In vitro rozpakowywanie rdzeni HIV-1

Podsumowanie

Odsłonięcie (uncoating) jest kluczowym etapem wczesnej fazy cyklu życiowego HIV-1 i definiuje się je jako rozpad otoczki kapsydu oraz uwolnienie wirusowego kompleksu rybonukleoproteinowego (vRNP). W niniejszej pracy prezentujemy techniki izolacji nienaruszonych rdzeni z wirionów HIV-1 oraz metody ilościowego oznaczania ich odsłaniania in vitro.

Streszczenie

Genom retrowirusów jest zamknięty w kapsydzie otoczonym kopertą lipidową. W przypadku lentiwirusów, takich jak HIV-1, stożkowa otoczka kapsydu składa się z białka CA ułożonego w postaci sieci heksagonów. Kapsyd jest zamknięty przez 7 pentamerów na szerokim końcu i 5 na wąskim końcu stożka^{1, 2}. Wewnątrz tej otoczki kapsydu znajduje się wirusowy kompleks rybonukleoproteinowy, które razem tworzą rdzeń.

Po fuzji błony wirusa z błoną komórki docelowej, HIV-1 zostaje uwolniony do cytoplazmy. Następnie kapsyd ulega rozpadowi, uwalniając wolne CA w formie rozpuszczalnej³ w procesie zwanym odkapsydowaniem. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja i czas trwania odkapsydowania HIV-1 są słabo poznane. Pojedyncze substytucje aminokwasowe w CA, które zmieniają stabilność kapsydu, upośledzają również zdolność HIV-1 do infekowania komórek⁴. Wskazuje to, że stabilność kapsydu ma krytyczne znaczenie dla infekcji HIV-1.

Proces odkapsydowania HIV-1 był trudny do zbadania ze względu na brak dostępności czułych i wiarygodnych testów dla tego procesu. W niniejszej pracy opisujemy ilościową metodę badania odkapsydowania in vitro z wykorzystaniem rdzeni wyizolowanych z zakaźnych cząsteczek HIV-1. Podejście to obejmuje izolację rdzeni poprzez sedymentację skoncentrowanych wirionów przez warstwę detergentu do liniowego gradientu sacharozy, w niskiej temperaturze. Aby ilościowo określić stopień odkapsydowania, wyizolowane rdzenie inkubuje się w temperaturze 37°C przez różne odstępy czasu, a następnie poddaje wirowaniu w ultrawirówce w celu wytrącenia osadu. Stopień odkapsydowania analizuje się poprzez ilościowe oznaczenie frakcji białka CA w supernatancie. Podejście to zostało zastosowane do analizy wpływu mutacji wirusowych na stabilność kapsydu HIV-1^{4, 5, 6}. Powinno ono być również przydatne do badania roli czynników komórkowych w procesie odkapsydowania HIV-1.

Protokół

1. Produkcja cząsteczek HIV-1

Przed przystąpieniem do pracy należy uzyskać zgodę i przestrzegać wytycznych biura bezpieczeństwa biologicznego swojej instytucji w zakresie pracy w placówce bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzonej do pracy z zakaźnym wirusem HIV. Należy upewnić się, że podczas pracy w laboratorium bezpieczeństwa biologicznego zachowana jest należyta staranność i przestrzegane są wszelkie środki ostrożności.

Produkcję cząsteczek HIV-1 zazwyczaj przeprowadza się poprzez przejściową transfekcję komórek 293T prowiralnym DNA HIV-1 z wykorzystaniem metody transfekcji fosforanem wapnia^{7, 8}. Odpowiednie są również zapasy wirusa o wysokim mianie, uzyskane z hodowli zainfekowanych limfocytów T.

