Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie odpowiedzi neuronalnych w preparatach skrawków narządu jamistego wyrażających genetycznie kodowany czujnik wapnia

10.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3404

⸱

6 grudnia 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Anatomy and Cell Biology, The University of Kansas School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Narząd jamistnokaczkowy (VNO) wykrywa wewnątrzgatunkowe sygnały chemiczne, które przekazują informacje społeczne i rozrodcze. Przeprowadziliśmy eksperymenty obrazowania Ca2+ z wykorzystaniem myszy transgenicznych wykazujących ekspresję G-CaMP2 w tkance VNO. Podejście to pozwala nam analizować złożone wzorce odpowiedzi neuronów jamistnokaczkowych na liczne bodźce feromonowe.

Streszczenie

Organ vomeronasalny (VNO) wykrywa sygnały chemosensoryczne niosące informacje o statusie społecznym, seksualnym i rozrodczym osobników tego samego gatunku 1,2. Te sygnały wewnątrzgatunkowe, czyli feromony, a także sygnały pochodzące od niektórych drapieżników 3, aktywują neurony sensoryczne vomeronasalne (VSNs) z wysokim poziomem specyficzności i czułości 4. W neuronach VNO ekspresjonowane są co najmniej trzy odrębne rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G: V1R, V2R i FPR 5-14, które pośredniczą w detekcji bodźców chemosensorycznych. Aby zrozumieć, w jaki sposób informacje o feromonach są kodowane przez VNO, kluczowe jest przeanalizowanie profili odpowiedzi poszczególnych VSNs na różne bodźce oraz zidentyfikowanie konkretnych receptorów pośredniczących w tych odpowiedziach.

Neuroepitelia VNO są zamknięte w parze kości lemieszka. Półślepa struktura rurkowa VNO posiada jeden otwarty koniec (przewód womeronasalny) łączący się z jamą nosową. VSN wysyłają swoje dendryty do światła VNO, gdzie sygnały feromonowe kontaktują się z receptorami ekspresjonowanymi w guzkach dendrytycznych. Ciała komórkowe VSN tworzą warstwy pseudowielorzędowe, w których V1R i V2R są ekspresjonowane odpowiednio w warstwach apikalnej i bazalnej 6-8. W celu monitorowania odpowiedzi VSN na bodźce sensoryczne wykorzystano kilka technik 4,12,15-19. Wśród tych technik przygotowanie ostrych skrawków oferuje szereg zalet. Po pierwsze, w porównaniu z dysocjowanymi VSN 3,17, preparaty skrawkowe utrzymują neurony w ich natywnej morfologii, a dendryty komórek pozostają stosunkowo nienaruszone. Po drugie, ciała komórkowe VSN są łatwo dostępne w skrawkach koronalnych VNO, co umożliwia badania elektrofizjologiczne i eksperymenty obrazowe w porównaniu z preparatami całego nabłonka i preparatami typu whole-mount 12,20. Po trzecie, metodę tę można połączyć z technikami klonowania molekularnego, co pozwala na identyfikację receptorów.

Stymulacja sensoryczna wywołuje silny napływ Ca2+ do VSN, co świadczy o aktywacji receptorów 4,21. W związku z tym opracowaliśmy myszy transgeniczne wykazujące ekspresję G-CaMP2 w węchowych neuronach sensorycznych, w tym w VSN 15,22. Czułość oraz genetyczna natura sondy znacznie ułatwiają eksperymenty z obrazowaniem Ca2+. Metoda ta wyeliminowała proces wprowadzania barwnika stosowany w poprzednich badaniach 4,21. Stosujemy również system dostarczania ligandów, który umożliwia aplikację różnych bodźców do skrawków VNO. Połączenie tych dwóch technik pozwala nam na jednoczesne monitorowanie wielu neuronów w odpowiedzi na dużą liczbę bodźców. Na koniec opracowaliśmy półautomatyczny potok analizy w celu wspomagania przetwarzania obrazów.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować roztwory 10X R1, 10X R2 i 10X R3 zgodnie z tabelą.
    R1
    OdczynnikiMW(g/mol)mM (1X)Zapas 10X (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl2zapas 1 M110 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    NaH2PO4·H2O137.991.251.72

