Artykuł metodologiczny

Bezpośrednie wykrywanie aktywności octanowej enzymu kinazy octanowej

DOI:

10.3791/3474

19 grudnia 2011

W tym artykule

Podsumowanie

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę oznaczania aktywności kinazy octanowej. Analiza ta wykorzystuje reakcję bezpośrednią do wyznaczania aktywności enzymatycznej i kinetyki kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu z zastosowaniem różnych akceptorów fosforanowych. Ponadto metodę tę można wykorzystać do analizy innych enzymów wykorzystujących acetylofosforan lub acetylo-CoA.

Streszczenie

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinaza octanowa, należąca do superrodziny enzymów kinaz octanowych i cukrowych-Hsp70-aktyny (ASKHA)1-5, odpowiada za odwracalną fosforylację octanu do fosforanu acetyloenolu z wykorzystaniem ATP jako substratu. Kinazy octanowe występują powszechnie u Bacteria, znaleziono je u jednego rodzaju Archaea, a także występują one u mikroorganizmów z grupy Eukarya6. Najlepiej scharakteryzowaną kinazą octanową jest enzym pochodzący z produkującego metan archeona Methanosarcina thermophila7-14. Kinaza octanowa, która w kierunku tworzenia fosforanu acetyloenolu potrafi wykorzystać wyłącznie PPi, a nie ATP, została wyizolowana z Entamoeba histolytica, czynnika etiologicznego amebowej czerwonki, i do tej pory stwierdzono jej obecność jedynie w tym rodzaju15,16.

W kierunku tworzenia fosforanu acetylowego aktywność kinazy acetylowej mierzy się zazwyczaj za pomocą testu hydroksamanowego, po raz pierwszy opisanego przez Lipmanna17-20, który jest testem sprzężonym, w którym konwersja ATP do ADP jest sprzężona z utlenianiem NADH do NAD+ przez enzymy kinazę pirogronianową i dehydrogenazę mleczanową21,22, lub za pomocą testu mierzącego uwalnianie fosforanu nieorganicznego po reakcji produktu w postaci fosforanu acetylowego z hydroksyloaminą23. Aktywność w przeciwnym kierunku, tworzenia octanu, mierzy się poprzez sprzężenie syntezy ATP z ADP z redukcją NADP+ do NADPH przez enzymy heksokinazę i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową24.

W niniejszej pracy opisujemy metodę wykrywania aktywności kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu, która nie wymaga enzymów sprzęgających, lecz opiera się na bezpośrednim oznaczaniu zużycia acetylofosforanu. Po reakcji enzymatycznej pozostały acetylofosforan jest przekształcany w kompleks hydroksamatu żelaza(III), który można zmierzyć spektrofotometrycznie, analogicznie do testu hydroksamanowego. W przeciwieństwie do standardowego testu sprzężonego dla tego kierunku reakcji, który zależy od produkcji ATP z ADP, niniejszy test bezpośredni może być stosowany w przypadku kinaz octanowych produkujących ATP lub PPi.

Protokół

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólny schemat niniejszego protokołu przedstawiono na Ryc. 1.

