Przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego i badanie nadwrażliwości bólowej u szczurów

Podsumowanie

Ze względu na prostotę zabiegu chirurgicznego oraz wyraźne efekty behawioralne, przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego jest jednym z najważniejszych modeli zwierzęcych bólu neuropatycznego. W ciągu 24 h po operacji rozwija się nadwrażliwość bólowa, którą można zmierzyć ilościowo za pomocą estezjometru von Freya (test mechaniczny) oraz urządzenia do pomiaru analgesii podeszwowej (test termiczny).

Streszczenie

Przewlekły ból neuropatyczny, wynikający z uszkodzenia ośrodkowego lub obwodowego układu nerwowego, jest powszechnym i wyniszczającym schorzeniem, dotykającym 7-18% populacji^1,2. Objawy obejmują ból spontaniczny (mrowienie, pieczenie, uczucie porażenia prądem), dysestezję, parestezję, allodynię (ból wywołany bodźcami, które normalnie nie są bolesne) oraz hiperalgezję (zwiększoną reakcję na bodźce bólowe). Objawom sensorycznym towarzyszą zaburzenia behawioralne, takie jak bezsenność i depresja. W celu badania przewlekłego bólu neuropatycznego opracowano kilka modeli zwierzęcych naśladujących uszkodzenie nerwów obwodowych; jednym z najszerzej stosowanych jest model jednostronnego przewlekłego ucisku nerwu kulszowego (CCI) według Bennetta i Xie (1988)³ (Rysunek 1). W niniejszej pracy przedstawiamy metodę przeprowadzania procedury CCI oraz testowania nadwrażliwości bólowej.

CCI przeprowadza się w znieczuleniu, odsłaniając nerw kulszowy po jednej stronie poprzez wykonanie nacięcia skóry i przecięcie tkanki łącznej między mięśniem pośladkowym powierzchownym a mięśniem dwugłowym uda. Cztery ligatury z katgutu chromowego zawiązuje się luźno wokół nerwu kulszowego w odstępach 1 mm, tak aby jedynie ograniczyć, a nie całkowicie zatrzymać przepływ krwi w ośnie powłokowej. Ranę zamyka się szwami w mięśniach i zszywkami w skórze. Następnie zwierzę regeneruje się po operacji przez 24 hrs przed rozpoczęciem testów nadwrażliwości na ból.

W celu przeprowadzenia testów behawioralnych szczury są umieszczane w aparaturze badawczej, gdzie mogą przyzwyczaić się do procedury testowej. Badanym obszarem jest środkowa powierzchnia podeszwowa tylnej łapy (Rycyna 2), która znajduje się w obszarze unerwienia nerwu kulszowego. Próg wycofania mechanicznego ocenia się poprzez mechaniczną stymulację obu tylnych łap (zarówno uszkodzonej, jak i nieuszkodzonej), wykorzystując elektroniczny dynamiczny anestezjometr von Frey do pomiaru czucia podeszwowego lub manualne włókna von Frey⁴. Próg wycofania mechanicznego to maksymalny nacisk (wyrażony w gramach), który wywołuje cofnięcie łapy. W celu pomiaru czasu reakcji termicznej (latencji wycofania), po raz pierwszy opisanego przez Hargreaves et al (1988), tylna łapa jest wystawiona na wiązkę promieniowania cieplnego przez przezroczystą powierzchnię szklaną przy użyciu miernika analgezji podeszwowej^5,6. Czas reakcji na bodziec cieplny jest rejestrowany jako czas wycofania łapy w obu tylnych łapach (uszkodzonej i nieuszkodzonej). Po przeprowadzeniu CCI zarówno próg wycofania mechanicznego, jak i czas reakcji termicznej w uszkodzonej łapie są istotnie obniżone w porównaniu z pomiarami bazowymi oraz łapą nieuszkodzoną (Rycina 3). Model CCI uszkodzenia nerwów obwodowych w połączeniu z testami nadwrażliwości bólowej stanowi system modelowy do badania skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych w modyfikacji przewlekłego bólu neuropatycznego. W naszym laboratorium wykorzystujemy CCI wraz z oceną wrażliwości termicznej i mechanicznej tylnych łap do badania roli oddziaływań neuroimmunologicznych w patogenezie i leczeniu bólu neuropatycznego.