    R2
    OdczynnikMW(g/mol)mM (1X)Zapas 10X (g/L)
    NaHCO384.012521

    R3
    OdczynnikiMW(g/mol)mM (1X)Zapas 10X (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl2zapas 1 M220 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    HEPESzapas 1 M550 ml
  2. W dniu eksperymentu przygotować 1 litr sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego myszy (mACSF), mieszając 100 ml 10X R1 oraz 100 ml 10X R2 w wodzie dwukrotnie destylowanej (DDW), a następnie dodać 1,8 g dekstrozy (stężenie końcowe 10 mM). Taka metoda przygotowania zapobiega wytrącaniu się węglanu wapnia przy wysokim pH. Osmolarność mACSF wynosi około 310-315 mOsm/L. W razie potrzeby skorygować osmolarność za pomocą dekstrozy lub wody. Napowietrzyć roztwór mieszaniną Carboxygen (95% tlenu i 5% dwutlenku węgla) przez co najmniej 30 minut, a następnie dostosować pH roztworu do poziomu 7,2-7,4.
  3. W dniu eksperymentu przygotować 1 litr roztworu Ringera, mieszając 100 ml 10X R2 oraz 100 ml 10X R3 w DDW i dodając 1,8 g dekstrozy (10 mM). Osmolarność i pH roztworu Ringera powinny być zbliżone do wartości dla mACSF. Napowietrzyć roztwór mieszaniną Carboxygen.
  4. Przygotować 4% agarozę niskotopliwą (LMA) w mACSF lub roztworze Ringera. Roztopioną agarozę rozdzielić na alikwoty do probówek typu Eppendorf i przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia. LMA, składająca się z oczyszczonego polisacharydu, pozostaje w stanie płynnym w temperaturze 37°C i szybko krzepnie w temperaturze poniżej 25°C. Właściwości te sprawiają, że jest ona idealna do unieruchamiania VNO oraz do badań fizjologii żywych tkanek. Inne nieczyste materiały, takie jak agar, nie powinny być stosowane w eksperymentach na żywych tkankach, ponieważ nieokreślone składniki mogą zakłócać odpowiedź neuronalną.
  5. Przygotować bodźce feromonowe w roztworze Ringera. W przypadku moczu mysiego rozcieńczenie 1:100 wywołuje silne odpowiedzi.

