Przewlekłe zwężenie nerwu kulszowego i testy nadwrażliwości na ból u szczurów

Summary

Ze względu na prostotę operacji i solidny wynik behawioralny, przewlekłe zwężenie nerwu kulszowego jest jednym z najwybitniejszych zwierzęcych modeli bólu neuropatycznego. W ciągu 24 godzin po zabiegu ustalana jest nadwrażliwość na ból, którą można zmierzyć ilościowo za pomocą estezjometru von Freya (test mechaniczny) i miernika analgezji podeszwowej (test termiczny).

Abstract

Przewlekły ból neuropatyczny, wynikający z uszkodzenia ośrodkowego lub obwodowego układu nerwowego, jest powszechnym i wyniszczającym stanem, dotykającym 7-18% populacji^1,2. Objawy obejmują ból spontaniczny (mrowienie, pieczenie, podobny do porażenia prądem), zaburzenia czucia, parestezje, allodynia (ból wynikający z normalnie niebolesnych bodźców) i hiperalgezja (zwiększona reakcja na bolesne bodźce). Objawy czuciowe współwystępują z zaburzeniami behawioralnymi, takimi jak bezsenność i depresja. Aby zbadać przewlekły ból neuropatyczny opracowano kilka modeli zwierzęcych naśladujących uszkodzenie nerwów obwodowych, jednym z najczęściej stosowanych jest jednostronne przewlekłe zwężenie nerwu kulszowego Bennetta i Xie (1988) (CCI)³ (Figura 1). W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wykonywania CCI i badania nadwrażliwości na ból.

CCI jest wykonywane w znieczuleniu, z odsłoniętym nerwem kulszowym po jednej stronie poprzez nacięcie skóry i przecięcie tkanki łącznej między mięśniami pośladkowymi powierzchownymi a mięśniami dwugłowymi uda. Cztery chromowe ligatury jelitowe są luźno zawiązane wokół nerwu kulszowego w odstępach 1 mm, aby tylko zamknąć, ale nie zatrzymać przepływu krwi w płucach. Rana jest zamykana szwami w mięśniu i zszywkami w skórze. Następnie zwierzę może dojść do siebie po operacji przez 24 godziny, zanim rozpocznie się badanie nadwrażliwości na ból.

Do testów behawioralnych, szczury są umieszczane w aparacie testowym i mogą przyzwyczaić się do procedury testowej. Badany obszar to środkowa powierzchnia podeszwowa tylnej łapy (ryc. 2), która mieści się w dystrybucji nerwu kulszowego. Mechaniczny próg wycofania jest oceniany poprzez mechaniczną stymulację zarówno zranionych, jak i nieuszkodzonych tylnych łap za pomocą elektronicznego dynamicznego estezjometru von Freya lub ręcznego włoska von Freya⁴. Mechaniczny próg wycofania to maksymalny wywierany nacisk (w gramach), który wyzwala wycofanie łapy. W celu pomiaru opóźnienia wycofania termicznego, po raz pierwszy opisanego przez Hargreavesa i in. (1988), tylna łapa jest wystawiona na działanie wiązki promieniowania cieplnego przez przezroczystą szklaną powierzchnię za pomocą miernika przeciwbólowego^{podeszwy 5,6}. Opóźnienie wycofania bodźca cieplnego jest rejestrowane jako czas wycofania łapy zarówno u rannych, jak i nieuszkodzonych tylnych łap. Po CCI mechaniczny próg wycofania, a także opóźnienie termicznego wycofania w uszkodzonej łapie są znacznie zmniejszone w porównaniu z pomiarami wyjściowymi i nieuszkodzoną łapą (ryc. 3). Model CCI uszkodzenia nerwów obwodowych w połączeniu z testami nadwrażliwości na ból stanowi system modelowy do badania skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych w modyfikacji przewlekłego bólu neuropatycznego. W naszym laboratorium wykorzystujemy CCI wraz z wrażliwością termiczną i mechaniczną tylnych łap do badania roli interakcji neuroimmunologicznych w patogenezie i leczeniu bólu neuropatycznego.

