Bezpośrednie wykrywanie aktywności octanowej enzymu kinazy octanowej

Podsumowanie

Opisano metodę oznaczania aktywności kinazy octanowej. Analiza ta wykorzystuje reakcję bezpośrednią do wyznaczania aktywności enzymatycznej i kinetyki kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu z zastosowaniem różnych akceptorów fosforanowych. Ponadto metodę tę można wykorzystać do analizy innych enzymów wykorzystujących acetylofosforan lub acetylo-CoA.

Streszczenie

Kinaza octanowa, należąca do superrodziny enzymów kinaz octanowych i cukrowych-Hsp70-aktyny (ASKHA)^1-5, odpowiada za odwracalną fosforylację octanu do fosforanu acetyloenolu z wykorzystaniem ATP jako substratu. Kinazy octanowe występują powszechnie u Bacteria, znaleziono je u jednego rodzaju Archaea, a także występują one u mikroorganizmów z grupy Eukarya⁶. Najlepiej scharakteryzowaną kinazą octanową jest enzym pochodzący z produkującego metan archeona Methanosarcina thermophila^7-14. Kinaza octanowa, która w kierunku tworzenia fosforanu acetyloenolu potrafi wykorzystać wyłącznie PP_i, a nie ATP, została wyizolowana z Entamoeba histolytica, czynnika etiologicznego amebowej czerwonki, i do tej pory stwierdzono jej obecność jedynie w tym rodzaju^15,16.

W kierunku tworzenia fosforanu acetylowego aktywność kinazy acetylowej mierzy się zazwyczaj za pomocą testu hydroksamanowego, po raz pierwszy opisanego przez Lipmanna^17-20, który jest testem sprzężonym, w którym konwersja ATP do ADP jest sprzężona z utlenianiem NADH do NAD⁺ przez enzymy kinazę pirogronianową i dehydrogenazę mleczanową^21,22, lub za pomocą testu mierzącego uwalnianie fosforanu nieorganicznego po reakcji produktu w postaci fosforanu acetylowego z hydroksyloaminą²³. Aktywność w przeciwnym kierunku, tworzenia octanu, mierzy się poprzez sprzężenie syntezy ATP z ADP z redukcją NADP⁺ do NADPH przez enzymy heksokinazę i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową²⁴.

W niniejszej pracy opisujemy metodę wykrywania aktywności kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu, która nie wymaga enzymów sprzęgających, lecz opiera się na bezpośrednim oznaczaniu zużycia acetylofosforanu. Po reakcji enzymatycznej pozostały acetylofosforan jest przekształcany w kompleks hydroksamatu żelaza(III), który można zmierzyć spektrofotometrycznie, analogicznie do testu hydroksamanowego. W przeciwieństwie do standardowego testu sprzężonego dla tego kierunku reakcji, który zależy od produkcji ATP z ADP, niniejszy test bezpośredni może być stosowany w przypadku kinaz octanowych produkujących ATP lub PP_i.

Protokół

Ogólny schemat niniejszego protokołu przedstawiono na Ryc. 1.