2. Przygotowanie skrawka VNO

  1. Przed uśmierceniem zwierzęcia umieść dwie probówki z LMA na bloku grzejnym i ustaw temperaturę na >60°C w celu roztopienia agarozy. Po upłynnieniu żelu przenieś probówki do 37°C blok grzejny
  2. Dekapituj mysz G-CaMP2 po podaniu CO2 eutanazja. Przeciąć nożyczkami kości żuchwy w celu usunięcia dolnej szczęki. Odwarstwić tkankę podniebienia twardego, aby odsłonić jamę nosową (Rysunek 1A). Rozdzielć kości szczęki, wsuwając skalpel pomiędzy dwa przednie siekacze. Ostrożnie usuń kości szczęki, aby odsłonić VNO. Na tym etapie cały VNO można unieść z jamy nosowej, trzymając za kość ogonową (Rycina 1B). Natychmiast przenieś VNO do schłodzonego, natlenionego roztworu mACSF.
  3. Pod stereomikroskopem oddziel dwa organy Jacobsona (VNO), delikatnie przesuwając końcówką pęsety nr 5 wzdłuż ściany kości sitowej (Rycina 1C). Oddziel kość lemiesza osłaniającą tkankę O privileges (VNO). Delikatnie unieś całą tkankę VNO z jamkostności kostnej. Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić neuroepithelium. Niewielkie fragmenty kości pozostałe na powierzchni tkanki muszą zostać całkowicie usunięte przed zatopieniem. Pozostawione na tkance fragmenty mogą zostać uchwycone przez nóż mikrotomu, co spowoduje wyrwanie tkanki z bloku agarozy.
  4. Za pomocą pęsety przytrzymaj tylny koniec tkanki VNO i delikatnie zanurz go w stopionej agarozie (Rycina 1D). Szybko schłodzić probówkę w lodzie, aby agaroza stężała. Proces zatapiania i chłodzenia powinien trwać mniej niż 2 minuty.
  5. Do przygotowania przekrojów wykorzystano tarczę do krojenia tkanek VF300 (Precisionary Instruments, Greenville, NC). Blok agarozy zawierający VNO przycięto do odpowiedniego kształtu i przyklejono do uchwytów na tkankę (Rycina 1E i F). Włóż uchwyt do tkanek do metalowego cylindra i wypełnij pozostałą przestrzeń dodatkowym LMA. Po zestaleniu się LMA na lodzie niezwłocznie przystąp do sekcjonowania. Wprowadź schłodzony, natleniony mACSF do komory sekcjonującej i rozpocznij cięcie przy 180-200 μm grubość każdego przekroju. Należy dostosować prędkość posuwu oraz częstotliwość wibracji w taki sposób, aby tkanka nie została ściśnięta podczas krojenia, a VNO nie oddzieliło się od agarozy. Zebrane przekroje należy przenieść do komory inkubacyjnej z mACSF (Rysunek 2APlasterki pozostają żywe przez 6–8 godzin w natlenionym mACSF w temperaturze pokojowej. Rysunek 2B i C przedstawiono odpowiednio obrazy DIC oraz obrazy dwufotonowe skrawka VNO z G-CaMP2.

3. Przygotowanie komory obrazowania

  1. Umieść przekrój VNO na środku komory perfuzyjnej (Siskiyou, Grants Pass, OR) i przymocuj go za pomocą uchwytu do przekrojów (Warner Instruments, Hamden, CT) (Rysunek 3A). Nitki uchwytu powinny uciskać jedynie część LMA przekroju, a nie tkankę VNO. Natleniony mACSF jest dostarczany do komory perfuzyjnej przez wlot z prędkością ∼100 μl/sec, a ciecz jest odprowadzana przez igłę ssącą przez wylot, aby zapewnić ciągły przepływ świeżego mACSF (Rysunek 3A i B).
  2. Napełnij strzykawkę 30 ml roztworem Ringera i zamocuj ją w pompie strzykawkowej (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY). Ustaw prędkość pompy na 300-600 μl/min, aby zapewnić ciągły przepływ roztworu Ringera nad przekrojem (Rysunek 3C).
  3. Podłącz wylot z roztworem Ringera do pętli wtryskowej HPLC (Chromtech, Apple Valley, MN) (Rysunek 3D). W celu precyzyjnej kontroli dostarczanej objętości można wybrać różną wielkość pętli. W naszych doświadczeniach stosujemy pętlę 20 μl. Sterowanie pętlą wtryskową posiada dwie drogi przepływu (Rysunek 3E). W pozycji „load” próbki mogą być wprowadzane do pętli za pomocą precyzyjnej strzykawki Hamilton. Nadmiar próbki opuszcza pętlę przez wylot odpływowy. Roztwór Ringera tłoczony przez pompę strzykawkową omija pętlę z próbką i trafia bezpośrednio do wylotu, który jest połączony z końcówką perfuzyjną (Rysunek 3A i E). W pozycji „injection” roztwór z pompy przepływa przez pętlę z próbką i wypycha bodźce do wylotu (Rysunek 3E). Przed eksperymentem obrazowania należy usunąć pęcherzyki powietrza, aby zapewnić płynny przepływ płynu perfuzyjnego. Do dostarczania bodźców można zastosować również inne komercyjne lub niestandardowe systemy wtryskowe.
  4. Dostosuj położenie końcówki perfuzyjnej pod obiektywem 5X lub 10X tak, aby końcówka znajdowała się około 1 mm od przekroju VNO.
  5. Przy konfiguracji nowego systemu perfuzyjnego zaleca się pomiar czasu opóźnienia i czasu trwania dostarczenia próbki za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Wprowadź 0,1% barwnika rhodamine 6G do pętli z próbką i przełącz zawór do pozycji wtrysku 5 sekund po rozpoczęciu akwizycji obrazu (Rysunek 3F). Sygnał fluorescencyjny jest wykrywany między 10 a 30 sekundą. Gładka krzywa sygnału fluorescencyjnego wskazuje również, że pod obiektywem zanurzeniowym powstaje niewielka turbulencja i że do przekroju dociera odpowiednia perfuzja natlenionego mACSF.

