Ujawnianie topografii obwodów neuronalnych w wielu kolorach

Podsumowanie

Przedstawiamy praktyczny przewodnik po wprowadzaniu tracerów in vivo, wykorzystując drogę rdzeniowo-móżdżkową jako system modelowy do zaprezentowania kluczowych kroków niezbędnych do skutecznej analizy obwodów neuronalnych u myszy. Szczegółowo opisujemy nasz wszechstronny protokół śledzenia, który wykorzystuje aglutyninę z zarodków pszenicy (WGA) sprzężoną z fluoroforami Alexa.

Streszczenie

Obwody neuronalne są zorganizowane w funkcjonalne mapy topograficzne. Aby zwizualizować złożoną architekturę obwodów, opracowaliśmy metodę pozwalającą na wiarygodne znakowanie globalnego wzorca wielu projekcji topograficznych. Móżdżek stanowi idealny model do badania uporządkowanego układu obwodów neuronalnych. Na przykład przedziałowa organizacja rdzeniowo-móżdżkowych włókien mszystych okazała się niezbędnym systemem do badania wzorców włókien mszystych. Niedawno wykazaliśmy, że aglutynina z zarodków pszenicy (WGA) sprzężona z Alexa 555 i 488 może być wykorzystana do śledzenia projekcji rdzeniowo-móżdżkowych włókien mszystych u myszy w rozwoju i u osobników dorosłych (Reeber et al. 2011). Zidentyfikowaliśmy trzy główne właściwości, które czynią znaczniki WGA-Alexa pożądanymi narzędziami do znakowania projekcji neuronalnych. Po pierwsze, fluorofory Alexa są intensywne, a ich jasność umożliwia obrazowanie całych preparatów bezpośrednio po śledzeniu. Po drugie, znaczniki WGA-Alexa znakują całą trajektorię rozwijających się i dorosłych projekcji neuronalnych. Po trzecie, znaczniki WGA-Alexa są szybko transportowane zarówno w kierunku wstecznym, jak i w przód. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy sposób przygotowania znaczników i innych niezbędnych narzędzi, sposób przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego w celu śledzenia dróg rdzeniowo-móżdżkowych oraz optymalne metody obrazowania śledzonych projekcji w trzech wymiarach. Podsumowując, przedstawiamy protokół śledzenia krok po kroku, który będzie przydatny w rozszyfrowywaniu organizacji i łączności map funkcjonalnych nie tylko w móżdżku, ale także w korze mózgowej, pniu mózgu i rdzeniu kręgowym.

Protokół

1. Podawanie znaczników in vivo za pomocą sterylnej operacji (Sekcje 1.1-1.16)

W trakcie całej procedury zalecamy stosowanie standardowych sterylnych technik chirurgicznych. Obejmuje to używanie sterylnych rękawiczek, fartuchów i masek ochronnych. Narzędzia powinny zostać poddane autoklawowaniu przed użyciem lub dokładnie oczyszczone wodą, a następnie etanolem. Podczas operacji, a w szczególności pomiędzy zwierzętami, należy usuwać fragmenty tkanek z narzędzi i sterylizować instrumenty na sucho za pomocą sterylizatora koralikowego (Steri 250 Cat. # 18000-45, Fine Science Tools). Ponadto krytyczne jest odpowiednie zorganizowanie przestrzeni roboczej, tak aby wyznaczone były oddzielne strefy do przygotowania zwierzęcia (golenie itp.), przeprowadzania operacji oraz strefa rekonwalescencji, w której zwierzę może być łatwo monitorowane, ogrzewane i w razie potrzeby otrzymywać leki przeciwbólowe. Kluczem do sukcesu operacji z przeżyciem jest zminimalizowanie ryzyka infekcji oraz stosowanie intensywnej strategii opieki pooperacyjnej. Prosimy zapoznać się z tabelą, w której znajduje się cały niezbędny sprzęt i odczynniki do niniejszego protokołu.

