genu w 3D/znormalizowana wartość genu w monowarstwie.
- Oznacza geny, których poziom w monowarstwach znajdował się poniżej granicy wykrywalności.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj technika hodowli dostarcza badaczom wysoce inwazyjnych komórek typu EVT. Uznano obecnie, że w monowarstwach dochodzi do utraty różnicowania z powodu hamowania odpowiedzi komórkowych na sygnały chemiczne i molekularne w trzech wymiarach (apikalna, bazalna i boczna powierzchnia komórek)10,13. Technika ta odzwierciedla cechy obserwowane in utero w inwazyjnych komórkach EVT. Ponieważ procedura ta naśladuje konwencjonalną kinetykę czasu hodowli tkankowej w monowarstwie, ale dostarcza ko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant Narodowych Instytutów Zdrowia USA NIH/NICHD #HD051998 (przyznany C.A.M.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kuleczki mikronośnika Cytodex | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotacyjny system hodowli komórkowej (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Obejmuje podstawę rotora, zasilacz, 4 jednorazowe jednostki RCCS |
| Jednorazowe jednostki RCCS | Synthecon | Kontakt z Synthecon | |
| Strzykawka 3ml z końcówką Luer-Lock | BD Biosciences | 309585 | |
| Szeroka pipeta serologiczna 10ml | BD Biosciences | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Pożywka Leibovitz’s L-15, proszek | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, wolny od endotoksyn | Fisher Scientific | MT-25-055-CM | |
| Węglan sodu | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Pepton | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fruktoza | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galaktoza | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamina | Invitrogen | 25030 | |
| Insulina-Transferyna-Selenian sodu (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Invitrogen | 15140 |
Bibliografia
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140, 803-803 (2010).
- Harris, L. K. IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline. Placenta. 32, Suppl 2. S154-S154 (2011).
- Whitley, G. S., Cartwright, J. E. Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis. J. Anat. 215, 21-21 (2009).
- Apps, R. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32, 33-33 (2011).
- Bilban, M. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31, 989-989 (2010).
- LaMarca, H. L. Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion. Placenta. 26, 709-709 (2005).
- Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1. Reproduction. 139, 789-789 (2010).
- Husslein, H. Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast. Placenta. 30, 284-284 (2009).
- Barrila, J. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat. Med. 4, 901-901 (1998).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).
- Bentrup, H. önerzu, K, Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).
- Carterson, A. J. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).
- Myers, T. A. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).
- Hjelm, B. E. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).
- Straub, T. M. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).
- Nickerson, C. A. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol. J. 6, 103-103 (2009).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture - Principles and Methods. Handbooks. , Available from: http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/service_and_support~documents_and_downloads~handbooks (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
