Opisano metodę oznaczania aktywności kinazy octanowej. Analiza ta wykorzystuje reakcję bezpośrednią do wyznaczania aktywności enzymatycznej i kinetyki kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu z zastosowaniem różnych akceptorów fosforanowych. Ponadto metodę tę można wykorzystać do analizy innych enzymów wykorzystujących acetylofosforan lub acetylo-CoA.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezpośrednie wykrywanie aktywności octanowej enzymu kinazy octanowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kinaza octanowa, należąca do superrodziny enzymów kinaz octanowych i cukrowych-Hsp70-aktyny (ASKHA)1-5, odpowiada za odwracalną fosforylację octanu do fosforanu acetyloenolu z wykorzystaniem ATP jako substratu. Kinazy octanowe występują powszechnie u Bacteria, znaleziono je u jednego rodzaju Archaea, a także występują one u mikroorganizmów z grupy Eukarya6. Najlepiej scharakteryzowaną kinazą octanową jest enzym pochodzący z produkującego metan archeona Methanosarcina thermophila7-14. Kinaza octanowa, która w kierunku tworzenia fosforanu acetyloenolu potrafi wykorzystać wyłącznie PPi, a nie ATP, została wyizolowana z Entamoeba histolytica, czynnika etiologicznego amebowej czerwonki, i do tej pory stwierdzono jej obecność jedynie w tym rodzaju15,16.
W kierunku tworzenia fosforanu acetylowego aktywność kinazy acetylowej mierzy się zazwyczaj za pomocą testu hydroksamanowego, po raz pierwszy opisanego przez Lipmanna17-20, który jest testem sprzężonym, w którym konwersja ATP do ADP jest sprzężona z utlenianiem NADH do NAD+ przez enzymy kinazę pirogronianową i dehydrogenazę mleczanową21,22, lub za pomocą testu mierzącego uwalnianie fosforanu nieorganicznego po reakcji produktu w postaci fosforanu acetylowego z hydroksyloaminą23. Aktywność w przeciwnym kierunku, tworzenia octanu, mierzy się poprzez sprzężenie syntezy ATP z ADP z redukcją NADP+ do NADPH przez enzymy heksokinazę i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową24.
W niniejszej pracy opisujemy metodę wykrywania aktywności kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu, która nie wymaga enzymów sprzęgających, lecz opiera się na bezpośrednim oznaczaniu zużycia acetylofosforanu. Po reakcji enzymatycznej pozostały acetylofosforan jest przekształcany w kompleks hydroksamatu żelaza(III), który można zmierzyć spektrofotometrycznie, analogicznie do testu hydroksamanowego. W przeciwieństwie do standardowego testu sprzężonego dla tego kierunku reakcji, który zależy od produkcji ATP z ADP, niniejszy test bezpośredni może być stosowany w przypadku kinaz octanowych produkujących ATP lub PPi.
Protokół
Ogólny schemat tego protokołu przedstawiono na Rysunku 1.
1. Przygotowanie roztworów do krzywych wzorcowych i analiz
- Przygotować 100 mL 2 mol/L roztworu chlorowodorku hydroksyloaminy. Odważyć 13,9 g chlorowodorku hydroksyloaminy (MW 69,49 g/mol) i rozpuścić w około 50 mL destylowanej wody dejonizowanej (ddH2O). Dostosować pH do wartości 7,0 przy użyciu granulek wodorotlenku potasu lub roztworu stężonego. Doprowadzić objętość końcową do 100 mL. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 30 dni lub w 4 °C do 90 dni.