1. Przygotowanie roztworów do krzywych wzorcowych i analiz

1. Przygotować 100 mL 2 mol/L roztworu hydroksyloaminy-HCl. Odważyć 13,9 g chlorku hydroksyloaminy (MW 69,49 g/mol) i rozpuścić w około 50 mL destylowanej wody dejonizowanej (ddH₂O). Dostosować pH do 7,0 za pomocą granulek wodorotlenku potasu lub jego stężonego roztworu. Dopełnić objętość końcową do 100 mL. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 30 dni lub w 4 °C do 90 dni.
2. Przygotować 100 mL roztworu chlorku żelaza(III) i kwasu solnego. Odważyć 13,5 g chlorku żelaza(III) (MW 270,32 g/mol) i rozpuścić w około 50 mL ddH₂O. Dodać 41,3 mL stężonego kwasu solnego (12,1 mol/L) i dopełnić do objętości końcowej 100 mL. Końcowe stężenie chlorku żelaza(III) wyniesie 0,5 mol/L, a końcowe stężenie kwasu solnego 5 mol/L. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
3. Przygotować 100 mL 1,84 mol/L roztworu kwasu trichlorooctowego. Odważyć 30,0 g kwasu trichlorooctowego (MW 163,39 g/mol), rozpuścić w ddH₂O i dopełnić objętość końcową do 100 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
4. Przygotować 5 mL 0,1 mol/L roztworu fosforanu acetylowego. Odważyć 0,092 g fosforanu acetylowego (MW 184,06 g/mol), rozpuścić w ddH₂O i dopełnić objętość końcową do 5 mL. Rozdzielić roztwór do probówek do mikrocentryfugi (0,25 mL na probówkę) i zamrozić w -20 °C do momentu użycia. Rozmrożony roztwór należy umieścić na lodzie; można go używać przez około 1 godzinę. Rozmrożonego roztworu fosforanu acetylowego nie należy ponownie zamrażać ani używać ponownie.
5. Przygotować 5 mL 0,1 mol/L roztworu ADP. Odważyć 0,24 g ADP (MW 472,5 g/mol), rozpuścić w ddH₂O i dopełnić objętość końcową do 5 mL. Rozdzielić roztwór do probówek do mikrocentryfugi (0,5 mL na probówkę) i zamrozić w -20° C do momentu użycia. Rozmrożony roztwór przechowywać na lodzie do czasu użycia.
6. Przygotować 50 mL 1 mol/L roztworu Tris. Odważyć 6,06 g Tris (MW 121,14 g/mol) i rozpuścić w 40 mL ddH₂O. Dostosować pH roztworu do 7,0 za pomocą kwasu solnego i dopełnić objętość końcową do 50 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
7. Przygotować 10 mL 1 mol/L roztworu chlorku magnezu. Odważyć 2,03 g chlorku magnezu (MW 203,31 g/mol), rozpuścić w ddH₂O i dopełnić objętość końcową do 10 mL. Roztwór przechowywać w temperaturze pokojowej.
8. Przygotować 25 mL roztworu wywoływującego poprzez zmieszanie równych objętości roztworu chlorku żelaza(III)/kwasu solnego oraz roztworu kwasu trichlorooctowego. Roztwór wywoływujący należy przygotowywać świeżo każdego dnia i przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie krzywej wzorcowej dla fosforanu acetylowego

1. Krzywą wzorcową dla fosforanu acetylo generuje się przy użyciu znanych ilości fosforanu acetylo. Odpowiednia jest krzywa wzorcowa składająca się z sześciu do ośmiu punktów. Standardy powinny mieścić się w zakresie od 0,03 μmoles do 0,9 μmoles na 300 μL, co odpowiada końcowym stężeniom od 0,1 do 3 mmol/L. Rozcieńczyć roztwór zapasowy fosforanu acetylo do odpowiednich stężeń w 100 mM roztworze Tris do końcowej objętości 300 μL. Należy również przygotować próbkę kontrolną bez fosforanu acetylo.
2. Inkubować każdy standard oraz kontrolę w temperaturze 37 °C w bloku grzejnym przez 1 minutę.
3. Do każdego standardu i kontroli dodać 50 μL roztworu hydroponianu hydrochlorku i wymieszać, potrząsając trzy razy. Umieścić standard w bloku grzejnym o temperaturze 60 °C i inkubować przez pięć minut.
4. Do standardów i kontroli dodać 100 μL roztworu wywołującego, wymieszać, potrząsając trzy razy, i pozostawić do rozwoju barwy przez co najmniej jedną minutę w temperaturze pokojowej.
5. Wszystkie standardy oraz kontrolę wirować w mikrocentryfudze przy 18,000 x g przez 1 minutę.
6. Próbki zmierzyć spektrofotometrycznie przy 540 nm przy użyciu plastikowych kuwet 1mL, stosując kontrolę jako próbkę zerową (blank) do spektrofotometrii.
7. Wygenerować krzywą wzorcową przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (np. Kaleidagraph, Synergy Software). Pożądane są wartości R² równe 0,99 lub wyższe. Dane nanosi się jako absorbancję przy 540 nm w funkcji μmoles obecnego fosforanu acetylo.