Protokół

1. Przewlekłe uciskanie nerwu kulszowego

Do procedury chirurgicznej należy stosować techniki aseptyczne. Powierzchnię roboczą zdezynfekować 70% etanolem, a wcześniej przygotować sterylne narzędzia (np. precyzyjne nożyczki, pęsetę i rozieracz), gazy, zszywki oraz tampony poprzez autoklawowanie. W przypadku przeprowadzania wielu operacji, narzędzia należy czyścić i ponownie sterylizować 70% etanolem lub suchym sterylizatorem perłowym pomiędzy kolejnymi szczurami. Należy nosić maskę chirurgiczną, czepek oraz sterylne rękawiczki.

W celu przekręcenia nerwu należy przygotować chromowaną nicią jelitową, tnąc ją na małe kawałki o długości około 3 cm i zanurzając je w jałowej soli fizjologicznej, aby zapobiec wysychaniu. Do zamknięcia rany należy użyć dostępnych w handlu jałowych nici jedwabnych.

1. Z narkozuj szczura w komorze indukcyjnej, stosując 5% izofluranu w O₂, następnie podawaj 2% izofluranu w O₂ za pomocą specjalnie wykonanej maski twarzowej i monitoruj znieczulone zwierzę podczas procedury. Powszechnymi alternatywnymi środkami znieczulającymi są wziewny halotan lub dożylnie podawany pentobarbital sodu. Należy unikać stosowania ketaminy, będącej antagonistą receptorów N-metylo-D-asparaginianu (NMDA), ponieważ receptory te odgrywają ważną rolę w rozwoju bólu neuropatycznego.
2. Wygol lewą tylną kończynę szczura. Następnie umieść zwierzę na termoregulatorowanej macie grzewczej w temperaturze 37°C i nałóż nawilżającą maść okulistyczną do oczu.
3. Zdezynfekuj ogoloną okolicę, stosując naprzemiennie trzy aplikacje 70% alkoholu izopropylowego i roztworu jodu.
4. Kiedy szczur leży na klatce piersiowej, unieś lewą tylną kończynę i utrzymaj ją w pozycji z kością udową pod kątem 90° względem kręgosłupa, mocując stopę taśmą maskującą.
5. Wykonaj nacięcie skóry równolegle, ale 3-4 mm poniżej kości udowej, a następnie oddziel skórę od mięśni otaczających nacięcie, przecinając tkankę łączną.
6. Za pomocą nożyczek tępych przetnij tkankę łączną między mięśniem pośladkowym powierzchownym a mięśniem dwugłowym uda.
7. Użyj rozwieraka, aby poszerzyć szczelinę między tymi dwoma mięśniami, co umożliwi wyraźną wizualizację nerwu kulszowego.
8. Używając zakrzywionej pęsety z tępymi końcówkami i mikronożyczek, delikatnie uwolnij około 10 mm nerwu kulszowego (proksymalnie względem trifurkacji nerwu kulszowego) z otaczającej go tkanki łącznej.
9. Pod mikroskopem i przy dobrym źródle światła zawiąż cztery ligatury (catgut chromowy 4.0, Ethicon, USA) podwójnym węzłem w odstępach 1 mm, proksymalnie względem trifurkacji nerwu kulszowego. W przypadku każdej ligatury zacznij od pojedynczej luźnej pętli, następnie chwyć dwa końce blisko pętli i zaciśnij, aż pętla będzie ledwie dopasowana, a ligatura nie będzie przesuwać się wzdłuż nerwu. Aby utrzymać pętlę w odpowiedniej pozycji, nałóż drugą pętlę na pierwszą, aby dokończyć węzeł. Na koniec utnij wolne końce ligatury do długości około 1mm. Ucisk nerwu powinien być minimalny i należy go natychmiast przerwać, jeśli zaobserwuje się krótki drgnięcie, aby zapobiec zatrzymaniu przepływu krwi w epineurium. Zbyt mocne zaciśnięcie ligatur prowadzi do aksotomii oraz autotomii (samookaleczenia), co jest niepożądanym efektem ubocznym uniemożliwiającym pomyślne testowanie nadwrażliwości bólowej.
10. Użyj szwów (Mersilk 5.0, Ethicon) do zamknięcia warstwy mięśniowej i zszywek (Autoclip, 9 mm) do zamknięcia skóry. Następnie użyj roztworu jodu (Riodine), aby zdezynfekować ranę.
11. Uważnie obserwuj szczura w okresie wybudzania z narkozy i pozwól mu dojść do siebie w oddzielnej klatce z płaską wyściółką papierową (nie standardową wyściółką hodowlaną), aby zapobiec zadławieniu się nieprzytomnego zwierzęcia.
    Przed podaniem jakiejkolwiek pooperacyjnej analgezji badacze powinni wziąć pod uwagę fakt, że może ona zakłócić testy nadwrażliwości bólowej. W rzeczywistości istnieją dowody na to, że miejscowe zastosowanie środka znieczulającego, lidokainy, w momencie urazu może zmienić rozwój bólu neuropatycznego i zmniejszyć stopień hiperalgezji w kolejnych tygodniach⁷. Dalszą dyskusję na ten temat można znaleźć w przeglądzie opracowanym przez Bennett et al⁸.