- Przygotować 100 mL roztworu chlorku żelaza(III) i kwasu solnego. Odważyć 13,5 g chlorku żelaza(III) (MW 270,32 g/mol) i rozpuścić w około 50 mL ddH2O. Dodać 41,3 mL stężonego kwasu solnego (12,1 mol/L) i doprowadzić do objętości końcowej 100 mL. Końcowe stężenie chlorku żelaza(III) wyniesie 0,5 mol/L, a końcowe stężenie kwasu solnego 5 mol/L. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 100 mL 1,84 mol/L roztworu kwasu trichlorooctowego. Odważyć 30,0 g kwasu trichlorooctowego (MW 163,39 g/mol), rozpuścić w ddH2O i doprowadzić objętość końcową do 100 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 5 mL 0,1 mol/L roztworu fosforanu acetylowego. Odważyć 0,092 g fosforanu acetylowego (MW 184,06 g/mol), rozpuścić w ddH2O i doprowadzić objętość końcową do 5 mL. Rozdzielić roztwór do probówek do mikrocentryfugi (0,25 mL na probówkę) i zamrozić w -20 °C do momentu użycia. Rozmrożony roztwór należy umieścić na lodzie; można go używać przez około 1 godzinę. Rozmrożonego roztworu fosforanu acetylowego nie należy ponownie zamrażać ani wykorzystywać ponownie.
- Przygotować 5 mL 0,1 mol/L roztworu ADP. Odważyć 0,24 g ADP (MW 472,5 g/mol), rozpuścić w ddH2O i doprowadzić objętość końcową do 5 mL. Rozdzielić roztwór do probówek do mikrocentryfugi (0,5 mL na probówkę) i zamrozić w -20 °C do momentu użycia. Rozmrożony roztwór przechowywać na lodzie do czasu użycia.
- Przygotować 50 mL 1 mol/L roztworu Tris. Odważyć 6,06 g Tris (MW 121,14 g/mol) i rozpuścić w 40 mL ddH2O. Dostosować pH roztworu do 7,0 za pomocą kwasu solnego i doprowadzić objętość końcową do 50 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 10 mL 1 mol/L roztworu chlorku magnezu. Odważyć 2,03 g chlorku magnezu (MW 203,31 g/mol), rozpuścić w ddH2O i doprowadzić objętość końcową do 10 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 25 mL roztworu wywołującego poprzez zmieszanie równych objętości roztworu chlorku żelaza(III)/kwasu solnego oraz roztworu kwasu trichlorooctowego. Roztwór wywołujący należy przygotowywać codziennie na świeżo i przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Przygotowanie krzywej wzorcowej dla fosforanu acetylowego
- Krzywą wzorcową dla fosforanu acetylowego tworzy się przy użyciu znanych ilości fosforanu acetylowego. Odpowiednia jest krzywa wzorcowa składająca się z sześciu do ośmiu punktów. Stężenia wzorców powinny mieścić się w zakresie od 0,03 μmoles do 0,9 μmoles na 300 μL, co odpowiada stężeniom końcowym od 0,1 do 3 mmol/L. Roztwór zapasowy fosforanu acetylowego należy rozcieńczyć do odpowiednich stężeń w 100 mM roztworze Tris do końcowej objętości 300 μL. Należy również przygotować próbkę kontrolną bez fosforanu acetylowego.
- Każdy wzorzec oraz kontrolę należy inkubować w 37 °C w bloku grzejnym przez 1 minutę.
- Do każdego wzorca oraz kontroli należy dodać 50 μL roztworu chlorowodorku hydroksyloaminy i wymieszać, potrząsając trzy razy. Wzorzec należy umieścić w bloku grzejnym w 60 °C i inkubować przez pięć minut.
- Do wzorców oraz kontroli należy dodać 100 μL roztworu wywołującego, wymieszać, potrząsając trzy razy, i pozostawić do wywołania barwy przez co najmniej jedną minutę w temperaturze pokojowej.
- Wszystkie wzorce oraz kontrolę należy odwirować w mikrowirówce przy 18,000 x g przez 1 minutę.
- Próbki należy zmierzyć spektrofotometrycznie przy 540 nm przy użyciu plastikowych kuwet 1mL, wykorzystując kontrolę jako próbkę zerową (blank) do spektrofotometrii.