1. Przygotowanie roztworów do krzywych wzorcowych i analiz

  1. Przygotować 100 mL 2 mol/L roztworu hydroksyloaminy-HCl. Odważyć 13,9 g chlorku hydroksyloaminy (MW 69,49 g/mol) i rozpuścić w około 50 mL destylowanej wody dejonizowanej (ddH2O). Dostosować pH do 7,0 za pomocą granulek wodorotlenku potasu lub jego stężonego roztworu. Dopełnić objętość końcową do 100 mL. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 30 dni lub w 4 °C do 90 dni.
  2. Przygotować 100 mL roztworu chlorku żelaza(III) i kwasu solnego. Odważyć 13,5 g chlorku żelaza(III) (MW 270,32 g/mol) i rozpuścić w około 50 mL ddH2O. Dodać 41,3 mL stężonego kwasu solnego (12,1 mol/L) i dopełnić do objętości końcowej 100 mL. Końcowe stężenie chlorku żelaza(III) wyniesie 0,5 mol/L, a końcowe stężenie kwasu solnego 5 mol/L. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować 100 mL 1,84 mol/L roztworu kwasu trichlorooctowego. Odważyć 30,0 g kwasu trichlorooctowego (MW 163,39 g/mol), rozpuścić w ddH2O i dopełnić objętość końcową do 100 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować 5 mL 0,1 mol/L roztworu fosforanu acetylowego. Odważyć 0,092 g fosforanu acetylowego (MW 184,06 g/mol), rozpuścić w ddH2O i dopełnić objętość końcową do 5 mL. Rozdzielić roztwór do probówek do mikrocentryfugi (0,25 mL na probówkę) i zamrozić w -20 °C do momentu użycia. Rozmrożony roztwór należy umieścić na lodzie; można go używać przez około 1 godzinę. Rozmrożonego roztworu fosforanu acetylowego nie należy ponownie zamrażać ani używać ponownie.
  5. Przygotować 5 mL 0,1 mol/L roztworu ADP. Odważyć 0,24 g ADP (MW 472,5 g/mol), rozpuścić w ddH2O i dopełnić objętość końcową do 5 mL. Rozdzielić roztwór do probówek do mikrocentryfugi (0,5 mL na probówkę) i zamrozić w -20° C do momentu użycia. Rozmrożony roztwór przechowywać na lodzie do czasu użycia.
  6. Przygotować 50 mL 1 mol/L roztworu Tris. Odważyć 6,06 g Tris (MW 121,14 g/mol) i rozpuścić w 40 mL ddH2O. Dostosować pH roztworu do 7,0 za pomocą kwasu solnego i dopełnić objętość końcową do 50 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotować 10 mL 1 mol/L roztworu chlorku magnezu. Odważyć 2,03 g chlorku magnezu (MW 203,31 g/mol), rozpuścić w ddH2O i dopełnić objętość końcową do 10 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
  8. Przygotować 25 mL roztworu wywoływującego poprzez zmieszanie równych objętości roztworu chlorku żelaza(III)/kwasu solnego oraz roztworu kwasu trichlorooctowego. Roztwór wywoływujący należy przygotowywać świeżo każdego dnia i przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie krzywej wzorcowej dla fosforanu acetylowego

  1. Krzywą wzorcową dla fosforanu acetylo generuje się przy użyciu znanych ilości fosforanu acetylo. Odpowiednia jest krzywa wzorcowa składająca się z sześciu do ośmiu punktów. Standardy powinny mieścić się w zakresie od 0,03 μmoles do 0,9 μmoles na 300 μL, co odpowiada końcowym stężeniom od 0,1 do 3 mmol/L. Rozcieńczyć roztwór zapasowy fosforanu acetylo do odpowiednich stężeń w 100 mM roztworze Tris do końcowej objętości 300 μL. Należy również przygotować próbkę kontrolną bez fosforanu acetylo.
  2. Inkubować każdy standard oraz kontrolę w temperaturze 37 °C w bloku grzejnym przez 1 minutę.
  3. Do każdego standardu i kontroli dodać 50 μL roztworu hydroponianu hydrochlorku i wymieszać, potrząsając trzy razy. Umieścić standard w bloku grzejnym o temperaturze 60 °C i inkubować przez pięć minut.
  4. Do standardów i kontroli dodać 100 μL roztworu wywołującego, wymieszać, potrząsając trzy razy, i pozostawić do rozwoju barwy przez co najmniej jedną minutę w temperaturze pokojowej.
  5. Wszystkie standardy oraz kontrolę wirować w mikrocentryfudze przy 18,000 x g przez 1 minutę.
  6. Próbki zmierzyć spektrofotometrycznie przy 540 nm przy użyciu plastikowych kuwet 1mL, stosując kontrolę jako próbkę zerową (blank) do spektrofotometrii.
  7. Wygenerować krzywą wzorcową przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (np. Kaleidagraph, Synergy Software). Pożądane są wartości R2 równe 0,99 lub wyższe. Dane nanosi się jako absorbancję przy 540 nm w funkcji μmoles obecnego fosforanu acetylo.