2. Pomiary zachowań bólowych

1. Zaleca się codzienną obsługę szczurów przez kilka dni przed rozpoczęciem eksperymentu, aby przyzwyczaić zwierzęta do opiekuna, zredukować stres oraz ryzyko pogryzień.
2. Przed testami behawioralnymi szczury muszą zostać oswojone z procedurą testową oraz klatką badawczą. Środowisko testowe powinno być ciche i dobrze kontrolowane, z zachowaniem stałej temperatury i wilgotności, a każda sesja testowa powinna odbywać się o podobnej porze dnia.
3. Testy nadwrażliwości bólowej należy przeprowadzić kilkakrotnie przed zabiegiem CCI (poziom bazowy) oraz w różnych punktach czasowych po CCI, zgodnie z potrzebami.

3. Próg wycofania mechanicznego

1. W dniu testu umieść szczury w klatce testowej z podwyższoną siatkową podłogą na 15-30 minut przed pomiarem progów wycofania, aby umożliwić zaprzestanie eksploracji klatki i pielęgnacji, a zwierzętom pozwolić na odprężenie się i znieruchomienie.
2. Używając dynamicznego estezjometru von Freya do powierzchni podeszwowych (Ugo Basile, Włochy), ustaw jednostkę stymulatora dotykowego z włóknem bezpośrednio pod środkową częścią podeszwy tylnej łapy, unikając kontaktu z metalową siatką, i naciśnij klawisz start. Spowoduje to uniesienie włókna, aby mechanicznie stymulować powierzchnię podeszwową tylnej łapy z rosnącą siłą.

Ręczne włókna von Frey to seria filamentów o rosnącej średnicy, które są skalibrowane tak, aby wywierać określoną siłę podczas przykładania do skóry. Mogą być one stosowane jako alternatywa dla elektronicznego dynamicznego plantarnego estezjometru von Frey do pomiaru progu wycofania łapy, zgodnie z wcześniejszym opisem⁴. Istnieje również kilku alternatywnych producentów elektronicznych estezjometrów von Frey (np. IITC, USA oraz Somedic, Szwecja).

3. Zapisz próg wycofania mechanicznego dla obu tylnych łap, uszkodzonej i nieuszkodzonej, w kolejności zrównoważonej. Urządzenie to wywiera nacisk na łapę, a po wystąpieniu reakcji wycofania system automatycznie rejestruje i wyświetla maksymalną przyłożoną siłę (w gramach). W przypadku wystąpienia niejednoznacznej odpowiedzi (np. podczas przemieszczania się lub pielęgnacji), powtórz stymulację i ponownie zapisz próg. Lizanie lub potrząsanie tylną łapą po stymulacji jest oznaką zachowania związanego z bólem.
4. Powtórz stymulację mechaniczną 3 razy w odstępach około 5 min między bodźcami, zapisz wartości progowe, a następnie oblicz średnią z progów wycofania łapy.

4. Opóźnienie odruchu wycofania z bodźca termicznego

Intensywność ciepła podczerwonego (I.R.) w urządzeniu do testu podeszwowego powinna zostać dostrojona przed rozpoczęciem eksperymentu. W naszym laboratorium dostosowujemy intensywność I.R. tak, aby średni czas latencji wycofania łapy u naiwnych szczurów wynosił około 10 seconds, a czas odcięcia (cut-off latency) ustawiamy na 20 seconds, aby uniknąć uszkodzenia tkanek w przypadku braku wycofania łapy.