- Krzywą wzorcową generuje się przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (np. Kaleidagraph, Synergy Software). Pożądane są wartości R2 równe 0,99 lub wyższe. Dane nanosi się jako absorbancję przy 540 nm w funkcji μmoles obecnego fosforanu acetylowego.
3. Analiza aktywności kinazy octanowej
- Używając opisanych roztworów, przygotować mieszaninę reakcyjną o końcowym stężeniu 0,1 mol/L buforu Tris, 10 mmol/L chlorku magnezu, 5 mmol/L ADP oraz 2 mmol/L acetylofosforanu. Przygotowanie 10 mL mieszaniny reakcyjnej wymaga 8,2 mL ddH2O, 1,0 mL roztworu Tris, 0,1 mL roztworu chlorku magnezu, 0,5 mL roztworu ADP i 0,2 mL roztworu acetylofosforanu. Mieszaninę reakcyjną rozdzielić do probówek do mikrocentryfugi w aliquotach po 300 μl. W celu wyznaczenia parametrów kinetycznych i optymalizacji stężeń substratów, w reakcjach można zmieniać stężenie jednego substratu, utrzymując drugie na stałym poziomie.
- Preinkubować reakcje przez 1 minutę w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym.
- Do reakcji dodać odpowiednią ilość enzymu i natychmiast umieścić probówkę z powrotem w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C. Należy również przygotować reakcję kontrolną, do której nie dodaje się enzymu. W przypadku przeprowadzania kilku reakcji, enzym należy dodawać do probówek w określonych odstępach czasu, dbając o precyzyjne monitorowanie czasu. (UWAGA: Ilość użytego enzymu musi zostać zoptymalizowana, aby zapobiec całkowitemu wyczerpaniu substratu w postaci acetylofosforanu lub ADP – patrz sekcja Dyskusja)
- Po 5 minutach dodać 50 μl roztworu hydroponianu hydrochlorku do każdej reakcji oraz do kontroli, wymieszać i umieścić probówki w bloku grzewczym o temperaturze 60 °C. Jeśli przeprowadzanych jest kilka reakcji, czynność tę należy wykonać w takich samych odstępach czasu, w jakich dodawano enzym.
- Inkubować reakcje oraz kontrolę przez 5 minut w temperaturze 60 °C.
- Do każdej reakcji oraz do kontroli dodać 100 μL roztworu wywoływującego, wymieszać i umieścić w statywie na blacie laboratoryjnym. Pozostawić do rozwoju barwy na co najmniej 1 minutę.
- Wszystkie probówki odwirować w mikrocentryfudze przy 18 000 x g przez 1 minutę.
- Próbki zmierzyć spektrofotometrycznie przy 540 nm, używając plastikowych kuwet 1 mL, i określić ilość obecnego acetylofosforanu poprzez porównanie z krzywą wzorcową acetylofosforanu.
- Ilość zużytego substratu acetylofosforanu można wyznaczyć, odejmując ilość acetylofosforanu pozostałego po reakcji enzymatycznej od ilości acetylofosforanu obecnego w kontroli bez enzymu. Analizę danych przeprowadzić przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (np. Kaleidagraph, Synergy Software). Pożądane są wartości R2 powyżej 0,97.
4. Reprezentatywne wyniki:
Celem niniejszego testu jest pomiar aktywności kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu. Jest to realizowane poprzez pomiar zużycia substratu w postaci acetylofosforanu, ponieważ nie istnieje łatwa, bezpośrednia metoda pomiaru produkcji octanu. Acetylofosforan pozostały po określonym czasie reakcji enzymatycznej jest przekształcany w acetylhydroksamat, a następnie w kompleks hydroksamatu żelaza(III), który ma czerwonawy kolor (Rysunek 2) mierzalny przy 540 nm. Do określenia ilości acetylofosforanu pozostałego w każdej reakcji służy krzywa wzorcowa przedstawiająca zależność absorbancji od μmoli acetylofosforanu obecnych we wzorcach. Krzywa wzorcowa powinna być liniowa i przechodzić przez punkt zero. Reprezentatywna krzywa wzorcowa przedstawiona na Rysunku 3 ma nachylenie wynoszące 1,2332 jednostek absorbancji na μmol obecnego acetylofosforanu oraz wartość R2 równą 0,99, co wskazuje na dobre dopasowanie danych do równania liniowego. Równanie dopasowania liniowego do danych krzywej wzorcowej jest wykorzystywane do obliczenia ilości acetylofosforanu pozostałego w reakcji. Liczbę μmoli zużytego acetylofosforanu wyznacza się jako różnicę między liczbą μmoli acetylofosforanu obecnych w reakcji kontrolnej bez enzymu a liczbą μmoli acetylofosforanu pozostałych po reakcji enzymatycznej.
