Bezpośrednie wykrywanie aktywności enzymatycznej kinazy octanowej tworzącej octan

Podsumowanie

Opisano metodę oznaczania aktywności kinazy octanowej . Test ten wykorzystuje bezpośrednią reakcję do określenia aktywności enzymatycznej i kinetyki kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu z różnymi akceptorami fosforylu. Ponadto metoda ta może być stosowana do oznaczania innych acetylofosforanów lub acetylo-CoA z wykorzystaniem enzymów.

Streszczenie

Kinaza octanowa, członek nadrodziny^{enzymów 1-5} acetatu i kinazy cukrowej Hsp70-aktyny (ASKHA), jest odpowiedzialna za odwracalną fosforylację octanu do fosforanu acetylu przy użyciu ATP jako substratu. Kinazy octanowe są wszechobecne w bakteriach, znalezionych w jednym z rodzajów Archaea, a także są obecne w drobnoustrojach Eukarya⁶. Najlepiej scharakteryzowaną kinazą octanową jest ta z wytwarzającego metan archeonu Methanosarcina thermophila^7-14. Kinaza octanowa, która może wykorzystywać tylko PP_i, ale nie ATP w kierunku tworzenia fosforanu acetylu, została wyizolowana z Entamoeba histolytica, czynnika wywołującego czerwonkę amebową, i do tej pory została znaleziona tylko w tym rodzaju^15,16.

W kierunku tworzenia acetylu fosforan, aktywność kinazy octanowej jest zazwyczaj mierzona za pomocą testu hydroksymatowego, po raz pierwszy opisanego przez Lipmanna^17-20, testu sprzężonego, w którym konwersja ATP do ADP jest sprzężona z utlenianiem NADH do NAD⁺ przez enzymy kinazę pirogronianową i dehydrogenazę mleczanową^21,22, lub test mierzący uwalnianie nieorganicznego fosforanu po reakcji produktu fosforanu acetylu z hydroksyloaminą²³. Aktywność w przeciwnym kierunku, tworzenia octanu, mierzy się poprzez sprzężenie tworzenia ATP z ADP do redukcji NADP⁺ do NADPH przez enzymy heksokinazę i dehydrogenazę 6-fosforanową glukozy²⁴.

Tutaj opisujemy metodę wykrywania aktywności kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu, która nie wymaga enzymów sprzęgających, ale opiera się na bezpośrednim określeniu zużycia fosforanu acetylu. Po reakcji enzymatycznej pozostały fosforan acetylu jest przekształcany w kompleks hydroksyminianu żelaza, który można mierzyć spektrofotometrycznie, tak jak w przypadku testu hydroksymatowego. Tak więc, w przeciwieństwie do standardowego testu sprzężonego dla tego kierunku, który jest zależny od produkcji ATP z ADP, ten bezpośredni test może być stosowany do kinaz octanowych wytwarzających ATP lub PP_i.

Protokół

Ogólny schemat tego protokołu jest przedstawiony na rysunku 1.