1. Zanurz dorosłe myszy w świeżo przygotowanym Avertinie (2,2,2-Tribromoethanol, Sigma, St. Louis MO; Cat. # T48402) poprzez wstrzyknięcie domięśniowe (i.p.) w dawce 0,2ml/10g masy ciała. Inne środki znieczulające, takie jak izofluran lub ketamina/ksylazyna, są równie skuteczne, jednak przed ich użyciem należy upewnić się, że laboratorium posiada wymagane zgody instytucjonalne i federalne. W przypadku noworodków (P0 - P10) można zastosować znieczulenie poprzez umieszczenie ich na kruszonym lodzie na 10-15 minut. Należy dopilnować, aby skóra każdego noworodka nie miała bezpośredniego kontaktu z lodem (na przykład umieszczając je w palcach rękawiczek lateksowych), ponieważ zimna woda może szybko wywołać letalny poziom hipotermii. Należy potwierdzić, że zwierzę znajduje się w odpowiedniej fazie znieczulenia, wykonując ucisk palców tylnych łap pęsetą lub palcami. Jeśli występuje odruch stopy, należy odczekać, aż zwierzę przestanie reagować na ten bodziec, co będzie oznaką głębszej fazy znieczulenia.
2. Po całkowitym znieczuleniu zwierzęcia należy ułożyć je na plecach na sterylnym gaziku, głową skierowaną od operatora, a ogonem w jego stronę. Należy ogolić futro trymermem, aby uzyskać wyraźne pole operacyjne, wystarczająco szerokie, by uzyskać dostęp do ośrodkowego układu nerwowego. Ogoloną okolicę należy przemyć dwukrotnie gazikami nasączonymi alkoholem, następnie 70% alkoholem z betadyną, a na koniec ponownie oczyścić gazikami z alkoholem. Podczas oczyszczania pola operacyjnego należy stosować ruchy okrężne od środka na zewnątrz. Można wyraźnie wyznaczyć pole operacyjne, wycinając mały otwór w sterylnym gaziku i umieszczając go nad ogoloną i oczyszczoną okolicą operacyjną. Chociaż utrzymanie sterylności pola operacyjnego podczas zabiegów na małych zwierzętach może być trudne, pomaga to zmniejszyć ryzyko infekcji.
3. Należy unieść skórę pęsetą i wykonać nacięcie nożyczkami w linii środkowej bezpośrednio nad dolnym odcinkiem piersiowym i górnym odcinkiem lędźwiowym. Dolny odcinek piersiowy i górny odcinek lędźwiowy można zidentyfikować, przesuwając palcem wzdłuż kręgów, aby wyczuć wybrzuszenie w kolumnie kręgosłupa (Rys. 1).
4. Należy przeciąć powięź i powierzchowne mięśnie grzbietu. W razie potrzeby wszelkie krwawienia należy zatamować poprzez koagulację naczyń krwionośnych (Fine Science Tools, Foster City, CA; Cat. # 18000-00). U noworodków do zatamowania krwawienia wystarczy delikatny ucisk wokół nacięcia za pomocą patyczków watnych.
5. Należy przeprowadzić laminektomię grzbietową, usuwając wyrostki kolczyste jednego lub dwóch segmentów dolnego odcinka piersiowego i górnego odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego po przecięciu blaszek łukowych po obu stronach kolumny kręgosłupa, w połowie drogi między wyrostkiem stawowym a grzbietowym wyrostkiem kolczystym (Rys. 2). Należy uważać, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego nożyczkami i zawsze usuwać małe fragmenty kości, ponieważ mogłyby one przerwać tkankę rdzenia. Należy pamiętać, że kolumna kręgosłupa u noworodków we wczesnym okresie postnatalnym nie jest całkowicie skostniała, co oznacza, że kości są bardzo miękkie i można je bardzo łatwo przeciąć. Dlatego należy uważać, aby nie naciąć zbyt głęboko, co mogłoby doprowadzić do uszkodzenia rdzenia kręgowego.
6. Jeśli preferują Państwo rezygnację z laminektomii grzbietowej u dorosłych myszy, stwierdziliśmy, że można przeciąć tkankę miękką między segmentami kręgów, aby odsłonić niewielki obszar rdzenia kręgowego bez przecinania kości. Chociaż obie metody są skutecznymi drogami dostępu do rdzenia kręgowego, unikanie laminektomii grzbietowej może zagwarantować brak uszkodzeń rdzenia.
7. Należy napełnić wyciągniętą elektrodę szklaną (kapilary ze szkła borokrzemianowego; Cat. # 300056, Harvard Apparatus, Holliston, MA; dwustopniowy wyciągacz mikropipet szklanych Narishige Model 001-PC-10) znacznikiem za pomocą strzykawki mikrometrycznej (0,2mL; Gilmont Instruments Cat. # GS-1100) lub równoważnego urządzenia dozującego.