Oczyszczoną, rekombinowaną kinazę octanową z M. thermophila analizowano zgodnie z opisanym protokołem. Dla eksperymentu przedstawionego na Rysunku 4 stężenie ADP utrzymano na stałym poziomie 5 mmol/L, a stężenie fosforanu acetylowego w reakcji zmieniano w celu wyznaczenia Km dla fosforanu acetylowego. Jak oczekiwano, eksperyment ten wykazał, że enzym wykazuje standardową kinetykę typu Michaelisa-Menten dla każdego substratu, a wykres zależności aktywności od stężenia fosforanu acetylowego przyjął postać krzywej nasycenia o kształcie hiperbolicznym. Pozorna wartość Km dla fosforanu acetylowego wyniosła 0,27 ± 0,01 mmol/L, co jest wynikiem porównywalnym z opublikowaną wartością Km wynoszącą 0,47 ± 0,01 mmol/L przy zastosowaniu testu sprzężonego13.
Metodę bezpośrednią można również wykorzystać do pomiaru aktywności kinaz octanowych wykorzystujących substraty inne niż ATP, co nie jest możliwe w przypadku standardowego testu sprzężonego. Oczyszczona rekombinowana kinaza octanowa E. histolytica16, która w kierunku tworzenia octanu produkuje PPi zamiast ATP, została poddana tej analizie z zastosowaniem fosforanu sodu zamiast ADP. Stężenie fosforanu sodu w reakcji utrzymano na stałym poziomie 0,2 mol/L i zmieniano stężenie acetylofosforanu. Podobnie jak w przypadku kinazy octanowej M. thermophila, kinaza octanowa E. histolytica wykazywała kinetykę typu Michaelisa-Menten w odniesieniu do acetylofosforanu i zaobserwowano hiperboliczną krzywą nasycenia (Rysunek 5). Pozorna wartość Km dla acetylofosforanu wynosiła 0,50 ± 0,006 mmol/L. Reeves i Guthrie15 wyznaczyli wartość Km dla acetylofosforanu wynoszącą 0,06 mmol/L dla natywnego enzymu; jednak ich enzym był jedynie częściowo oczyszczony, a w ich analizie wykorzystano cztery enzymy sprzęgające, które również były tylko częściowo oczyszczone. W związku z tym bezpośrednie porównanie tych wartości jest utrudnione.
Schemat protokołu
- Sporządzenie krzywej wzorcowej dla fosforanu acetylowego
- Rozcieńczenie enzymu do pożądanego stężenia
- Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i odpipowanie 300 μl do probówek do mikrocentryfugi
- Preinkubacja reakcji w temperaturze 37 °C przez 1 minutę
- Rozpoczęcie reakcji poprzez dodanie enzymu w określonych odstępach czasu
- Dodanie hydroksylaminy w tych samych odstępach czasu w celu zatrzymania reakcji i inkubacja w temperaturze 60 °C przez 5 minut
- Dodanie roztworu chlorku żelaza/kwasu trichlorooctowego w celu wywołania zabarwienia
- Wirowanie probówek z prędkością 18,000 x g przez 1 minutę
- Pomiar absorbancji przy 540 nm
- Wyznaczenie ilości zużytego fosforanu acetylowego poprzez porównanie z krzywą wzorcową
Rycina 1. Schemat protokołu
Rysunek 2. Standardy fosforanu acetylowego. Rosnące stężenia fosforanu acetylowego poddano reakcji z hydroksyloaminą, a następnie wywołano barwę zgodnie z opisem. Próba kontrolna bez fosforanu acetylowego ma jasny żółty kolor, a reakcje zawierające coraz większe ilości fosforanu acetylowego wykazują sukcesywnie ciemniejszy odcień. Zmianę barwy tę mierzy się przy 540 nm.