1. Hodować komórki 293T w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i uzupełnionej o antybiotyki [penicylinę (100 IU/ml) i streptomycynę (100 μg/ml)] w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
2. Odłączyć komórki z prawie w pełni zrosłych naczyń za pomocą 0,25% Trypsyny-EDTA i wysiać 2x10⁶ komórek w 9 ml pożywki na naczynie hodowlane 100 mm dzień przed transfekcją. Wysiać sześć naczyń hodowlanych 100 mm do produkcji wirionów. W przypadku potrzeby uzyskania stężonego preparatu rdzeni można wysiać więcej naczyń do transfekcji.
3. Następnego dnia monowarstwy komórkowe powinny osiągnąć około 25% konfluencji i być gotowe do transfekcji. Dla sześciu naczyń z komórkami do transfekcji, doprowadzić 120 μg prowiralnego DNA do objętości 2,7 ml za pomocą sterylnej wody. Do mieszaniny dodać 0,3 ml 2,5 M CaCl₂ oraz 3 ml 2XBBS i wymieszać dokładnie, pipetując ciecz w górę i w dół kilka razy. Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 10-20 minut.
4. Dodawać po 1 ml otrzymanej mieszaniny kroplowo do centrum każdego naczynia, delikatnie nim kołysząc w celu wymieszania. Umieścić naczynia na noc (~16 godzin) w inkubatorze ustawionym na 35°C i 3% CO₂.
5. Odssać pożywkę hodowlaną i delikatnie dodać 5 ml PBS.
6. Odssać PBS i dodać 5 ml świeżej pożywki. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez dodatkowe 24-48 godzin.
7. Zebrać nadsącz z hodowli zawierający cząsteczki wirusa i przenieść go do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Połączyć nadsącze ze wszystkich naczyń i wirować przy 1 500 x g przez 5 min, aby osadzić komórki i zanieczyszczenia. Przefiltrować nadsącz za pomocą filtrów strzykawkowych o rozmiarze porów 0,45 μm. Należy zachować środki ostrożności, aby zminimalizować powstawanie aerozoli podczas pracy z żywym wirusem. Obejmuje to stosowanie probówek stożkowych z o-ringami lub osłon kubełków rotora podczas etapu wirowania. Jeśli nie jest to możliwe, zakrętki probówek należy owinąć parafilmem.

2. Koncentracja wirionów HIV-1 poprzez ultrawirowanie

1. Przenieś supernatant hodowli (30 ml) do probówki wirówkowej z polialomeru o pojemności 38,5 ml (do rotora Beckman SW32Ti lub odpowiednika). Pod supernatant zawierający wirusy ostrożnie nanieś 5 ml 20% roztworu sacharozy w PBS, używając pipety 5 ml.
2. Wiruj przez 3 godziny przy 32 000 rpm w temperaturze 4°C (175 000 x g przy r_max), aby wytrącić cząsteczki wirusa w formie osadu.
3. Usuń supernatant poprzez aspirację, uważając, aby nie naruszyć osadu na dnie probówki. Do probówki dodaj 0,5 ml buforu 1XSTE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) i pozostaw w temperaturze 4°C na 1 godzinę w celu rozluźnienia osadu. Używając końcówki do pipety 1 ml o szerokim otworze, ostrożnie pipetuj zawiesinę kilka razy, aby oddzielić osad od dna probówki. Następnie przenieś rozluźniony osad do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, uważając, aby nie doprowadzić do spienienia. Inkubuj w temperaturze 4°C przez kolejne 1–3 godziny, aby umożliwić rozproszenie małych skupisk wirusa. W tym czasie przygotuj gradient sacharozy zgodnie z opisem w kroku 3.1.
4. Ostrożnie pipetuj zawiesinę wirusa kilkakrotnie w górę i w dół, a następnie wiruj przy 8 000 rpm (6 000 x g) w temperaturze 4°C w chłodzonej mikrowirówce przez 1 min, aby usunąć pozostałe skupki. Przez cały czas procesu utrzymuj próbkę w niskiej temperaturze.

3. Centryfugacja w gradiencie sacharozy w celu izolacji rdzeni

Rdzenie HIV-1 są izolowane przy użyciu metody „spin-thru”⁹, która stanowi modyfikację wcześniej opisanej metody oczyszczania rdzeni HIV-2¹⁰.