3. Analiza aktywności kinazy octanowej

  1. Przy użyciu opisanych roztworów przygotować mieszaninę reakcyjną o końcowym stężeniu 0,1 mol/L buforu Tris, 10 mmol/L chlorku magnezu, 5 mmol/L ADP i 2 mmol/L fosforanu acetylu. 10 mL mieszaniny reakcyjnej będzie wymagać 8,2 mL ddH2O, 1,0 mL roztworu Tris, 0,1 mL roztworu chlorku magnezu, 0,5 mL roztworu ADP oraz 0,2 mL roztworu fosforanu acetylu. Mieszaninę reakcyjną rozdzielić do probówek do mikrowirówki w aliquotach po 300 μl. W celu wyznaczenia parametrów kinetycznych i optymalizacji stężeń substratów, w reakcjach można zmieniać stężenie jednego substratu, utrzymując drugie na stałym poziomie.
  2. Preinkubować reakcje przez 1 minutę w 37 °C w bloku grzejnym.
  3. Do reakcji dodać pożądaną ilość enzymu i natychmiast umieścić probówkę z powrotem w bloku grzejnym w 37 °C. Należy również przygotować reakcję kontrolną, do której nie dodaje się enzymu. Jeśli przeprowadzanych jest kilka reakcji, enzym należy dodawać do probówek w określonych odstępach czasu. Należy dokładnie kontrolować czas. (UWAGA: Ilość użytego enzymu będzie wymagała optymalizacji, aby upewnić się, że cały substrat w postaci fosforanu acetylu lub ADP nie zostanie wyczerpany – patrz sekcja Dyskusja)
  4. Po 5 minutach do każdej reakcji oraz do kontroli dodać 50 μl roztworu chlorowodorku hydroksylaminy, wymieszać i umieścić probówki w bloku grzejnym w 60 °C. W przypadku prowadzenia wielu reakcji, czynność tę należy wykonać w tych samych odstępach czasu, w których dodawano enzym.
  5. Inkubować reakcje oraz kontrolę przez 5 minut w 60 °C.
  6. Do każdej reakcji oraz do kontroli dodać 100 μL roztworu wywoływującego, wymieszać i umieścić w statywie na blacie laboratoryjnym. Pozostawić na co najmniej 1 minutę w celu wywołania barwy.
  7. Wszystkie probówki odwirować w mikrowirówce przy 18,000 x g przez 1 minutę.
  8. Próbki zmierzyć spektrofotometrycznie przy 540 nm, używając plastikowych kuwet 1 mL, i wyznaczyć ilość obecnego fosforanu acetylu poprzez porównanie z krzywą wzorcową fosforanu acetylu.
  9. Ilość zużytego substratu fosforanu acetylu można wyznaczyć, odejmując ilość fosforanu acetylu pozostałego po reakcji enzymatycznej od ilości fosforanu acetylu obecnego w kontroli bez enzymu. Analizę danych przeprowadzić przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (np. Kaleidagraph, Synergy Software). Pożądane są wartości R2 większe niż 0,97.

4. Reprezentatywne wyniki:

Celem niniejszego testu jest pomiar aktywności kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu. Jest to realizowane poprzez pomiar zużycia substratu, jakim jest acetylofosforan, ponieważ nie istnieje łatwa metoda bezpośredniego pomiaru produkcji octanu. Acetylofosforan pozostały po określonym czasie reakcji enzymatycznej jest przekształcany w acetylohydroksamat, a następnie w kompleks hydroksamatu żelaza, który ma czerwonawy kolor (Rysunek 2) mierzalny przy 540 nm. Krzywa wzorcowa przedstawiająca zależność absorbancji od μmoli acetylofosforanu obecnego w standardach jest wykorzystywana do określenia ilości acetylofosforanu pozostałego w każdej reakcji. Krzywa wzorcowa powinna być liniowa i przechodzić przez punkt zero. Reprezentatywna krzywa wzorcowa przedstawiona na Rysunku 3 posiada nachylenie wynoszące 1,2332 jednostek absorbancji na μmol obecnego acetylofosforanu oraz wartość R2 równą 0,99, co wskazuje na dobre dopasowanie danych do równania liniowego. Równanie regresji liniowej dla danych krzywej wzorcowej służy do obliczenia ilości acetylofosforanu pozostałego w reakcji. Liczba μmoli zużytego acetylofosforanu jest określana jako różnica między liczbą μmoli acetylofosforanu obecnego w reakcji kontrolnej bez enzymu a liczbą μmoli acetylofosforanu pozostałego po reakcji enzymatycznej.