4. Obrazowanie poklatkowe

  1. Do obrazowania time-lapse używamy mikroskopu Zeiss AxioSkope FS2 z obiektywem imersyjnym wodnym 10X lub 20X. Do rejestracji sygnałów G-CaMP2 stosowany jest standardowy filtr pasmowy GFP (450-490nm). Obrazy epifluorescencyjne są pozyskiwane za pomocą kamery CCD (Zeiss HRM) z binningiem 1X1 lub 2x2, w zależności od poziomu ekspresji G-CaMP2.
  2. Ustaw prędkość akwizycji na 1 klatkę na sekundę. Dostosuj intensywność światła, aby zminimalizować wybielanie sygnałów G-CaMP2 oraz fotouszkodzenia komórek. W każdym eksperymencie zazwyczaj pozyskujemy stos 60 klatek (∼60-70 sekund). W jednym zestawie doświadczeń przełącz zawór w pozycję wstrzykiwania w konkretnym punkcie czasowym (np. 5 sekunda na Rysunku 3F), aby uzyskać spójne opóźnienie czasowe we wszystkich próbach.
  3. Przeprowadź bieg testowy, używając roztworu Ringera jako bodźca. Ponownie dostosuj układ perfuzji, jeśli podczas wstrzykiwania próbki pojawią się artefakty ruchowe.
  4. Przeprowadź bieg kontrolny dodatni z moczem mysim rozcieńczonym 1:100 w roztworze Ringera. Typowa maksymalna wartość ΔF/F odpowiedzi G-CaMP2 na mocz mysi wynosi około 20-40%. W razie potrzeby żywotność skrawka można potwierdzić, podając 10 mM KCl w roztworze Ringera w celu stymulacji skrawków na koniec eksperymentów.
  5. Strzykawkę Hamiltona płucz w roztworze Ringera co najmniej trzy razy po nabraniu jednego bodźca. Pętlę próbkową płucz roztworem Ringera co najmniej trzy razy pomiędzy różnymi bodźcami. Kroki te zapobiegają zanieczyszczeniom krzyżowym między różnymi próbkami.
  6. Odczekaj od 4 do 10 min na regenerację VSN przed zastosowaniem kolejnego bodźca.

5. Analiza danych

  1. Przeprowadź rejestrację obrazów dla wszystkich zdjęć uzyskanych z jednego przekroju. W celu zautomatyzowania tego procesu stosujemy własny skrypt VBA w programie AxioVision (Carl Zeiss, North America). Wszystkie klatki obrazu w ramach tego samego eksperymentu są rejestrowane względem wspólnej, wybranej klatki referencyjnej za pomocą rejestracji elastycznej (Rysunek 4A). Rejestracja elastyczna, znana również jako rejestracja nieliniowa, jest kategorią techniki rejestracji obrazu, która polega na niesztywnym przekształceniu obrazu docelowego do obrazu referencyjnego. W tym przypadku wykorzystaliśmy implementację z programu AxioVision.