Rycina 3. Przykładowa krzywa wzorcowa dla fosforanu acetylowego. Różne ilości fosforanu acetylowego poddano reakcji z hydroksyloaminą oraz roztworem barwnym, a następnie zmierzono absorbancję przy 540 nm. Przedstawiono zależność absorbancji przy 540 nm od μmoli fosforanu acetylowego i zastosowano liniowe dopasowanie do danych.
Rycina 4. Wykorzystanie acetylofosforanu przez produkującą ATP acetatokinazę M. thermophila. Aktywność enzymatyczna została określona w kierunku tworzenia octanu w obecności 5 mmol/L ADP przy zmiennych stężeniach acetylofosforanu. Ilość zużytego acetylofosforanu określono jako różnicę między początkową ilością acetylofosforanu w reakcji a ilością acetylofosforanu pozostałą po reakcji enzymatycznej. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach; na wykresie naniesiono słupki błędów.
Rycina 5. Wykorzystanie acetylofosforanu przez kinazę octanową E. histolytica wytwarzającą PPi. Aktywność enzymatyczną w kierunku tworzenia octanu określono w obecności 0,2 mol/L fosforanu sodu przy zmiennych stężeniach acetylofosforanu. Ilość zużytego acetylofosforanu wyznaczono jako różnicę między ilością początkową acetylofosforanu w reakcji a ilością acetylofosforanu pozostałą po reakcji enzymatycznej. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach; na wykresie naniesiono słupki błędów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wykrywanie acetylofosforanu w tym teście zależy od odpowiedniego stężenia chlorowodorku hydroksyloaminy oraz stężenia i kwasowości roztworu chlorku żelaza(III). Zmiana objętości testu będzie wymagała ponownego rozważenia obu tych komponentów. Opisane tutaj reakcje enzymatyczne przeprowadzono w 37°C, natomiast zakończenie reakcji za pomocą hydroksyloaminy wykonano w 60 °C przez 5 minut. Wyższa temperatura jest kluczowa dla zapewnienia szybkiej konwersji pozostałego acetylofosforanu do acetylohydroksamianu. Czas etapu rozw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant NSF nr 0920274 oraz projekt South Carolina Experiment Station (SC-1700340) przyznany KSS. Niniejsza publikacja stanowi Wkład Techniczny nr 5929 Stacji Doświadczalnej Uniwersytetu Clemson.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fosforan acetylowy | Sigma-Aldrich | 01409 | Sól litu (97%) |
| Fosforan sodu jednodstawny (bezwodny) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S381 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S374 | |
| Chlorek magnezu (sześciowodny) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | M33 | |
| Tris (zasada) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B152 | |
| Chlorek żelaza(III) (sześciowodny) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | I88 | |
| Kwas trójchlorooctowy | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A324 | |
| Chlorowodorek hydroksyloaminy | Thermo Fisher Scientific, Inc. | H330 | |
Adenozyna 5’-difosforan sól sodowa | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Spektrofotometr Biomate III | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142982082 | Standardowy spektrofotometr UV/Vis |
Bibliografia
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
- Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
- Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
- Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
- Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
- Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
- Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
- Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
- Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
- Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
- Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).
- Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
- Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , Forthcoming (2011).
- Lipmann, F. Enzymatic synthesis of acetyl phosphate. J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).
- Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
- Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction. J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).
- Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. Enzymatic phosphorylation of acetate. J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).
- Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
- Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
- Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
- Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