1. Przygotowanie roztworu dla standardowych krzywych i testów

1. Przygotować 100 ml roztworu chlorowodorku hydroksyloaminy o stężeniu 2 mol/l. Odważyć 13,9 g chlorowodorku hydroksyloaminy (MW 69,49 g/mol) i rozpuścić w około 50 ml destylowanej wody dejonizowanej (_ddH2O). Dostosuj pH do 7,0 za pomocą granulek wodorotlenku potasu lub stężonego roztworu. Doprowadzić ostateczną objętość do 100 ml. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 30 dni lub w temperaturze 4 °C do 90 dni.
2. Przygotować 100 ml roztworu chlorku żelazowego i kwasu solnego. Odważyć 13,5 g chlorku żelaza (MW 270,32 g/mol) i rozpuścić w około 50 ml ddH₂O. Dodać 41,3 ml stężonego kwasu solnego (12,1 mol/l) i doprowadzić do końcowej objętości 100 ml. Końcowe stężenie chlorku żelaza wyniesie 0,5 mol/l, a końcowe stężenie kwasu solnego wyniesie 5 mol/l. Roztwór jest przechowywany w temperaturze pokojowej.
3. Przygotować 100 ml roztworu kwasu trichorooctowego o stężeniu 1,84 mol/l. Odważyć 30,0 g kwasu trichlorooctowego (MW 163,39 g/mol), rozpuścić w ddH₂O i doprowadzić końcową objętość do 100 ml. Roztwór jest przechowywany w temperaturze pokojowej.
4. Przygotować 5 ml roztworu fosforanu acetylu o stężeniu 0,1 mol/l. Odważyć 0,092 g fosforanu acetylu (MW 184,06 g/mol), rozpuścić w ddH₂O i doprowadzić końcową objętość do 5 ml. Roztwór rozdzielić do probówek mikrowirówek (0,25 ml na probówkę) i zamrozić w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Rozmrożony roztwór należy umieścić na lodzie i można go używać przez około 1 godzinę. Rozmrożony roztwór fosforanu acetylu nie powinien być ponownie zamrażany i ponownie używany.
5. Przygotować 5 ml roztworu ADP o stężeniu 0,1 mol/l. Odważyć 0,24 g ADP (MW 472,5 g/mol), rozpuścić w ddH₂O i doprowadzić końcową objętość do 5 ml. Roztwór rozdzielić na porcje w probówkach do mikrowirówek (0,5 ml na probówkę) i zamrozić w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Trzymaj rozmrożony roztwór na lodzie do czasu użycia.
6. Przygotować 50 ml roztworu Tris o stężeniu 1 mol/l. Odważyć 6,06 g Tris (MW 121,14 g/mol) i rozpuścić w 40 ml ddH₂O. Doprowadzić pH roztworu do 7,0 za pomocą kwasu solnego i doprowadzić końcową objętość do 50 ml. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
7. Przygotować 10 ml roztworu chlorku magnezu o stężeniu 1 mol/l. Odważyć 2,03 g chlorku magnezu (MW 203,31 g/mol), rozpuścić w ddH₂O i doprowadzić końcową objętość do 10 ml. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
8. Przygotować 25 ml roztworu do wywoływania, mieszając równe objętości roztworu chlorku żelaza/kwasu solnego i roztworu kwasu trichlorooctowego. Roztwór do wywoływania należy przygotowywać codziennie na świeżo i przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie wzorcowej krzywej fosforanu acetylu

1. Krzywa wzorcowa fosforanu acetylu jest generowana przy użyciu znanych ilości fosforanu acetylu. Odpowiednia jest standardowa krzywa od sześciu do ośmiu punktów. Wzorce powinny mieścić się w zakresie od 0,03 μmoli do 0,9 μmoli na 300 μl, co odpowiada stężeniom końcowym od 0,1 do 3 mmol/L. Rozcieńczyć roztwór podstawowy fosforanu acetylu do odpowiednich stężeń w 100 mM roztworze Tris w końcowej objętości 300 μL. Należy również przygotować próbkę kontrolną bez fosforanu acetylu.
2. Inkubować każdy wzorzec i kontrolę w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym przez 1 minutę.
3. Dodać 50 μl roztworu chlorowodorku hydroksyloaminy do każdego wzorca i kontroli i wymieszać przez trzykrotne wstrząsanie. Umieść wzorzec w bloku grzewczym o temperaturze 60 °C i inkubuj przez pięć minut.
4. Dodać 100 μl roztworu wywoływacza do wzorców i kontroli, wymieszać trzykrotnie wstrząsając i pozostawić kolor na rozwój przez co najmniej jedną minutę w temperaturze pokojowej.
5. Odwirować wszystkie wzorce i kontrolę w mikrowirówce przy 18 000 x g przez 1 minutę.
6. Mierzyć próbki spektrofotometrycznie przy długości fali 540 nm przy użyciu kuwet z tworzywa sztucznego o pojemności 1 ml, używając kontroli jako ślepej próby do spektrofotometrii.
7. Wygeneruj krzywą standardową za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (np. Kaleidagraph, Synergy Software). Pożądane są wartości R² wynoszące 0,99 lub więcej. Dane są wykreślane jako absorbancja przy 540 nm w funkcji μmoli obecnego fosforanu acetylu.