1. W dniu testu umieść szczury w klatce testowej z szklanym dnem na 15-30 minut przed pomiarem latencji, aby umożliwić zakończenie eksploracji klatki oraz czynności pielęgnacyjnych, a zwierzętom pozwolić na rozluźnienie się i pozostanie w bezruchu.
2. Używając urządzenia do badania termicznej analgesji podeszwowej (Ugo Basile, Włochy), ustaw źródło podczerwieni bezpośrednio pod powierzchnią środkową podeszwy tylnej łapy i naciśnij przycisk start. Powoduje to wystawienie powierzchni podeszwowej tylnej łapy na wiązkę promieniowania cieplnego poprzez przezroczystą szklaną powierzchnię. Istnieją również alternatywni producenci urządzeń do badania termicznej analgesji podeszwowej (np. IITC, USA oraz Stoelting, USA).
3. Zapisz latencję wycofania dla obu tylnych łap – uszkodzonej i nieuszkodzonej – w kolejności zrównoważonej. Urządzenie to automatycznie rejestruje czas (w sekundach) od rozpoczęcia bodźca termicznego do wycofania łapy ze źródła ciepła. W przypadku wystąpienia niejednoznacznej reakcji (np. w razie przemieszczania się lub pielęgnacji), powtórz bodziec i ponownie zapisz latencję. Lizanie lub potrząsanie tylną łapą po stymulacji jest oznaką zachowania związanego z bólem.
4. Powtórz stymulację cieplną co najmniej 3 razy w odstępach około 5 min między bodźcami, zapisz latencje, a następnie oblicz średnią latencji wycofania łapy.

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład mechanicznego progu wycofania oraz latencji wycofania termicznego w łapach ipsilateralnych (uszkodzonych) i kontralateralnych (nieuszkodzonych) szczurów Wistar przed zabiegiem (baseline) oraz od 2 do 12 dni po CCI przedstawiono na Rysunku 3A oraz Rysunku 3B. Z tych postaci wynika, że CCI powoduje istotne obniżenie zarówno mechanicznych progów wycofania, jak i latencji wycofania termicznego w ipsilateralnej łapie tylnej, co wskazuje na obecność mechanicznej i termicznej nadwrażliwości bólowej, będących cechami przewlekłego bólu neuropatycznego.

Rysunek 1. Schemat ilustrujący rozmieszczenie ligatur w modelu CCI. Ten model zwierzęcy bólu neuropatycznego polega na założeniu czterech luźnych ligatur z jelita chromowanego na nerw kulszowy na poziomie połowy uda. Prowadzi to do uszkodzenia jedynie części włókien doprowadzających do stopy i w konsekwencji do nadwrażliwości bólowej tylnej łapy.

Rysunek 2. Schemat obszaru tylnej łapy wykorzystywanego do testów bólu. Do testowania bólu wykorzystuje się środkową powierzchnię podeszwową, znajdującą się bezpośrednio za poduszkami stopy, zaznaczoną czerwonym przerywanym okręgiem. Obszar ten jest unerwiony głównie przez gałęzie końcowe nerwu kulszowego. Należy unikać pięty i poduszek stopy ze względu na odmienną wrażliwość skóry.

Rysunek 3. Nadwrażliwość na ból po przewlekłej konstrikcji nerwu kulszowego u szczurów. Po CCI stwierdzono istotne obniżenie progu wycofania łapy w odpowiedzi na bodźce mechaniczne (A) oraz skrócenie czasu utajenia wycofania łapy w odpowiedzi na bodźce termiczne (B) w uszkodzonej (ipsilateralnej) tylnej łapie w porównaniu z nieuszkodzoną (kontralateralną) tylną łapą (P<0.01, dwuczynnikowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami). Dane przedstawiają średnią ± s.e.m, n=7 szczurów rasy Wistar.

Dyskusja

CCI jest powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia nerwu obwodowego w badaniach nad chronicznym bólem neuropatycznym. Jest on stosunkowo prosty w wykonaniu i wywołuje silną oraz stabilną nadwrażliwość bólową utrzymującą się przez co najmniej miesiąc po urazie. Po zastosowaniu CCI u szczurów obserwuje się nieprawidłową postawę uszkodzonej tylnej łapy (palce złączone i zgięte podeszwowo, a stopa wywinięta na zewnątrz), a także powtarzające się potrząsanie, osłanianie i lizanie uszkodzonej łapy, co sugeruje występowanie bó...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nici z jelit owczych chromowane	Ethicon Inc.	G-211	grubość 4-0
Izofluran	Delvet Pty. Ltd., Seven Hills, NSW	n/a
Mersilk	Ethicon Inc.	W-580	grubość 5-0
Autoclip	BD Biosciences	427631	9 mm stal nierdzewna
Riodine	Orion	R1000802F	1% w/v jod
Urządzenie do termicznej analizji bólu podeszwowego	Ugo Basile	37370
Dynamiczny estezjometr podeszwowy	Ugo Basile	37400