    Klatka referencyjna jest wybierana arbitralnie ze stosów obrazów.
  2. Przeprowadź odejmowanie obrazów, aby zidentyfikować komórki odpowiadające. W celu zautomatyzowania tego procesu stosujemy własne makra w programie ImageJ v1.42 (http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, MD). Dla każdego stosu generowany jest obraz projekcji minimalnej. Komórki odpowiadające stają się widoczne po odjęciu projekcji minimalnej od surowych stosów obrazów (Rysunek 4B).
  3. Zidentyfikuj obszary zainteresowania (ROI) na stosach po odejmowaniu i wyznacz współrzędne ROI za pomocą wtyczki Multi-Measure w programie ImageJ. Przetwórz wszystkie stosy dla jednego eksperymentu i zapisz wszystkie współrzędne ROI w głównej liście ROI (Rysunek 4C).
  4. Wykorzystaj główną listę ROI do pomiaru odpowiedzi komórek z surowych stosów obrazów za pomocą własnego makra oraz wtyczki Multi-Measure w programie ImageJ (Rysunek 4D). Wykreśl krzywe odpowiedzi oraz mapę ciepła w programie Matlab (Mathworks Inc., Natick, MA).

6. Reprezentatywne wyniki

Przykład eksperymentu obrazowania VNO z wykorzystaniem próbek moczu pobranych od czterech osobniczych myszy przedstawiono na Rysunku 5. Przekrój reaguje na stymulację moczem poprzez różnorodne wzorce aktywacji. Zidentyfikowano około 80 komórek wykazujących odpowiedź na co najmniej jeden z bodźców w postaci moczu, a ich wartości odpowiedzi ΔF/F przedstawiono na mapie ciepła (Rysunek 5A). Przebiegi odpowiedzi komórek 1, 2 i 3 przedstawiono na Rysunku 5B, obrazując czasowy przebieg aktywacji wywołanej stymulacją moczem. Komórka 1 wykazuje odpowiedź na obie próbki moczu samic, ale nie na próbki samców, podczas gdy komórka 2 wykazuje przeciwstawne wzorce aktywacji i reaguje wyłącznie na obie próbki samców. Komórka 3 jest aktywowana zarówno przez indywidualne próbki samców, jak i samic. Komórki 1 i 2 wykazują charakterystyczną odpowiedź na sygnały specyficzne dla płci obecne w moczu 15.

Disekcja narządu jamisto-nosowego (VNO), schematy anatomiczne, konfiguracja sprzętu do analizy sensorycznej.
Rysunek 1 Schematyczny przebieg procesu dysekcji VNO. A. Położenie anatomiczne VNO w głowie myszy. Głowa myszy G-CaMP2 została zdysekowana i ułożona odwrócone do góry dnem, z usuniętą tkanką miękką z podniebienia w celu odsłonięcia VNO. Wstawka przedstawia obraz fluorescencyjny tego samego widoku. Neuroepithelium VNO jest jasnozielone. B. Widok z boku wyizolowanego VNO zamkniętego w kości lemieszowej (góra) oraz obraz fluorescencyjny tego samego VNO (dół). C. Widok czołowy VNO i proces dysekcji. Jeden VNO jest oddzielany od przegrody, a następnie można usunąć kość lemieszową, aby wydobyć neuroepithelium. D. VNO jest zatapiane w LMA. E. Zatapiany blok jest przyklejany do uchwytu do tkanek w celu wykonania skrawków. Uchwyt do tkanek przesuwa się o 180-200 μm na skrawek, wypychając blok agarozy z metalowej tulei do cięcia. Ostrze tnące jest umieszczone blisko metalowej tulei. F. Widok z boku systemu do skrawkowania tkanek VF300. B.V., naczynie krwionośne. N.E., neuroepithelium.

A. Układ mikroskopowy z regulacjami optycznymi do obrazowania; B, C. Obrazy mikroskopowe próbek biologicznych.
Rysunek 2 Przekroje VNO. A. Przekroje VNO są utrzymywane w natlenionym mACSF w temperaturze pokojowej. B. Obraz DIC przekroju VNO. C. Obraz 2-fotonowy VNO z myszy G-CaMP2. Pasek skali, 50 μm.