3. Test aktywności kinazy octanowej

1. Korzystając z opisanych roztworów, przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą końcowe stężenie 0,1 mol/l buforu Tris, 10 mmol/l chlorku magnezu, 5 mmol/l ADP i 2 mmol/l fosforanu acetylu. Mieszanina reakcyjna o objętości 10 ml będzie wymagała 8,2 ml ddH₂O, 1,0 ml roztworu Tris, 0,1 ml roztworu chlorku magnezu, 0,5 ml roztworu ADP i 0,2 ml roztworu fosforanu acetylu. Rozprowadzić mieszaninę reakcyjną w 300 μl podwielokrotności do probówek do mikrowirówek. W celu określenia parametrów kinetycznych i optymalizacji stężeń substratów, jeden substrat może być zmieniany, a drugi utrzymywany w stałym stężeniu w reakcjach.
2. Wstępnie inkubować reakcje przez 1 minutę w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym.
3. Dodać żądaną ilość enzymu do reakcji i natychmiast umieścić probówkę w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C. Obejmują również reakcję kontrolną, do której nie dodaje się enzymu. Jeśli przeprowadzanych jest kilka reakcji, dodaj enzym do probówek w określonych odstępach czasu. Pamiętaj, aby śledzić czas. (UWAGA: Ilość enzymu, który ma być użyty, będzie musiała zostać zoptymalizowana, aby zapewnić, że cały fosforan acetylu lub substrat ADP nie zostanie wyczerpany - patrz sekcja Dyskusja)
4. Po 5 minutach dodać 50 μl roztworu chlorowodorku hydroksyloaminy do każdej reakcji i kontroli, wymieszać i umieścić probówki w bloku grzewczym o temperaturze 60 °C. Jeśli przeprowadza się kilka reakcji, należy to zrobić w tym samym czasie, w którym enzym został dodany.
5. Inkubować reakcje i kontrolę przez 5 minut w temperaturze 60 °C.
6. Dodać 100 μl roztworu rozwojowego do każdej reakcji i kontroli, wymieszać i umieścić w stojaku na probówki na stole laboratoryjnym. Pozwól kolorowi rozwinąć się przez co najmniej 1 minutę.
7. Odwirować wszystkie probówki w mikrowirówce o stężeniu 18 000 x g przez 1 minutę.
8. Mierzyć próbki spektrofotometrycznie przy długości fali 540 nm za pomocą plastikowych kuwet o pojemności 1 ml i określać ilość obecnego fosforanu acetylu w porównaniu z krzywą wzorcową fosforanu acetylu.
9. Ilość zubożonego substratu fosforanu acetylu można oznaczyć, odejmując ilość fosforanu acetylu pozostałego po reakcji enzymatycznej od ilości fosforanu acetylu obecnego w próbie braku enzymu. Przeprowadzaj analizę danych za pomocą odpowiedniego oprogramowania do tworzenia danych i wykresów (np. Kaleidagraph, Synergy Software). Pożądane są wartości R² większe niż 0,97.