3. Analiza aktywności kinazy octanowej

1. Przy użyciu opisanych roztworów przygotować mieszaninę reakcyjną o końcowym stężeniu 0,1 mol/L buforu Tris, 10 mmol/L chlorku magnezu, 5 mmol/L ADP i 2 mmol/L fosforanu acetylu. 10 mL mieszaniny reakcyjnej będzie wymagać 8,2 mL ddH₂O, 1,0 mL roztworu Tris, 0,1 mL roztworu chlorku magnezu, 0,5 mL roztworu ADP oraz 0,2 mL roztworu fosforanu acetylu. Mieszaninę reakcyjną rozdzielić do probówek do mikrowirówki w aliquotach po 300 μl. W celu wyznaczenia parametrów kinetycznych i optymalizacji stężeń substratów, w reakcjach można zmieniać stężenie jednego substratu, utrzymując drugie na stałym poziomie.
2. Preinkubować reakcje przez 1 minutę w 37 °C w bloku grzejnym.
3. Do reakcji dodać pożądaną ilość enzymu i natychmiast umieścić probówkę z powrotem w bloku grzejnym w 37 °C. Należy również przygotować reakcję kontrolną, do której nie dodaje się enzymu. Jeśli przeprowadzanych jest kilka reakcji, enzym należy dodawać do probówek w określonych odstępach czasu. Należy dokładnie kontrolować czas. (UWAGA: Ilość użytego enzymu będzie wymagała optymalizacji, aby upewnić się, że cały substrat w postaci fosforanu acetylu lub ADP nie zostanie wyczerpany – patrz sekcja Dyskusja)
4. Po 5 minutach do każdej reakcji oraz do kontroli dodać 50 μl roztworu chlorowodorku hydroksylaminy, wymieszać i umieścić probówki w bloku grzejnym w 60 °C. W przypadku prowadzenia wielu reakcji, czynność tę należy wykonać w tych samych odstępach czasu, w których dodawano enzym.
5. Inkubować reakcje oraz kontrolę przez 5 minut w 60 °C.
6. Do każdej reakcji oraz do kontroli dodać 100 μL roztworu wywoływującego, wymieszać i umieścić w statywie na blacie laboratoryjnym. Pozostawić na co najmniej 1 minutę w celu wywołania barwy.
7. Wszystkie probówki odwirować w mikrowirówce przy 18,000 x g przez 1 minutę.
8. Próbki zmierzyć spektrofotometrycznie przy 540 nm, używając plastikowych kuwet 1 mL, i wyznaczyć ilość obecnego fosforanu acetylu poprzez porównanie z krzywą wzorcową fosforanu acetylu.
9. Ilość zużytego substratu fosforanu acetylu można wyznaczyć, odejmując ilość fosforanu acetylu pozostałego po reakcji enzymatycznej od ilości fosforanu acetylu obecnego w kontroli bez enzymu. Analizę danych przeprowadzić przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (np. Kaleidagraph, Synergy Software). Pożądane są wartości R² większe niż 0,97.