Układ perfuzji VNO, pompa strzykawkowa oraz schemat metody chromatograficznej z wykresem wyników danych.
Rysunek 3 Ilustracja konfiguracji systemu perfuzji. A. Typowa komora perfuzyjna z wlotem i wylotem. Przekrój VNO jest umieszczony w centrum komory i dociskany kotwicą do tkanek. Środkowe nici kotwicy zostały usunięte, aby nie uciskać tkanki VNO. B. Komora perfuzyjna jest umieszczona na stoliku mikroskopu pod obiektywem zanurzeniowym. Oznaczono wlot mACSF, wylot ssący oraz końcówkę perfuzyjną. C. Jednotłokowa pompa strzykawkowa zapewnia ciągły przepływ roztworu Ringera przez końcówkę perfuzyjną. D. W celu wygodnego załadunku i wstrzykiwania próbek stymulujących zastosowano system pętli wtryskowej HPLC. E. Schematyczny rysunek kierunków przepływu w pozycjach załadunku i wtrysku. Roztwór Ringera – kolor zielony. Próbka stymulująca – kolor purpurowy. Strzałki wskazują kierunek przepływu. F. Pomiar czasu opóźnienia i wypłukiwania w systemie perfuzji. Do pętli z próbką wprowadzono fluorescencyjny barwnik Rodamina 6G, a w 5. sekundzie zawór przełączono w pozycję wtrysku, co zaznaczono strzałką. Zmiana sygnału fluorescencyjnego jest wykrywana między 10. a 30. sekundą, a następnie zanika.

Rejestracja obrazu i przetwarzanie ROI w mikroskopii z analizą odpowiedzi na stymulację oraz przeglądem zbioru danych.
Rycina 4 Potok przetwarzania obrazu. A. Wszystkie klatki obrazu dla jednego przekroju są rejestrowane względem klatki referencyjnej. B. Odjęcie projekcji minimalnej stosu od jego surowych klatek. Komórki odpowiadające stają się wyraźne po odjęciu. C. Wybór ROI i zestawienie ich współrzędnych w liście głównej. D. Pomiar komórek odpowiadających przy użyciu głównej listy ROI z surowego stosu.

Mapa cieplna i wykresy liniowe przedstawiające analizę ΔF/F; porównanie danych FVB, CBA, BL6 w zakresie aktywności neuronalnej.
Rycina 5 Reprezentatywny eksperyment obrazowania VNO z użyciem G-CaMP2. A. Mapa cieplna odpowiedzi ΔF/F z przekroju stymulowanego moczem osobnych samców i samic. Próbki moczu pobrano od poszczególnych myszy samców i samic. Oś X: komórki reagujące zidentyfikowane w przekroju. Oś Y: próbki moczu użyte w eksperymencie. Pasek kolorów wskazuje wartość ΔF/F. B. Przebieg czasowy odpowiedzi 3 reprezentatywnych komórek zaznaczonych w A. Strzałki wskazują czas aplikacji bodźca. F-FVB: samica FVB; F-CBA: samica CBA; M-FVB: samiec FVB; M-BL6: samiec C57BL/6.

Tabela specyficznych odczynników i sprzętu:

Nazwa odczynnika/sprzętu Firma Numer katalogowy Uwagi (opcjonalnie)
komora perfuzyjnaSiskiyouPC-Hpozioma
uchwyt do przytrzymywania skrawkaWarner InstrumentsSHD-22CL 
uchwyt portu perfuzyjnegoALA scientific, Inc.MPIOH-S 
pompa strzykawkowaNew Era Pump Systems, Inc.NE-300 
zawór wtryskowy niskiego ciśnieniaChromtechV-451 
przewód PEEKChromtech15311/16" OD, 0.25mm ID
pętla próbkowa PEEKChromtech180320 μL
strzykawka HamiltonaChromtech80630100 μL