Protocol

1. Przewlekłe zwężenie nerwu kulszowego

Techniki aseptyczne powinny być stosowane podczas zabiegu chirurgicznego. Zdezynfekuj powierzchnię roboczą chirurgiczną 70% etanolem i przygotuj wcześniej sterylne narzędzia (np. cienkie nożyczki, kleszcze i retraktor), gazy, zszywki i waciki przez autoklawowanie. W przypadku wielu operacji należy oczyścić i ponownie wysterylizować narzędzia za pomocą 70% etanolu lub suchego sterylizatora kulek między szczurami. Należy nosić maskę chirurgiczną, czepek do włosów i sterylne rękawiczki.

Aby zwęzić nerw, przygotuj chromiczny szew jelitowy, krojąc go na małe kawałki o długości około 3 cm, zanurzone w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, aby zapobiec wysuszeniu. Do zamknięcia rany należy użyć dostępnych w handlu sterylnych szwów jedwabnych.

1. Znieczulić szczura w komorze indukcyjnej przy użyciu 5% izofluranu w_O2, a następnie dostarczyć 2% izofluranu w_O2 za pomocą specjalnie przygotowanej maski na twarz i monitorować znieczulone zwierzę podczas zabiegu. Powszechnymi alternatywnymi środkami znieczulającymi są halotan wziewny lub pentobarbital sodu podawany dootrzewnowo. Należy unikać ketaminy, jako antagonisty receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA), ponieważ receptory te odgrywają ważną rolę w rozwoju bólu neuropatycznego.
2. Ogol lewą tylną nogę szczura. Następnie umieść zwierzę na macie grzewczej z regulacją temperatury 37°C i nałóż na oczy smarującą maść okulistyczną.
3. Wysterylizuj ogolony obszar trzema naprzemiennymi aplikacjami 70% alkoholu izopropylowego i roztworu jodu.
4. Gdy szczur leży na klatce piersiowej/klatce piersiowej, unieś lewą tylną nogę i utrzymaj się w pozycji z kobiecą nogą pod kątem 90° do kręgosłupa za pomocą taśmy maskującej na stopie.
5. Wykonaj nacięcie w skórze równolegle, ale 3-4 mm poniżej kości udowej i uwolnij skórę z mięśnia otaczającego nacięcie, przecinając tkankę łączną.
6. Za pomocą nożyczek przetnij tkankę łączną między mięśniami pośladkowymi powierzchownymi a mięśniami dwugłowymi uda.
7. Użyj retraktora, aby poszerzyć szczelinę między dwoma mięśniami, umożliwiając wyraźną wizualizację nerwu kulszowego.
8. Za pomocą zakrzywionych kleszczy z końcówkami i mikronożyczek delikatnie uwolnij około 10 mm nerwu kulszowego (proksymalnego do trifurkacji kulszowej) z otaczającej tkanki łącznej.
9. Pod mikroskopem i dobrym źródłem światła zawiąż cztery ligatury (jelito chromowe 4.0, Ethicon, USA) podwójnym węzłem, w odległości 1 mm od siebie, proksymalnie do trifurkacji nerwu kulszowego. Dla każdej ligatury zacznij od pojedynczej luźnej pętli, a następnie chwyć dwa końce blisko pętli i dokręć, aż pętla będzie ledwo przylegająca, a ligatura nie przesuwa się wzdłuż nerwu. Aby utrzymać pętlę we właściwej pozycji, umieść drugą pętlę na pierwszej, aby zakończyć węzeł. Na koniec przytnij luźne końce ligatury do około 1 mm. Zwężenie nerwu powinno być minimalne i natychmiast zatrzymane w przypadku zaobserwowania krótkiego drgawki, aby zapobiec zatrzymaniu przepływu krwi w płuczce. Nadmierne zaciśnięcie więzadeł prowadzi do aksotomii i autotomii (samookaleczenia), które są niepożądanymi skutkami ubocznymi, które uniemożliwiają skuteczne testy nadwrażliwości na ból.
10. Użyj szwów (Mersilk 5.0, Ethicon), aby zamknąć warstwę mięśniową i zszywek (Autoclip, 9 mm), aby zapiąć skórę. Następnie użyj roztworu jodu (Riodine) do wysterylizowania rany.
11. Uważnie obserwuj szczura podczas okresu rekonwalescencji po znieczuleniu i pozwól mu dojść do siebie w oddzielnej klatce z płaską ściółką papierową (nie standardową ściółką do hodowli zwierząt), aby zapobiec zadławieniu się nieprzytomnego zwierzęcia.
    Przed podaniem jakiejkolwiek analgezji pooperacyjnej badacze powinni wziąć pod uwagę fakt, że może to kolidować z testami nadwrażliwości na ból. W rzeczywistości istnieją dowody na to, że miejscowe zastosowanie środka znieczulającego, lidokainy, w momencie urazu może zmienić rozwój bólu neuropatycznego i zmniejszyć stopień przebólu w^{poprzednich tygodniach}. Więcej informacji na ten temat można znaleźć w przeglądzie Bennetta i wsp. ⁸.