8. Należy mocno zamocować szklaną mikroelektrodę w mikromanipulatorze i wprowadzić elektrodę na głębokość 0,1-0,5mm do dolnego odcinka piersiowego i górnego odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego, w połowie drogi między linią środkową a boczną krawędzią rdzenia. Zwierzę można unieruchomić w aparacie stereotaktycznym w celu dokładnej identyfikacji miejsc wstrzyknięcia i stabilizacji (Instrument Stereotaktyczny dla Małych Zwierząt Model 940-A oraz Manipulator Elektrod Model 960 od Kopf Instrumentation). Alternatywnie, jeśli protokół znieczulenia pozwala na uzyskanie stabilnej fazy bez znaczących ruchów spowodowanych głębokim oddychaniem, wystarczy delikatne przymocowanie zwierzęcia taśmą.
9. Przez 3-5 minut należy wstrzyknąć pod ciśnieniem do rdzenia kręgowego około 0,5μl 2% roztworu WGA-Alexa 488 (aglutynina z zarodków pszenicy, koniugat Alexa Fluor 488; Cat. #W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 555 (aglutynina z zarodków pszenicy, koniugat Alexa Fluor 555; Cat. #W32464, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 350 (aglutynina z zarodków pszenicy, koniugat Alexa Fluor 350; Cat. #W11263, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-HRP (aglutynina z zarodków pszenicy z peroksydazą chrzanową; Sigma, St. Louis, MO Cat # L7017) lub 0,5μl 10% BDA (biotynilowana dekstrana amina; Cat. #D1956, Invitrogen, Carlsbad, CA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS; Sigma, St. Louis, MO; Cat # P4417). Wstrzyknięcie takich objętości znaczników skutkuje oznakowaniem dużej liczby włókien. Do celowania w mniejsze jądra (lub podregiony poszczególnych jąder) konieczne będzie wstrzyknięcie mniejszych objętości, a każdy badacz powinien empirycznie ustalić optymalną ilość substancji. W celu precyzyjnego podawania nanolitrowych ilości należy rozważyć jontoforezę. Zazwyczaj uzupełniamy wszystkie roztwory znaczników 0,5% Fast Green (Sigma, St. Louis, MO; Cat # F7252), aby wizualizować miejsce wstrzyknięcia podczas operacji.
10. Do każdych 10μl roztworu BDA dodajemy 1μl oleju kukurydzianego (Sigma, St. Louis, MO; Cat # C8267) przed wstrzyknięciem, aby zapobiec przywieraniu mieszaniny do ścianek wyciągniętych pipet. Jeśli wystąpią problemy z wypchnięciem znacznika z pipety, należy powoli wycofać końcówkę, aby stworzyć małą kieszeń w tkance, a następnie spróbować wstrzyknąć ponownie. Zapychanie się końcówki mikroelektrody nie jest rzadkością. W większości przypadków kieszeń ta pomaga również stworzyć rezerwuar, z którego otaczające neurony mogą absorbować znacznik. Należy pamiętać, aby zawsze wypychać znacznik powoli, aby uniknąć masywnych uszkodzeń tkanki w sąsiedztwie igły.
11. Skórę należy delikatnie zamknąć za pomocą klipsów do ran i kleju tkankowego. Alternatywnie można użyć szwów do zamknięcia rany.
12. Należy zauważyć, że wraz z praktyką procedura chirurgiczna, przynajmniej do tego momentu, może zostać ukończona w czasie krótszym niż 20 minut.
13. Zwierzę należy umieścić w komorze rekonwalescencyjnej (Vetcare chamber model 9.16.0 Cat. # 340508 od Harvard Apparatus) na podkładce grzewczej (Heating Pad Cat. # 341241 od Harvard Apparatus), aby uniknąć hipotermii i przyspieszyć powrót do sprawności. Alternatywnie można użyć jednej z wielu dostępnych marek i modeli komór grzewczych. Należy monitorować częstotliwość oddechów i sprawdzać oznaki prób poruszania się zwierzęcia. Większość zwierząt odzyskuje zazwyczaj świadomość w ciągu 10-15 minut po operacji.
14. Po wybudzeniu zwierząt z narkozy należy zapewnić im wodę i pożywienie ad libitum oraz leki przeciwbólowe w razie potrzeby. Niezwykle ważne jest uważne monitorowanie zwierząt w ramach opieki pooperacyjnej. Należy rutynowo sprawdzać oznaki bólu, dyskomfortu, infekcji, odpowiednie jedzenie i picie itp. Ponownie, prosimy o omówienie potrzeb z inspektorami ds. dobrostanu zwierząt i weterynarzami w Państwa instytucjach, aby opracować najlepszy protokół pozwalający na pomyślne przeprowadzenie eksperymentów i zapewnienie niezbędnej opieki nad wszystkimi zwierzętami.
15. WGA-Alexa 555, WGA-Alexa 488 i WGA-HRP są szybko transportowane w neuronach i stwierdziliśmy, że zarówno u myszy postnatalnych, jak i dorosłych, znaczniki koniugaty Alexa silnie znakują długie pęczki włókien w ciągu 24 godzin (Reeber et al. 2011). WGA-Alexa 350 jest również szybko transportowany, choć w porównaniu z innymi barwnikami Alexa jego widoczność w dużym stopniu zależy od jakości i czułości zestawów filtrów (dane niepokazane; Reeber et al. 2011).
16. BDA zazwyczaj wymaga dłuższego czasu przeżycia, aby w pełni prześledzić projekcje neuronalne, dlatego w celu pełnego mapowania projekcji spinocerebellarnych zwierzęta będą musiały zostać uśmiercone po około 11 dniach.