1. Przygotować 12 ml liniowego gradientu sacharozy od 30% do 70% w buforze 1XSTE w 14,5 ml polialomerowej probówce wirówkowej do rotora SW32.1Ti. Do przygotowania gradientu należy użyć 20 ml formera gradientu; nalać 6 ml 70% roztworu sacharozy po stronie bliskiej (przy porcie wylotowym) i 6 ml 30% roztworu sacharozy po stronie dalekiej. Należy upewnić się, że w kanale łączącym obie komory nie uwięzione są pęcherzyki powietrza. Użyć formera gradientu Auto Densi-Flow, aby przepompować gradient od dołu do góry probówki zawierającej na dnie 1 ml 85% roztworu sacharozy. Gradient delikatnie inkubować w temperaturze 4°C aż do schłodzenia (2-4 godziny).
2. Za pomocą końcówki do pipety 1 ml o szerokim otworze delikatnie nałożyć na gradient 0,25 ml 15% roztworu sacharozy w STE zawierającego 1% Triton X-100.
3. Za pomocą końcówki do pipety 1 ml o szerokim otworze delikatnie nałożyć na wierzch 0,25 ml 7,5% roztworu sacharozy w STE. Należy uważać, aby nie zmieszać warstw.
4. Delikatnie nałożyć 0,5 ml zawiesiny wirusa z kroku 2.4. Ten etap należy przeprowadzić ostrożnie, aby uniknąć zaburzenia gradientu i zmieszania znajdujących się poniżej warstw sacharozy.
5. Umieścić probówki w schłodzonym wiadrze SW32.1Ti i wirować przy 32 000 rpm (187 000 x g przy r_max) przez noc (16-20 godzin) w temperaturze 4°C. Aby uniknąć zatrzymania wirówki, nie rozpoczynać wirowania, dopóki próżnia w wirówce nie osiągnie 250 μm.
6. Zebrać frakcje o objętości 1 ml od góry do dołu gradientu za pomocą frakcjonatora gradientu Auto-Densi-Flow. Probówki należy natychmiast po zebraniu umieścić na lodzie. Wymieszać zawartość probówek poprzez kilkukrotne odwrócenie i pobrać 50 μl każdej frakcji do oznaczania ilościowego metodą ELISA lub testem aktywności odwrotnej transkryptazy.

4. Lokalizacja rdzeni HIV-1 i przechowywanie rdzeni

1. Przed przeprowadzeniem testów rozpakowywania (uncoating assays) ważne jest określenie, które frakcje zawierają nienaruszone rdzenie HIV-1. Można to ustalić za pomocą testu p24 ELISA lub testu aktywności odwrotnej transkryptazy, wykorzystując 50 μl alikwoty z kroku 3.6.
2. Odzysk CA związanego z rdzeniami jest często powiązany ze stabilnością rdzeni. Należy zmierzyć ilość CA związanego z rdzeniem za pomocą testu p24 ELISA⁹, wykorzystując próbkę z każdej frakcji. Alternatywnie można zmierzyć aktywność odwrotnej transkryptazy każdej frakcji. Przy zastosowaniu obu metod szczyt powinien przypadać około frakcji 10.
3. Należy połączyć frakcje zawierające rdzenie. Jeśli rdzenie nie będą natychmiast użyte do testu rozpakowywania, należy podzielić połączone rdzenie na alikwoty o objętości od 0,2 do 0,3 ml, zamrozić je gwałtownie w ciekłym N2 i przechowywać w temperaturze -80°C. Rdzenie zamrożone w ten sposób nadają się do testu rozpakowywania. Wydajność CA związanego z rdzeniem wynosi zazwyczaj 1-2 μg p24 na mililitr lub około 15% całkowitego p24 związanego z wirionem.