Oczyszczoną, rekombinowaną kinazę octanową M. thermophila analizowano zgodnie z opisanym protokołem. W doświadczeniu przedstawionym na Rysunku 4 stężenie ADP utrzymano na stałym poziomie 5 mmol/L, a stężenie fosforanu acetylowego w reakcji zmieniano w celu wyznaczenia wartości Km dla fosforanu acetylowego. Zgodnie z oczekiwaniami, eksperyment ten wykazał, że enzym wykazuje standardową kinetykę typu Michaelisa-Menten dla każdego substratu, a wykres zależności aktywności od stężenia fosforanu acetylowego przyjął postać hiperboli nasycenia. Pozorna wartość Km dla fosforanu acetylowego wyniosła 0.27 ± 0.01 mmol/L, co jest wynikiem zbliżonym do opublikowanej wartości Km wynoszącej 0.47 ± 0.01 mmol/L uzyskanej w teście sprzężonym13.

Metodę bezpośrednią można również wykorzystać do pomiaru aktywności kinaz octanowych wykorzystujących substraty inne niż ATP, co nie jest możliwe w przypadku standardowego testu sprzężonego. Oczyszczona rekombinowana kinaza octanowa E. histolytica16, która w kierunku tworzenia octanu produkuje PPi zamiast ATP, została poddana temu badaniu z wykorzystaniem fosforanu sodu zamiast ADP. Stężenie fosforanu sodu w reakcji utrzymano na stałym poziomie 0,2 mol/L, natomiast zmieniano stężenie acetylofosforanu. Podobnie jak w przypadku kinazy octanowej M. thermophila, kinaza octanowa E. histolytica wykazywała kinetykę zbliżoną do modelu Michaelisa-Menten dla acetylofosforanu i zaobserwowano hiperboliczną krzywą nasycenia (Rycina 5). Pozorna wartość Km dla acetylofosforanu wyniosła 0,50 ± 0,006 mmol/L. Reeves i Guthrie15 określili wartość Km dla acetylofosforanu dla enzymu natywnego na poziomie 0,06 mmol/L; jednak ich enzym był jedynie częściowo oczyszczony, a w zastosowanym przez nich teście wykorzystano cztery enzymy sprzęgające, które również były tylko częściowo oczyszczone. W związku z tym bezpośrednie porównanie tych wartości jest utrudnione.

Schemat protokołu

  1. Stworzenie krzywej wzorcowej dla fosforanu acetylowego
  2. Rozcieńczenie enzymu do pożądanego stężenia
  3. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i rozdzielenie porcji 300 μl do probówek do mikrocentryfugi
  4. Preinkubacja reakcji w temperaturze 37 °C przez 1 minutę
  5. Rozpoczęcie reakcji poprzez dodanie enzymu w określonych odstępach czasu
  6. Dodanie hydroksyloaminy w tych samych odstępach czasu w celu zatrzymania reakcji i inkubacja w temperaturze 60 °C przez 5 minut
  7. Dodanie roztworu chlorku żelaza(III)/kwasu trójchlorooctowego w celu wywołania barwy
  8. Wirowanie probówek przy 18,000 x g przez 1 minutę
  9. Pomiar absorbancji przy 540 nm
  10. Wyznaczenie ilości zużytego fosforanu acetylowego poprzez porównanie z krzywą wzorcową

Protokół analizy fosforanu acetylowego; reakcja enzymatyczna krok po kroku i pomiar absorbancji.
Rysunek 1. Schemat protokołu

Kuwety do analizy kolorymetrycznej, rozcieńczenia seryjne, analiza spektrofotometryczna, układ eksperymentalny.
Rycina 2. Standardy fosforanu acetylowego. Rosnące stężenia fosforanu acetylowego poddano reakcji z hydroksylaminą, a następnie wywołano barwę zgodnie z opisem. Kontrola pozbawiona fosforanu acetylowego ma jaskrawożółty kolor, a reakcje zawierające zwiększające się ilości fosforanu acetylowego wykazują sukcesywnie ciemniejszy kolor. Zmianę barwy mierzy się przy 540 nm.