2. Detekcja anterogradnie znakowanych włókien mszystych

1. Po odpowiednim czasie przeżycia znieczuli myszy Awertynem (lub preferowanym środkiem znieczulającym).
2. Po ustąpieniu odruchów należy wypłukać krew z serca poprzez perfuzję 0,1M PBS (pH7,2). Następnie utrwal tkankę, przeprowadzając perfuzję zwierzęcia 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS. Oprócz obszarów przeznaczonych do analizy, zawsze konieczne jest pobranie tkanki z miejsca wstrzyknięcia w celu retrospektywnej analizy wielkości wstrzykniętej objętości, oceny zakresu uszkodzeń tkanki spowodowanych przez elektrodę oraz identyfikacji możliwego znakowania w włóknach przechodzących (Ryc. 3; patrz Mesulam, 1982; Reeber et al. 2011).
3. Mózgi myszy po perfuzji poddaj post-utrwalaniu przez 24-48 godzin w 4% PFA, a następnie poddaj krioprotekcji w buforowanych roztworach sacharozy rozcieńczonych w PBS (15% przez ok. 2 godziny lub do momentu opadnięcia tkanki na dno pojemnika, a następnie 30% przez noc lub do opadnięcia tkanki). Tkankę należy następnie wyjąć z sacharozy, delikatnie osuszyć ręcznikiem papierowym, a następnie zanurzyć w formie do tkanek zawierającej OCT (Optimal Cutting Temperature; Sakura Finetech USA Inc, CA). Tkankę zamraża się w zamrażarce -80 °C i przechowuje w tej samej temperaturze do momentu krojenia.
4. Fluorofory Alexa są widoczne bezpośrednio po znakowaniu i nie wymagają dodatkowego barwienia. Dlatego po perfuzji tkanka znakowana WGA-Alexa może zostać pocięta i zamontowana do obrazowania lub obrazowana bezpośrednio w 4% PFA jako preparat całomontowany (wholemount). Stwierdzono, że obrazowanie tkanki w 4% PFA zapewnia najlepszy współczynnik załamania światła dla obrazowania topografii znakowanych projekcji w preparatach całomontowanych. W przypadku skrawków należy wykonać seryjne przekroje koronalne o grubości 40μm na kriostacie i zebrać je jako skrawki swobodnie pływające w PBS. Ze względu na toksyczność PFA, należy upewnić się, że podczas perfuzji i obrazowania używana jest odpowiednia maseczka ochronna, obszar jest dobrze wentylowany, a każdy preparat PFA lub tkanka utrwalona w PFA, gdy nie jest używana, jest natychmiast przenoszona do szczelnych pojemników. Idealnie byłoby, gdyby mikroskop znajdował się w odpowiednim dygestorium.
5. Włókna znakowane WGA-HRP można ujawnić, używając tetrametylobenzyidyny (TMB) jako chromogenu. Nie opisujemy tutaj protokołu barwienia HRP, ponieważ został on wcześniej szczegółowo opisany (Vogel and Prittie 1994; Sillitoe et al. 2010).
6. W przypadku włókien znakowanych BDA inkubuj swobodnie pływające skrawki tkanki przez 2 godziny w Streptawidynie-CY3 (Cat. #434315, Invitrogen, Carlsbad, CA) lub Streptawidynie-Alexa Fluor 488 lub 555 (Cat. #S11223 dla 488 i Cat. #S21381 dla 555, Invitrogen, Carlsbad, CA), przemyj w PBS, a następnie zamontuj w FLUORO-GEL. Dla DAB inkubuj skrawki tkanki przez noc w buforze reakcyjnym ABC (Cat. #PK-4000, Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA), przepłucz 3 razy w PBS, a następnie inkubuj przez 5-10 minut w DAB (0,5mg/ml, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) uzupełnionym o 10μl 30% H₂O₂ na każde 50ml roztworu DAB.