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Większość receptorów jamwońnych (VRs) pozostaje receptorami osieroconymi od czasu ich odkrycia przez Dulaca i Axela 5. Ligandy feromonowe dla tych receptorów chemosensorycznych oraz ich rola w pośredniczeniu w zachowaniach zwierząt nie są dobrze poznane. Do tej pory zidentyfikowano tylko jedną parę ligand/receptor – peptyd ESP1 i jego pokrewny receptor Vmn2r116 (V2Rp5) – i wykazano, że przekazują one konkretne informacje społeczne 19,23. Wykazano również, że inny receptor, V1rb2, reaguje na 2-heptan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Andrei Moran oraz członkom Lab Animal Service Facility (LASF) w Stowers Institute za doskonałe wsparcie w zakresie hodowli zwierząt i usług technicznych. Praca ta jest finansowana przez Stowers Institute oraz NIH (NIDCD 008003) dla CRY. Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie musi reprezentować oficjalnych poglądów National Institute on Deafness and Other Communication Disorders ani National Institutes of Health. Wniosek o patent w USA dla myszy tetO-G-CaMP2 został złożony przez Stowers Institute, CRY i LM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Bibliografia

  1. Birch, M. C. Pheromones. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).
  2. Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).
  3. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141, 692-703 (2010).
  4. Leinders-Zufall, T. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
  5. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83, 195-206 (1995).
  6. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90, 763-773 (1997).
  7. Matsunami, H., Buck, L. B. A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals. Cell. 90, 775-784 (1997).
  8. Ryba, N. J., Tirindelli, R. A new multigene family of putative pheromone receptors. Neuron. 19, 371-379 (1997).
  9. Pantages, E., Dulac, C. A novel family of candidate pheromone receptors in mammals. Neuron. 28, 835-845 (2000).
  10. Zhang, X., Rodriguez, I., Mombaerts, P., Firestein, S. Odorant and vomeronasal receptor genes in two mouse genome assemblies. Genomics. 83, 802-811 (2004).
  11. Liberles, S. D. Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).
  12. Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
  13. Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats. Genomics. 86, 306-315 (2005).
  14. Rodriguez, I., Punta, D. el, Rothman, K., Ishii, A., T,, Mombaerts, P. Multiple new and isolated families within the mouse superfamily of V1r vomeronasal receptors. Nat. Neurosci. 5, 134-140 (2002).
  15. He, J., Ma, L., Kim, S., Nakai, J., Yu, C. R. Encoding gender and individual information in the mouse vomeronasal organ. Science. 320, 535-538 (2008).
  16. Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli. Science. 289, 1569-1572 (2000).
  17. Chamero, P. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450, 899-902 (2007).
  18. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
  19. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437, 898-901 (2005).
  20. Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
  21. Leinders-Zufall, T. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306, 1033-1037 (2004).
  22. He, J. Distinct signals conveyed by pheromone concentrations to the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 30, 7473-7483 (2010).
  23. Haga, S. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466, 118-122 (2010).
  24. Boschat, C. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5, 1261-1262 (2002).
  25. Hendel, T. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in. 28, 7399-7411 (2008).
  26. Pologruto, T. A., Yasuda, R., Svoboda, K. Monitoring neural activity and [Ca2+] with genetically encoded Ca2+ indicators. J. Neurosci. 24, 9572-9579 (2004).
  27. Jayaraman, V., Laurent, G. Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies. Front Neural Circuits. 1 (3), (2007).
  28. Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie wapniaPrzygotowanie skrawk w tkankiBod ce feromonoweEkspresja GCaMP2System perfuzyjnyObrazowanie poklatkoweAnaliza obrazuProfilowanie odpowiedzi neuronalnejVomeronasalne neurony sensoryczne
Obrazowanie odpowiedzi neuronalnych w preparatach skrawków narządu jamistego wyrażających genetycznie kodowany czujnik wapnia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.