Wynik chromatografii; wykres acetylofosforanu w funkcji absorbancji (540 nm); zależność liniowa.
Rycina 3. Przykładowa krzywa wzorcowa acetylofosforanu. Różne ilości acetylofosforanu poddano reakcji z hydroksylaminą oraz roztworem barwnym, a następnie zmierzono absorbancję przy 540 nm. Przedstawiono zależność absorbancji przy 540 nm od μmoles acetylofosforanu i zastosowano dopasowanie liniowe do danych.

Wykres zużycia fosforanu acetyloilo w zależności od stężenia; dopasowanie krzywej analizy kinetycznej.
Rycina 4. Wykorzystanie fosforanu acetyloilo przez syntetyzującą ATP kinazę octanową M. thermophila. Aktywność enzymatyczna była oznaczana w kierunku tworzenia octanu w obecności 5 mmol/L ADP przy zmiennych stężeniach fosforanu acetyloilo. Ilość zużytego fosforanu acetyloilo określono jako różnicę między początkową ilością fosforanu acetyloilo w reakcji a ilością fosforanu acetyloilo pozostałą po reakcji enzymatycznej. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach; naniesiono słupki błędów.

Wykres zużycia fosforanu acetylowego w funkcji stężenia; kinetyka enzymatyczna, krzywa dopasowania danych.
Rycina 5. Wykorzystanie fosforanu acetylowego przez kinazę acetylową E. histolytica produkującą PPi. Aktywność enzymatyczną w kierunku tworzenia octanu określono w obecności 0,2 mol/L fosforanu sodu przy zmiennych stężeniach fosforanu acetylowego. Ilość zużytego fosforanu acetylowego określono jako różnicę między początkową ilością fosforanu acetylowego w reakcji a ilością fosforanu acetylowego pozostałego po reakcji enzymatycznej. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a na wykresie naniesiono słupki błędów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie acetylofosforanu w tym teście zależy od odpowiedniego stężenia chlorowodorku hydroksyloaminy oraz stężenia i kwasowości roztworu chlorku żelaza(III). Zmiana objętości testu będzie wymagała ponownego rozważenia obu tych komponentów. Opisane tutaj reakcje enzymatyczne przeprowadzono w 37°C, natomiast zakończenie reakcji za pomocą hydroksyloaminy wykonano w 60 °C przez 5 minut. Wyższa temperatura jest kluczowa dla zapewnienia szybkiej konwersji pozostałego acetylofosforanu do acetylohydroksamianu. Czas etapu rozw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez grant NSF nr 0920274 oraz projekt South Carolina Experiment Station (SC-1700340) przyznany KSS. Niniejsza publikacja stanowi Wkład Techniczny nr 5929 Stacji Doświadczalnej Uniwersytetu Clemson.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fosforan acetylowySigma-Aldrich01409Sól litu (97%)
Fosforan sodu jednodstawny (bezwodny)Thermo Fisher Scientific, Inc.S381
Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny)Thermo Fisher Scientific, Inc.S374
Chlorek magnezu (sześciowodny)Thermo Fisher Scientific, Inc.M33
Tris (zasada)Thermo Fisher Scientific, Inc.B152
Chlorek żelaza(III) (sześciowodny)Thermo Fisher Scientific, Inc.I88
Kwas trójchlorooctowyThermo Fisher Scientific, Inc.A324
Chlorowodorek hydroksyloaminyThermo Fisher Scientific, Inc.H330

Adenozyna 5’-difosforan

sól sodowa
Sigma-AldrichA2754
Spektrofotometr Biomate IIIThermo Fisher Scientific, Inc.142982082Standardowy spektrofotometr UV/Vis

Bibliografia

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
  2. Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
  3. Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
  4. Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
  5. Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
  6. Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
  7. Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
  8. Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
  9. Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
  10. Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
  11. Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
  12. Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
  13. Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
  14. Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).
  15. Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
  16. Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , Forthcoming (2011).
  17. Lipmann, F. Enzymatic synthesis of acetyl phosphate. J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).
  18. Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
  19. Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction. J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).
  20. Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. Enzymatic phosphorylation of acetate. J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).
  21. Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
  22. Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
  23. Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
  24. Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Powstawanie octanufosforan acetyloowyanaliza bezpo redniaanaliza z hydroksyloaminpomiar spektrofotometrycznykinetyka enzymatycznakrzywa wzorcowawyznaczanie KMdetekcja octanu

Powiązane artykuły