3. Immunohistochemia

1. Immunohistochemię przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisaną procedurą (Sillitoe et al. 2008). W skrócie: skrawki tkanek inkubowano w 0,1M PBS zawierającym 10% NGS (NGS; Sigma, St. Louis MO), 0,1% Tween-20 oraz przeciwciała pierwszorzędowe (patrz poniżej) przez 16-18 godzin w temperaturze pokojowej. Skrawki tkanek przemyto trzykrotnie w PBS, a następnie inkubowano z przeciwciałami wtórnymi (patrz poniżej) przez maksymalnie 2 godziny w temperaturze pokojowej. Tkankę ponownie wypłukano, a immunoreaktywność ujawniono zgodnie z opisem poniżej.
2. Aby określić relację między komórkami Purkinjego a włóknami mszystymi, wykonano podwójne znakowanie swobodnie pływających skrawków tkanek przy użyciu konwencjonalnych metod barwienia. Do śledzenia wykorzystano WGA-Alexa 555, a do wykrywania ZebrinII (1:250; dar od dr. Richarda Hawkesa, University of Calgary, Calgary, Kanada) użyto sprzężonych z Alexa 488 wtórnych przeciwciał osiołkowych przeciwko mysim (Invitrogen/ Molecular Probes Inc., Carlsbad, CA). ZebrinII to mysie przeciwciało monoklonalne, które stosowano bezpośrednio z zużytego medium hodowlanego hybrydomy. Przeciwciała wtórne sprzężone z fluorophorem stosowano w rozcieńczeniu 1:1500. Po barwieniu skrawki tkanek zamontowano na naładowanych szkiełkach przedmiotowych, a następnie przykryto szkiełkami przy użyciu FLUORO-GEL w buforze Tris (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) lub utwardzającego medium montażowego Vectashield z DAPI (Kat. # H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA) do trójkolorowego obrazowania fluorescencyjnego.
3. Specyficzność przeciwciał wtórnych przetestowano poprzez obróbkę skrawków tkanek bez udziału przeciwciał pierwszorzędowych. W takich eksperymentach kontrolnych nie wykryto sygnału, co wskazuje, że obserwowane barwienie nie wynikało z niespecyficznych sygnałów przeciwciał sprzężonych z Alexa (dane nie przedstawiono).

4. Mikroskopia i analiza danych

1. Wykonujemy mikrofotografie przekrojów tkanek, korzystając z kamer Leica DFC360 FX (fluorescencja) oraz DFC490 (przekroje tkanek poddane reakcji z DAB i TMB) zamontowanych na mikroskopie Leica DM5500.
2. Srebyzujemy i analizujemy obrazy przekrojów tkanek przy użyciu pakietów oprogramowania Leica Application Suite oraz Leica Application Suite FX.
3. Mikrofotografie preparatów całych organów wykonujemy za pomocą kamery Leica DFC3000 FX zamontowanej na stereomikroskopie Leica MZ16 FA z uruchomionym oprogramowaniem Leica Application Suite FX.
4. Oba nasze mikroskopy są wyposażone w filtry Leica CY3 (model # 11600231) i FITC (model # 11513880), a mikroskop DM5500 posiada dodatkowo filtr A4 DAPI/UV (model # 11504162).
5. Obrazy są pozyskiwane po optymalizacji pod kątem niedoświetlenia lub prześwietlenia, określonej za pomocą oprogramowania Leica. Wszystkie surowe dane importujemy do programu Adobe Photoshop CS4, a w razie potrzeby korygujemy w całym polu każdego obrazu jedynie ostrość, jasność, kontrast lub poziomy. Można stosować inne preferowane oprogramowanie do edycji zdjęć.
6. Przedstawione tutaj schematy zostały narysowane w programie Adobe Illustrator CS4.
7. Neurony barwione Alexa 555 i CY3, które przy użyciu naszych filtrów są wykrywane jako czerwone, zostały w obrazach zaprezentowanych w całym manuskrypcie zabarwione pseudo-kolorem magenta.