4. Reprezentatywne wyniki:

Celem tego testu jest zmierzenie aktywności kinazy octanowej w kierunku powstawania octanu. Odbywa się to poprzez pomiar zużycia substratu fosforanu acetylu, ponieważ nie ma łatwego, bezpośredniego pomiaru produkcji octanu. Fosforan acetylu pozostały po określonym czasie podczas reakcji enzymatycznej jest przekształcany w acetylowodorowodoreksamian, a następnie w kompleks hydroksyminianu żelaza, który ma czerwonawy kolor (ryc. 2), który można zmierzyć przy 540 nm. Krzywa wzorcowa wykreślająca absorbancję w funkcji μmoli fosforanu acetylu obecnego w wzorcach służy do określenia ilości fosforanu acetylu pozostałego w każdej reakcji. Krzywa standardowa powinna być liniowa przez punkt zerowy. Reprezentatywna krzywa wzorcowa pokazana na rysunku 3 ma nachylenie 1,2332 jednostki absorbancji na μmol obecnego fosforanu acetylu i wartość R² wynoszącą 0,99, co wskazuje, że dane dobrze pasują do równania liniowego. Równanie dopasowania liniowego do danych krzywej standardowej służy do obliczania ilości fosforanu acetylu pozostałego w reakcji. Μmole zużytego fosforanu acetylu określa się jako różnicę między μmolami fosforanu acetylu obecnymi w reakcji kontrolnej bez enzymu a μmolami fosforanu acetylu pozostałymi po reakcji enzymatycznej.

Oczyszczona, rekombinowana kinaza octanowa M. thermophila została przetestowana przy użyciu opisanego protokołu. W doświadczeniu pokazanym na rysunku 4 stężenie ADP utrzymywano na stałym poziomie 5 mmol/l, a stężenie fosforanu acetylu w reakcji zmieniano w celu określenia K_m dla fosforanu acetylu. Zgodnie z oczekiwaniami, eksperyment ten pokazuje, że enzym podąża za standardową kinetyką podobną do Michaelisa-Mentena dla każdego substratu i wytworzył hiperboliczną krzywą nasycenia podczas wykreślania aktywności w stosunku do stężenia fosforanu acetylu. Pozorna wartość K_m dla fosforanu acetylu wynosiła 0,27 ± 0,01 mmol/l, co wypada korzystnie w porównaniu z opublikowaną wartością K_m wynoszącą 0,47 ± 0,01 mmol/l przy użyciu sprzężonego testu¹³.

Bezpośredni test może być również użyty do pomiaru aktywności kinaz octanowych wykorzystujących substraty inne niż ATP, co nie jest możliwe przy użyciu standardowego testu sprzężonego. Oczyszczoną rekombinowaną kinazę octanową¹⁶ E. histolytica, która wytwarza PP_i zamiast ATP w kierunku tworzenia octanu, poddano temu testowi przy użyciu fosforanu sodu zamiast ADP. Stężenie fosforanu sodu w reakcji utrzymywało się na stałym poziomie 0,2 mol/l, a stężenie fosforanu acetylu było zróżnicowane. Jeśli chodzi o kinazę octanową M. thermophila, kinaza octanowa E. histolytica podążała za kinetyką podobną do Michaelisa-Mentena dla fosforanu acetylu i zaobserwowano hiperboliczną krzywą nasycenia (ryc. 5). Pozorna wartość K_m dla fosforanu acetylu wynosiła 0,50 ± 0,006 mmol/L. Reeves i Guthrie¹⁵ określili wartość K_m 0,06 mmol/L dla fosforanu acetylu dla enzymu natywnego; Jednak ich enzym został tylko częściowo oczyszczony, a ich test obejmował cztery enzymy sprzęgające, które również zostały tylko częściowo oczyszczone. W związku z tym trudno jest bezpośrednio porównać te wartości.