2. Pomiary zachowań bólowych

1. Zaleca się codzienne obchodzenie się ze szczurami przez kilka dni przed rozpoczęciem eksperymentu, aby przyzwyczaić szczury do ich opiekuna, zmniejszyć stres i ryzyko ugryzienia.
2. Przed przeprowadzeniem badań behawioralnych szczury muszą przyzwyczaić się do procedury badawczej i pomieszczenia dla zwierząt. Środowisko testowe powinno być ciche i dobrze kontrolowane, ze stałym poziomem temperatury i wilgotności oraz przeprowadzane o podobnej porze dnia podczas każdej sesji testowej.
3. Badanie nadwrażliwości na ból należy wykonać kilka razy przed CCI (punkt wyjściowy) i w różnych punktach czasowych po CCI, w zależności od potrzeb.

3. Mechaniczny próg wycofania

1. W dniu badania należy umieścić szczury w klatce testowej z podłogą z podwyższoną siatką na 15-30 minut przed pomiarem progów odstawienia, co pozwoli na zaprzestanie eksploracji klatki i pielęgnacji, a szczury mogą się zrelaksować i unieruchomić.
2. Używając dynamicznego estezjometru podeszwowego von Freya (Ugo Basile, Włochy), umieść stymulator dotyku z filamentem bezpośrednio pod środkową powierzchnią podeszwową tylnej łapy, omijając metalową siatkę, i naciśnij start. To podnosi włókno, aby mechanicznie stymulować podeszwową powierzchnię tylnej łapy z rosnącą siłą.

Ręczne włosy von Freya to seria włókien o rosnącej średnicy, które są kalibrowane tak, aby indukować określoną siłę po nałożeniu na skórę. Mogą być stosowane jako alternatywa dla elektronicznego dynamicznego estezjometru von Freya do pomiaru progu wycofania łapy, jak opisano wcześniej⁴. Istnieje również kilku alternatywnych producentów elektronicznych estezjometrów von Freya (np. IITC, USA i Somedic, Szwecja).

3. Zapisz mechaniczny próg wycofania zarówno z uszkodzonych, jak i nieuszkodzonych tylnych łap, w przeciwnej kolejności. To urządzenie wywiera nacisk na łapę, a po reakcji wycofania system automatycznie rejestruje i wyświetla maksymalną przyłożoną siłę (w gramach). Jeśli wystąpi niejednoznaczna reakcja (np. w przypadku poruszania się lub pielęgnacji), powtórz bodziec i ponownie zapisz próg. Lizanie lub potrząsanie tylną łapą po stymulacji jest oznaką zachowania związanego z bólem.
4. Stymulację mechaniczną powtórzyć 3 razy w odstępie około 5 min między bodźcami, zanotować progi, a następnie obliczyć średnią progów wycofania łapy.

4. Opóźnienie wycofania termicznego

Intensywność ciepła w podczerwieni (I.R.) przyrządu do testowania podeszwy powinna być dostosowana przed rozpoczęciem eksperymentu. W naszym laboratorium dostosowujemy intensywność tęczówki, aby uzyskać średnie opóźnienie wycofania łapy wynoszące około 10 sekund u naiwnych szczurów, a opóźnienie odcięcia ustawiamy na 20 sekund, aby uniknąć uszkodzenia tkanek w przypadku niepowodzenia w usunięciu łapy.