Zwierzęta

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Albert Einstein College of Medicine. W kolonii utrzymywano i wykorzystywano we wszystkich badaniach samce i samice myszy outbred Swiss Webster (Taconic, Albany, NY) lub inbred C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME). Południe w dniu wykrycia czopa pochwowego uznano za dzień embrionalny 0.5.

5. Reprezentatywne wyniki:

Aferencje spinocerebellarne kończą się w pasmach parasagitalnych w móżdżku (Rys. 3; Voogd et al. 1969; Grishkat and Eisenman 1995; Vogel and Prittie 1994; Vig et al. 2005; Apps and Hawkes 2009; Sillitoe et al. 2010; Reeber et al. 2011). Wstrzyknęliśmy znaczniki WGA-Alexa do dolnego odcinka piersiowego i górnego odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego, aby wykazać, że: 1) znaczniki te mogą być wykorzystane do spójnego znakowania specyficznych podzbiorów zakończeń w móżdżku (Rys. 3; Reeber et al. 2011), 2) znaczniki WGA-Alexa charakteryzują się intensywną jasnością i mogą służyć do wizualizacji ogólnego wzorca topografii włókien mszystych w całych móżdżkach (Rys. 3; Reeber et al. 2011), 3) znaczniki WGA-Alexa 488 oraz 555 mogą być stosowane w kombinacji do śledzenia wielu szlaków u tego samego zwierzęcia (Rys. 4), oraz 4) znaczniki WGA-Alexa są kompatybilne z barwieniem immunohistochemicznym (Rys. 5). W niedawnej pracy wykazaliśmy, że znaczniki WGA-Alexa znakują zakończenia w móżdżku już 6 godzin po podaniu znacznika do rdzenia kręgowego i stanowią doskonały wybór do badania architektury rozwijających się szlaków (Reeber et al., 2011).

Rysunek 1. Konfiguracja sprzętu do wprowadzania znaczników in vivo. A. Zdjęcie obszaru chirurgicznego. B. Dolny odcinek piersiowy i górny odcinek lędźwiowy można zidentyfikować, przesuwając palcami wzdłuż kręgów w celu wyczucia wybrzuszenia w kolumnie kręgosłupa. Dorsalną laminektomię należy przeprowadzić mniej więcej w połowie „wybrzuszenia”, wskazanego żółtą strzałką.

Rycina 2. Ilustracja segmentu kręgów dolnotarasowych i górnoprzylędziowych przed i po laminektomii grzbietowej. A. Schemat nienaruszonego segmentu kręgów z regionu dolnotarasowego i górnoprzylędziowego kręgosłupa myszy. B. Laminektomia grzbietowa jest wykonywana poprzez usunięcie wyrostków kolczystych jednego lub dwóch segmentów kręgowych, po przecięciu łuku kręgu w połowie odległości między wyrostkiem stawowym a wyrostkiem kolczystym.

Rycina 3. Tracery WGA-Alexa charakteryzują się intensywną jasnością i mogą być wykorzystywane do wizualizacji topografii projekcji aferentnych z wysoką rozdzielczością. A. Schemat przedstawia miejsce pochodzenia i zakończenie neuronów spinocerebellarnych znakowanych WGA-Alexa 555. B. Zdjęcie miejsca iniekcji po podaniu WGA-Alexa 555 do dolnego odcinka piersiowego i górnego odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego dorosłego osobnika. C. Obraz całego preparatu przednich kostek po wstrzyknięciu WGA-Alexa 555 do dolnego odcinka piersiowego i górnego odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego. D. Anterogradne śledzenie drogi rdzeniowo-móżdżkowej z użyciem WGA-Alexa 555 ujawnia pasma włókien mszystych, widoczne na koronalnym przekroju tkanki. Listki są oznaczone cyframi rzymskimi, a liczby wskazują pasma włókien mszystych po obu stronach linii środkowej (dotyczy wszystkich obrazów). Paski skali: B, 500 μm C, 500 μm D, 200 μm.