4. Reprezentatywne wyniki:

Celem niniejszego testu jest pomiar aktywności kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu. Jest to realizowane poprzez pomiar zużycia substratu, jakim jest acetylofosforan, ponieważ nie istnieje łatwa metoda bezpośredniego pomiaru produkcji octanu. Acetylofosforan pozostały po określonym czasie reakcji enzymatycznej jest przekształcany w acetylohydroksamat, a następnie w kompleks hydroksamatu żelaza, który ma czerwonawy kolor (Rysunek 2) mierzalny przy 540 nm. Krzywa wzorcowa przedstawiająca zależność absorbancji od μmoli acetylofosforanu obecnego w standardach jest wykorzystywana do określenia ilości acetylofosforanu pozostałego w każdej reakcji. Krzywa wzorcowa powinna być liniowa i przechodzić przez punkt zero. Reprezentatywna krzywa wzorcowa przedstawiona na Rysunku 3 posiada nachylenie wynoszące 1,2332 jednostek absorbancji na μmol obecnego acetylofosforanu oraz wartość R² równą 0,99, co wskazuje na dobre dopasowanie danych do równania liniowego. Równanie regresji liniowej dla danych krzywej wzorcowej służy do obliczenia ilości acetylofosforanu pozostałego w reakcji. Liczba μmoli zużytego acetylofosforanu jest określana jako różnica między liczbą μmoli acetylofosforanu obecnego w reakcji kontrolnej bez enzymu a liczbą μmoli acetylofosforanu pozostałego po reakcji enzymatycznej.

Oczyszczoną, rekombinowaną kinazę octanową M. thermophila analizowano zgodnie z opisanym protokołem. W doświadczeniu przedstawionym na Rysunku 4 stężenie ADP utrzymano na stałym poziomie 5 mmol/L, a stężenie fosforanu acetylowego w reakcji zmieniano w celu wyznaczenia wartości K_m dla fosforanu acetylowego. Zgodnie z oczekiwaniami, eksperyment ten wykazał, że enzym wykazuje standardową kinetykę typu Michaelisa-Menten dla każdego substratu, a wykres zależności aktywności od stężenia fosforanu acetylowego przyjął postać hiperboli nasycenia. Pozorna wartość K_m dla fosforanu acetylowego wyniosła 0.27 ± 0.01 mmol/L, co jest wynikiem zbliżonym do opublikowanej wartości K_m wynoszącej 0.47 ± 0.01 mmol/L uzyskanej w teście sprzężonym¹³.

Metodę bezpośrednią można również wykorzystać do pomiaru aktywności kinaz octanowych wykorzystujących substraty inne niż ATP, co nie jest możliwe w przypadku standardowego testu sprzężonego. Oczyszczona rekombinowana kinaza octanowa E. histolytica¹⁶, która w kierunku tworzenia octanu produkuje PP_i zamiast ATP, została poddana temu badaniu z wykorzystaniem fosforanu sodu zamiast ADP. Stężenie fosforanu sodu w reakcji utrzymano na stałym poziomie 0,2 mol/L, natomiast zmieniano stężenie acetylofosforanu. Podobnie jak w przypadku kinazy octanowej M. thermophila, kinaza octanowa E. histolytica wykazywała kinetykę zbliżoną do modelu Michaelisa-Menten dla acetylofosforanu i zaobserwowano hiperboliczną krzywą nasycenia (Rycina 5). Pozorna wartość K_m dla acetylofosforanu wyniosła 0,50 ± 0,006 mmol/L. Reeves i Guthrie¹⁵ określili wartość K_m dla acetylofosforanu dla enzymu natywnego na poziomie 0,06 mmol/L; jednak ich enzym był jedynie częściowo oczyszczony, a w zastosowanym przez nich teście wykorzystano cztery enzymy sprzęgające, które również były tylko częściowo oczyszczone. W związku z tym bezpośrednie porównanie tych wartości jest utrudnione.