5. Analiza kinetyczna rozpakowywania HIV-1

1. Ilość rdzeni HIV-1 wymagana na jedną reakcję rozpakowywania wynosi około 50 ng. Aby przeprowadzić test rozpakowywania in vitro, należy wstępnie rozcieńczyć alikwot rdzeni równą objętością zimnego buforu 1XSTE, aby zmniejszyć lepkość zawiesiny i zminimalizować błędy pipetowania.
2. Następnie rozcieńczyć 100 μl rdzeni w 0,15 ml zimnego buforu 1XSTE zawierającego 10 μg/ml BSA w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Suplementujemy bufor STE białkiem BSA (10 μg/ml), aby zminimalizować adsorpcję CA do ścianek probówki. Wymieszać, odwracając probówkę kilka razy. Nie mieszać próbek w wirówce typu vortex. Inkubować probówki w łaźni wodnej w temperaturze 37°C w określonych odstępach czasu (15, 30, 60 i 120 min). Probówki powinny być zanurzone w łaźni wodnej co najmniej do poziomu próbki wewnątrz, aby zapewnić równomierne ogrzewanie.
3. Podczas inkubacji należy okresowo (zazwyczaj co 5-10 min) delikatnie mieszać zawartość probówki, stukując w nią palcem. Dla kontroli zero-minutowej rozcieńczyć 100 μl rdzeni w 0,15 ml zimnego buforu 1XSTE i inkubować na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu (120 min). Kontrola zero-minutowa wskazuje podstawową wartość rozpakowywania i służy do określenia wzrostu rozpakowywania rdzeni inkubowanych w 37°C w różnych odstępach czasu.
4. Po zakończeniu okresu inkubacji zatrzymać proces rozpakowywania, umieszczając probówki na lodzie na 10 minut.
5. Wirować probówki przy 45 000 rpm (rotor TLA-55; 125 000 x g przy r_max) przez 20 minut w temperaturze 4°C. Spowoduje to osadzenie nienaruszonych rdzeni, a wolne CA uwolnione w wyniku rozpakowywania rdzeni pozostanie w supernatancie. Rotor powinien zostać schłodzony do 4°C przed załadowaniem próbek.
6. Przenieść supernatant do nowych schłodzonych probówek do mikrocentryfugi, najlepiej używając końcówek do nakładania żelu przechowywanych w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że osad nie będzie widoczny gołym okiem, dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas pipetowania supernatantu. Resuspendować osady w 250 μl rozcieńczalnika do próbek ELISA (0,5% Triton X-100 i 5% surowicy cielęcej donora w PBS). Aby zapewnić efektywne rozpuszczenie osadu, zastosować vortex po dodaniu rozcieńczalnika do próbek ELISA. Ilość CA w osadzie i supernatancie określić za pomocą testu ELISA p24 zgodnie z opisem w następnej sekcji.
7. Stopień rozpakowywania uzyskuje się obliczając frakcję CA obecną w supernatancie.

6. Analiza CA za pomocą testu ELISA dla p24

1. Dostępnych jest wiele komercyjnych zestawów ELISA, które można wykorzystać do ilościowego oznaczenia CA. Należy użyć dowolnego komercyjnego lub opracowanego wewnętrznie ("in-house") testu ELISA i uwzględnić standardy p24 w celu wyznaczenia liniowości analizy. W celu zapewnienia dokładności należy przeprowadzić analizę rozcieńczeń próbek.
2. Opracowaliśmy własny test ELISA, którego rutynowo używamy do oznaczania CA. Procedura została zaadaptowana z poprzedniego raportu¹¹ i jest wykonywana przy użyciu przeciwciał wychwytujących i detekcyjnych dostępnych w ramach NIH AIDS Research and Reference Reagent Program.

7. Reprezentatywne wyniki:

Przykład wyniku testu ELISA służącego do oznaczenia frakcji zawierających rdzenie przedstawiono na Rysunku 1. Po zebraniu frakcji (po 1 ml każda), 50 μl próbki z każdej frakcji wykorzystano do wykonania rozcieńczeń seryjnych i analizy metodą ELISA. Całkowita ilość p24 uzyskana poprzez zsumowanie wartości dla dwunastu frakcji wyniosła 14,5 μg. Jak pokazano na rysunku, frakcje od 8 do 10 zawierały rdzenie. Wartość p24 dla frakcji zawierających rdzenie wyniosła 2,17 μg. Procent p24 związanego z rdzeniami (14,97%) określono obliczając stosunek wartości p24 dla frakcji rdzeniowych (2,17 μg) do całkowitej wartości p24 (14,5 μg). Frakcja 1 lub 2 zawsze zawiera najwyższą ilość p24; reprezentuje ona wolne CA, które nie jest związane z rdzeniami. Następnie obserwuje się stopniowy spadek wartości p24 w każdej kolejnej frakcji, a potem gwałtowny wzrost i wreszcie gwałtowny spadek wartości p24. Przy zachowaniu należytej staranności podczas nakładania gradientu, szczyt CA związanego z rdzeniami przypada w okolicy frakcji 10.