Rysunek 4. Tracery WGA-Alexa są skuteczne w znakowaniu wielu szlaków neuronalnych u tego samego zwierzęcia. A. Schemat całego preparatu móżdżku myszy przedstawiający ogólny wzorzec pasm włókien mszystych drogi rdzeniowo-móżdżkowej. WGA-Alexa 555 wstrzyknięto do prawej strony lędźwiowego odcinka rdzenia kręgowego, a WGA-Alexa 488 do tego samego segmentu po stronie lewej. B. Jak widać na koronalnym przekroju tkanki wykonanym przez tylne płaty, oba znaczniki WGA-Alexa zostały przetransportowane do móżdżku i skutecznie oznakowały odrębne podzbiory zakończeń (patrz również Reeber et al. 2011). Skróty: warstwa molekularna (ml); warstwa komórek Purkinjego (pcl); warstwa ziarnista (gcl); istota biała (wm). Paski skali: B, 100 μm.

Rycina 5. Tracery WGA-Alexa mogą być stosowane w połączeniu z immunohistochemią i histologią do potrójnego znakowania neuronów i ich projekcji. A. WGA-Alexa 555 odkłada się w zakończeniach włókien mszystych w zakręcie III. B. Barwienie na ZebrinII ujawnia układ pasm komórek Purkinjego w lobulusie III. C. Barwienie jąder neuronów i gleju barwnikiem DAPI. D. Zestawienie paneli na jednym obrazie A, Bi C przedstawiające potrójne znakowanie pasm doprowadzających, prążków komórek Purkinjego oraz ogólną cytoarchitekturę. E-HObrazy powiększone obszarów zaznaczonych ramkami na panelach A-DPrążki komórek Purkinjego zostały ponumerowane zgodnie z wcześniejszym opisem (przegląd w (Apps and Hawkes 2009)). Skróty: warstwa molekularna (ml); warstwa komórek Purkinjego (pcl); warstwa ziarnista (gcl). Paski skali: D, 500 μm (dla A-C); H, 500 μm (dla E-G).

Dyskusja

Opisaliśmy szczegóły chirurgiczne i techniczne niezbędne do skutecznego śledzenia aksonów i dendrytów z wykorzystaniem nowatorskiego podejścia opartego na fluorescencji do szybkiego znakowania projekcji neuronalnych u myszy w fazie rozwoju oraz u osobników dorosłych. Wykorzystując WGA-Alexa, pokazujemy, w jaki sposób znaczniki i markery mogą być używane do analizy topografii uformowanych obwodów z wysoką rozdzielczością i w trzech wymiarach.

Do śledzenia obwodów neuronalnych dostępnych jest w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sterylizator koralikowy	Fine Science Tools	Model Steri 250 Cat. # 18000-45
Kauteryzator	Fine Science Tools	Cat. # 18000-00
Kapilary z borokrzemianowego szkła	Harvard Apparatus	Cat. # 300056
Dwustopniowy wyciągacz szklanych mikropipet	Narishige International	Model 001-PC-10
Strzykawka mikrometryczna	Gilmont Instruments	Cat. # GS-1100
Aparat stereotaktyczny dla małych zwierząt	Kopf Instruments	Model 940-A
Manipulator elektrod	Kopf Instruments	Model 960
Komora Vetcare	Harvard Apparatus	Cat. # 340508
Mata grzewcza	Harvard Apparatus	Cat. # 341241
Kamera Leica DFC360 FX	Leica Microsystems	DFC360 FX
Kamera Leica DFC490	Leica Microsystems	DFC490
Mikroskop Leica DM5500	Leica Microsystems	DM5500
Kamera Leica DFC3000 FX	Leica Microsystems	DFC3000 FX
Mikroskop Leica MZ16 FA	Leica Microsystems	MZ16 FA
Filtr CY3	Leica Microsystems	Model # 11600231
Filtr FITC	Leica Microsystems	Model # 11513880
Filtr A4 DAPI/UV	Leica Microsystems	Model # 11504162
Aglutynina z zarodków pszenicy, koniugat Alexa Fluor 488	Invitrogen	Cat. #W11261
Aglutynina z zarodków pszenicy, koniugat Alexa Fluor 555	Invitrogen	Cat. #W32464