1. W dniu badania umieść szczury w klatce testowej ze szklaną podłogą na 15-30 minut przed pomiarem opóźnienia, pozwalając na zaprzestanie eksploracji klatki i pielęgnacji, a szczury na zrelaksowanie się i spokój.
2. Za pomocą termicznego przyrządu do znieczulenia podeszwowego (Ugo Basile, Włochy) umieść źródło podczerwieni bezpośrednio pod środkową powierzchnią podeszwową tylnej łapy i naciśnij start. To wystawia podeszwową powierzchnię tylnej łapy na wiązkę promieniowania cieplnego przez przezroczystą szklaną powierzchnię. Istnieją również alternatywni producenci przyrządów do termicznej analgezji podeszwowej (np. IITC, USA i Stoelting, USA).
3. Zapisz opóźnienie wycofania zarówno z uszkodzonych, jak i nieuszkodzonych tylnych łap, w przeciwnej kolejności. To urządzenie automatycznie rejestruje czas (w sekundach) od początku bodźca termicznego do wycofania łapy ze źródła ciepła. Jeśli wystąpi niejednoznaczna reakcja (np. w przypadku poruszania się lub uwodzenia), powtórz bodziec i ponownie zarejestruj opóźnienie. Lizanie lub potrząsanie tylną łapą po stymulacji jest oznaką zachowania związanego z bólem.
4. Powtórz stymulację cieplną co najmniej 3 razy w odstępie około 5 minut między bodźcami, zapisz opóźnienia, a następnie oblicz średnią opóźnień wycofania łapy.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład mechanicznego progu wycofania i opóźnienia termicznego wycofania w ipsilateralnych (uszkodzonych) i kontralateralnych (nieuszkodzonych) łapach szczurów Wistar jest pokazany przed (linia wyjściowa) i 2-12 dni po CCI na Rysunku 3A i Rysunku 3B. Na podstawie tych danych można zauważyć, że CCI powoduje znaczne obniżenie zarówno mechanicznych progów wycofania, jak i opóźnień termicznego wycofania tylnej łapy ipsilateralnej, co wskazuje na obecność nadwrażliwości na ból mechaniczny i termiczny, obie cechy przewlekłego bólu neuropatycznego.

Rysunek 1. Schemat ilustrujący rozmieszczenie ligatur w modelu CCI. Ten zwierzęcy model bólu neuropatycznego polega na umieszczeniu czterech luźnych ligatur chromowo-jelitowych na nerwie kulszowym, na poziomie połowy uda. Skutkuje to uszkodzeniem tylko części aferentów idących do stopy, a następnie nadwrażliwością bólową tylnej łapy.

Rysunek 2. Schemat obszaru tylnej łapy używany do testowania bólu. Środkowa powierzchnia podeszwowa tuż za opuszkami stóp, jak wskazuje czerwone kropkowane kółko, jest używana do testowania bólu. Obszar ten jest unerwiony głównie przez końcowe gałęzie nerwu kulszowego. Należy unikać opuszków pięty i stóp ze względu na różną wrażliwość skóry.

Rysunek 3. Nadwrażliwość na ból po przewlekłym zwężeniu nerwu kulszowego u szczurów. Po CCI następuje znaczne zmniejszenie progu wycofania łapy na bodźce mechaniczne (A) i opóźnienia wycofania łapy na bodźce termiczne (B) w uszkodzonej (ipsilateralnej) tylnej łapie w porównaniu z nieuszkodzoną (przeciwległą) tylną łapą (P<0,01 powtarzane pomiary 2-drożne ANOVA). Dane wskazują na średnią ± s.e.m., n=7 szczurów Wistar.

Discussion

CCI jest szeroko stosowanym modelem uszkodzenia nerwów obwodowych przewlekłego bólu neuropatycznego. Jest stosunkowo prosty do wykonania i powoduje silną i stabilną nadwrażliwość na ból przez co najmniej miesiąc po urazie. Po CCI szczury wykazują nieprawidłową postawę zranionej tylnej łapy (palce trzymane razem i zgięte podeszwowo oraz złamana łapa), a także powtarzające się potrząsanie, pilnowanie i lizanie zranionej tylnej łapy, co sugeruje obecność spontanicznego bólu⁹. Oprócz dysfunkcji sensorycznych kilku...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jelito chromowe	Ethicon Inc.	G-211	4-0 grubość
Isoflurane	Delvet Pty. Ltd., Seven Hills, NSW	n/a
Mersilk	Ethicon Inc.	W-580	grubość 5-0
Autoclip	BD Biosciences	427631	9 mm stal nierdzewna
Riodine	Orion	R1000802F	1% w/v jodu
Termiczny instrument do analgezji podeszwowej	Ugo Basile	37370
Dynamiczny estezjometr podeszwowy	Ugo Basile	37400