Typowy wynik uzyskany podczas badania kinetyki odowładkowania rdzeni HIV-1 przedstawiono na Rysunku 2. Wykres pokazuje zależny od czasu wzrost odowładkowania rdzeni HIV-1 typu dzikiego. Wartość procentowa odowładkowania została uzyskana poprzez obliczenie frakcji CA obecnej w nadsączu. Przy odpowiedniej praktyce test ten jest wysoce powtarzalny i przydatny do określania stabilności rdzeni wirusowych in vitro. Należy pamiętać, że powtarzalność testu jest w dużym stopniu zależna od prawidłowego obchodzenia się z próbkami podczas procedury. Ponieważ rdzenie są termolabilne, próbki powinny być przechowywane w temperaturze 4°C przez cały czas trwania testu, z wyjątkiem okresu inkubacji.

Rysunek 1 Centryfugacja w gradiencie gęstości równowagowej rdzeni HIV-1. Stężoną zawiesinę wirusa naniesiono na górę liniowego gradientu sacharozy 30-70%, przykrytego 1% Triton-X-100. Po nocnej centryfugacji przy 187,000 x g i 4°C zebrano frakcje o objętości 1 ml od góry (Frakcja 1) do dołu (Frakcja 12), a następnie oznaczono ilość p24 metodą ELISA.

Rysunek 2 Kinetyka rozpakowania HIV-1 in vitro. Oczyszczone rdzenie HIV-1 rozcieńczono i inkubowano w 37°C przez wskazane odstępy czasu. Próbkę z czasu 0 min inkubowano na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu. Po inkubacji próbki poddano ultrawirowaniu przy 125,000 x g przez 20 minut w 4°C. Nadfiltr i osad rozdzielono i przeanalizowano za pomocą testu ELISA p24. Stopień rozpakowania określono zgodnie z opisem w tekście protokołu. Każda reakcja rozpakowania była przeprowadzana w dublecie; słupki błędów obejmują zakres dwóch wartości.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda oczyszczania rdzeni HIV-1 w celu badania procesu odopakowywania in vitro jest przydatna do analizy tej fazy cyklu życiowego HIV-1, zwłaszcza ze względu na brak zwalidowanej metody analizy odopakowywania HIV-1 w komórkach docelowych. Chociaż w tej metodzie do oczyszczania rdzeni zastosowano ultracentryfugację równowagową, inni autorzy wykorzystywali bezpośrednie wirowanie po krótkiej lizie w 1% Triton-X-100^{12, 13} lub wirowanie przez poduszkę sacharozową z nałożonym 0,1% Triton-X-10...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Cellgro	10-013-CV
PBS	Cellgro	21-031-CV
Triton-X-100	Mallinckrodt Baker Inc.	9002-93-1
Tween 20	Acros Organics	9005-64-5
0,25% trypsyna-EDTA	Cellgro	25-053-CI
2XBBS			Skład: 50 mM BES [pH 6,95], 280 mM NaCl i 1,5 mM Na2HPO4Dostosować pH do wartości 6,95 w temperaturze pokojowej. Sterylizować przez filtrowanie. &i przechowywać w alikwotach w temperaturze -20°C°C.
Przeciwciało powlekające: Przeciwciało monoklonalne przeciwko p24 (183-H12-5C)	Krajowe Instytuty Zdrowia	3537
Przeciwciało pierwszorzędowe: HIV-Ig (hiperimmunologiczna surowica pacjenta)	Krajowe Instytuty Zdrowia	3957
Przeciwciało wtórne: Przeciwciało kozie przeciwko ludzkiemu IgG, koniugowane z peroksydazą	Pierce, Thermo Scientific	31130
podłoże HRP	KPL Inc	50-76-11
płytki 96-dołkowe Immulon 2HB	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3455
Rotory SW32Ti i SW32.1 Ti oraz kompatybilna ultrawirówka	Beckman Coulter Inc.
Rotor TLA-55 i nakładkowa ultracentryfuga stołowa	Beckman Coulter Inc.
Probówki do wirówek mikroszybkich	Beckman Coulter Inc.	326823, 358123, 357448
Frakcjonator gradientowy gęstości Auto-Densi Flow	Labconco Corp.	4517000
Kształtowanie gradientu	CBS Scientific Co. Inc.	GM-20