Schemat protokołu

1. Stworzenie krzywej wzorcowej dla fosforanu acetylowego
2. Rozcieńczenie enzymu do pożądanego stężenia
3. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i rozdzielenie porcji 300 μl do probówek do mikrocentryfugi
4. Preinkubacja reakcji w temperaturze 37 °C przez 1 minutę
5. Rozpoczęcie reakcji poprzez dodanie enzymu w określonych odstępach czasu
6. Dodanie hydroksyloaminy w tych samych odstępach czasu w celu zatrzymania reakcji i inkubacja w temperaturze 60 °C przez 5 minut
7. Dodanie roztworu chlorku żelaza(III)/kwasu trójchlorooctowego w celu wywołania barwy
8. Wirowanie probówek przy 18,000 x g przez 1 minutę
9. Pomiar absorbancji przy 540 nm
10. Wyznaczenie ilości zużytego fosforanu acetylowego poprzez porównanie z krzywą wzorcową

Rysunek 1. Schemat protokołu

Rycina 2. Standardy fosforanu acetylowego. Rosnące stężenia fosforanu acetylowego poddano reakcji z hydroksylaminą, a następnie wywołano barwę zgodnie z opisem. Kontrola pozbawiona fosforanu acetylowego ma jaskrawożółty kolor, a reakcje zawierające zwiększające się ilości fosforanu acetylowego wykazują sukcesywnie ciemniejszy kolor. Zmianę barwy mierzy się przy 540 nm.

Rycina 3. Przykładowa krzywa wzorcowa acetylofosforanu. Różne ilości acetylofosforanu poddano reakcji z hydroksylaminą oraz roztworem barwnym, a następnie zmierzono absorbancję przy 540 nm. Przedstawiono zależność absorbancji przy 540 nm od μmoles acetylofosforanu i zastosowano dopasowanie liniowe do danych.

Rycina 4. Wykorzystanie fosforanu acetyloilo przez syntetyzującą ATP kinazę octanową M. thermophila. Aktywność enzymatyczna była oznaczana w kierunku tworzenia octanu w obecności 5 mmol/L ADP przy zmiennych stężeniach fosforanu acetyloilo. Ilość zużytego fosforanu acetyloilo określono jako różnicę między początkową ilością fosforanu acetyloilo w reakcji a ilością fosforanu acetyloilo pozostałą po reakcji enzymatycznej. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach; naniesiono słupki błędów.

Rycina 5. Wykorzystanie fosforanu acetylowego przez kinazę acetylową E. histolytica produkującą PP_i. Aktywność enzymatyczną w kierunku tworzenia octanu określono w obecności 0,2 mol/L fosforanu sodu przy zmiennych stężeniach fosforanu acetylowego. Ilość zużytego fosforanu acetylowego określono jako różnicę między początkową ilością fosforanu acetylowego w reakcji a ilością fosforanu acetylowego pozostałego po reakcji enzymatycznej. Analizy przeprowadzono w trzech powtórzeniach, a na wykresie naniesiono słupki błędów.

Dyskusja

Wykrywanie acetylofosforanu w tym teście zależy od odpowiedniego stężenia chlorowodorku hydroksyloaminy oraz stężenia i kwasowości roztworu chlorku żelaza(III). Zmiana objętości testu będzie wymagała ponownego rozważenia obu tych komponentów. Opisane tutaj reakcje enzymatyczne przeprowadzono w 37°C, natomiast zakończenie reakcji za pomocą hydroksyloaminy wykonano w 60 °C przez 5 minut. Wyższa temperatura jest kluczowa dla zapewnienia szybkiej konwersji pozostałego acetylofosforanu do acetylohydroksamianu. Czas etapu rozw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fosforan acetylowy	Sigma-Aldrich	01409	Sól litu (97%)
Fosforan sodu jednodstawny (bezwodny)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	S381
Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	S374
Chlorek magnezu (sześciowodny)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	M33
Tris (zasada)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	B152
Chlorek żelaza(III) (sześciowodny)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	I88
Kwas trójchlorooctowy	Thermo Fisher Scientific, Inc.	A324
Chlorowodorek hydroksyloaminy	Thermo Fisher Scientific, Inc.	H330
Adenozyna 5’-difosforan sól sodowa	Sigma-Aldrich	A2754
Spektrofotometr Biomate III	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142982082	Standardowy spektrofotometr UV/Vis