Przedstawiamy praktyczny przewodnik po wprowadzaniu tracerów in vivo, wykorzystując drogę rdzeniowo-móżdżkową jako system modelowy do zaprezentowania kluczowych kroków niezbędnych do skutecznej analizy obwodów neuronalnych u myszy. Szczegółowo opisujemy nasz wszechstronny protokół śledzenia, który wykorzystuje aglutyninę z zarodków pszenicy (WGA) sprzężoną z fluoroforami Alexa.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ujawnianie topografii obwodów neuronalnych w wielu kolorach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obwody neuronalne są zorganizowane w funkcjonalne mapy topograficzne. Aby zwizualizować złożoną architekturę obwodów, opracowaliśmy metodę pozwalającą na wiarygodne znakowanie globalnego wzorca wielu projekcji topograficznych. Móżdżek stanowi idealny model do badania uporządkowanego układu obwodów neuronalnych. Na przykład przedziałowa organizacja rdzeniowo-móżdżkowych włókien mszystych okazała się niezbędnym systemem do badania wzorców włókien mszystych. Niedawno wykazaliśmy, że aglutynina z zarodków pszenicy (WGA) sprzężona z Alexa 555 i 488 może być wykorzystana do śledzenia projekcji rdzeniowo-móżdżkowych włókien mszystych u myszy w rozwoju i u osobników dorosłych (Reeber et al. 2011). Zidentyfikowaliśmy trzy główne właściwości, które czynią znaczniki WGA-Alexa pożądanymi narzędziami do znakowania projekcji neuronalnych. Po pierwsze, fluorofory Alexa są intensywne, a ich jasność umożliwia obrazowanie całych preparatów bezpośrednio po śledzeniu. Po drugie, znaczniki WGA-Alexa znakują całą trajektorię rozwijających się i dorosłych projekcji neuronalnych. Po trzecie, znaczniki WGA-Alexa są szybko transportowane zarówno w kierunku wstecznym, jak i w przód. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy sposób przygotowania znaczników i innych niezbędnych narzędzi, sposób przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego w celu śledzenia dróg rdzeniowo-móżdżkowych oraz optymalne metody obrazowania śledzonych projekcji w trzech wymiarach. Podsumowując, przedstawiamy protokół śledzenia krok po kroku, który będzie przydatny w rozszyfrowywaniu organizacji i łączności map funkcjonalnych nie tylko w móżdżku, ale także w korze mózgowej, pniu mózgu i rdzeniu kręgowym.
Protokół
1. Podawanie znaczników in vivo za pomocą sterylnej operacji (Sekcje 1.1-1.16)
W trakcie całej procedury zalecamy stosowanie standardowych sterylnych technik chirurgicznych. Obejmuje to używanie sterylnych rękawiczek, fartuchów i masek ochronnych. Narzędzia powinny zostać poddane autoklawowaniu przed użyciem lub dokładnie oczyszczone wodą, a następnie etanolem. Podczas operacji, a w szczególności pomiędzy zwierzętami, należy usuwać fragmenty tkanek z narzędzi i sterylizować instrumenty na sucho za pomocą sterylizatora koralikowego (Steri 250 Cat. # 18000-45, Fine Science Tools). Ponadto krytyczne jest odpowiednie zorganizowanie prze....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisaliśmy szczegóły chirurgiczne i techniczne niezbędne do skutecznego śledzenia aksonów i dendrytów z wykorzystaniem nowatorskiego podejścia opartego na fluorescencji do szybkiego znakowania projekcji neuronalnych u myszy w fazie rozwoju oraz u osobników dorosłych. Wykorzystując WGA-Alexa, pokazujemy, w jaki sposób znaczniki i markery mogą być używane do analizy topografii uformowanych obwodów z wysoką rozdzielczością i w trzech wymiarach.
Do śledzenia obwodów neuronalnych dostępnych jest w.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana ze środków na rozpoczęcie działalności badawczej dla nowych badaczy przyznanych RVS przez Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sterylizator koralikowy | Fine Science Tools | Model Steri 250 Cat. # 18000-45 | |
| Kauteryzator | Fine Science Tools | Cat. # 18000-00 | |
| Kapilary z borokrzemianowego szkła | Harvard Apparatus | Cat. # 300056 | |
| Dwustopniowy wyciągacz szklanych mikropipet | Narishige International | Model 001-PC-10 | |
| Strzykawka mikrometryczna | Gilmont Instruments | Cat. # GS-1100 | |
| Aparat stereotaktyczny dla małych zwierząt | Kopf Instruments | Model 940-A | |
| Manipulator elektrod | Kopf Instruments | Model 960 | |
| Komora Vetcare | Harvard Apparatus | Cat. # 340508 | |
| Mata grzewcza | Harvard Apparatus | Cat. # 341241 | |
| Kamera Leica DFC360 FX | Leica Microsystems | DFC360 FX | |
| Kamera Leica DFC490 | Leica Microsystems | DFC490 | |
| Mikroskop Leica DM5500 | Leica Microsystems | DM5500 | |
| Kamera Leica DFC3000 FX | Leica Microsystems | DFC3000 FX | |
| Mikroskop Leica MZ16 FA | Leica Microsystems | MZ16 FA | |
| Filtr CY3 | Leica Microsystems | Model # 11600231 | |
| Filtr FITC | Leica Microsystems | Model # 11513880 | |
| Filtr A4 DAPI/UV | Leica Microsystems | Model # 11504162 | |
| Aglutynina z zarodków pszenicy, koniugat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | Cat. #W11261 | |
| Aglutynina z zarodków pszenicy, koniugat Alexa Fluor 555 | Invitrogen | Cat. #W32464 |
Bibliografia
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