Schemat protokołu

1. Wygeneruj krzywą wzorcową fosforanu acetylu
2. Rozcieńczyć enzym do pożądanego stężenia
3. Przygotować mieszaninę reakcyjną i poddzielić 300 μl do probówek do mikrowirówek
4. Reakcje preinkubacji w temperaturze 37 °C przez 1 minutę
5. Rozpoczynanie reakcji od dodawania enzymu w określonych odstępach czasu
6. Dodawać hydroksyloaminę w tych samych odstępach czasu, aby zatrzymać reakcje i inkubować w temperaturze 60 °C przez 5 minut
7. Dodaj roztwór chlorku żelaza/kwasu trichlorooctowego w celu opracowania koloru
8. Probówki wirówkowe o pojemności 18 000 x g przez 1 minutę
9. Pomiar absorbancji przy 540 nm
10. Określ ilość zużytego fosforanu acetylu przez porównanie z krzywą wzorcową

Rysunek 1. Schemat protokołu

Rysunek 2. Wzorce fosforanu acetylu. Rosnące stężenia fosforanu acetylu reagowano z hydroksyloaminą i kolor opracowywano zgodnie z opisem. Kontrola pozbawiona fosforanu acetylu jest jasnożółta, a reakcje zawierające coraz większe ilości fosforanu acetylu mają kolejno ciemniejszą barwę. Ta zmiana koloru jest mierzona przy długości fali 540 nm.

Rysunek 3. Przykładowa krzywa wzorcowa fosforanu acetylu. Różne ilości fosforanu acetylu poddano reakcji z hydroksyloaminą, a roztwór do rozwoju barwy i absorbancję zmierzono przy 540 nm. Wykreślono absorbancję przy 540 nm w funkcji μmolowego fosforanu acetylu i zastosowano liniowe dopasowanie do danych.

Rysunek 4. Wykorzystanie fosforanu acetylu przez kinazę octanową M. thermophila wytwarzającą ATP. Aktywność enzymatyczną określono w kierunku tworzenia octanu w obecności 5 mmol/L ADP przy różnych stężeniach fosforanu acetylu. Ilość zużytego fosforanu acetylu określono jako różnicę między początkową ilością fosforanu acetylu w reakcji a ilością fosforanu acetylu pozostałą po reakcji enzymatycznej. Testy przeprowadzono w trzech egzemplarzach z zaznaczonymi słupkami błędów.

Rysunek 5. Wykorzystanie fosforanu acetylu przez kinazę octanową E. histolytica wytwarzającą PP_i. Aktywność enzymatyczną w kierunku tworzenia octanu określono w obecności 0,2 mol/l fosforanu sodu o różnych stężeniach fosforanu acetylu. Ilość zużytego fosforanu acetylu określono jako różnicę między początkową ilością fosforanu acetylu w reakcji a ilością fosforanu acetylu pozostałą po reakcji enzymatycznej. Testy przeprowadzono w trzech egzemplarzach z zaznaczonymi słupkami błędów.

Dyskusja

Wykrycie fosforanu acetylu w tym teście zależy od wystarczającego stężenia chlorowodorku hydroksyloaminy oraz stężenia i kwasowości roztworu chlorku żelaza. Zmiana objętości testu będzie wymagała ponownego rozważenia obu tych elementów. Opisane tutaj reakcje enzymatyczne przeprowadzono w temperaturze 37°C, a zakończenie hydroksyloaminy przeprowadzono w temperaturze 60°C przez 5 minut. Ta wyższa temperatura ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia szybkiej konwersji pozostałego fosforanu acetylu do wodoroksamianu acetylu. C...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fosforan acetylu	Sigma-Aldrich	01409	Sól litowa (97%) Fosforan
sodu jednozasadowy (odwodniony)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	S381
Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	S374
Chlorek magnezu (sześciowodny)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	M33
Tris Base	Thermo Fisher Scientific, Inc.	B152
Chlorek żelaza (sześciowodny)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	I88
Kwas trichlorooctowy	Thermo Fisher Scientific, Inc.	A324
Chlorowodorek hydroksyloaminy	Thermo Fisher Scientific, Inc.	H330
Sól sodowa 5'-difosforanu adenozyny	Sigma-Aldrich	A2754
Biomate III	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142982082	Standardowy spektrofotometr UV/Vis