Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji LRRK2 w przebiegu choroby.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest białkiem składającym się z 2527 aminokwasów i należy do rodziny białek ROCO; posiada złożoną, wielodomenową strukturę, obejmującą domenę GTP-azy (zwaną ROC, od Ras of Complex proteins) oraz domenę kinazy1. Odkrycie w 2004 roku mutacji w LRRK2 powodujących chorobę Parkinsona (PD) sprawiło, że LRRK2 stało się przedmiotem ogromnej liczby badań nad jego normalną funkcją oraz tym, w jaki sposób białko to ulega dysfunkcji w stanie chorobowym2,3. Wstępne badania nad funkcją LRRK2 koncentrowały się na jego aktywnościach enzymatycznych4-6. Choć wciąż nie wyłonił się jasny obraz spójnych zmian w tych aktywnościach wynikających z mutacji, dane z wielu grup badawczych podkreśliły znaczenie aktywności kinazy LRRK2 w procesie śmierci komórkowej powiązanej z mutacjami7,8. W niedawnych publikacjach zgłoszono inhibitory celujące w aktywność kinazy LRRK2, co dostarczyło kluczowego narzędzia eksperymentalnego9-11. W świetle tych danych prawdopodobne jest, że właściwości enzymatyczne LRRK2 stanowią istotny wgląd w biologię tego białka, choć kwestia tego, czy mogą one być potencjalnymi celami terapeutycznymi w chorobie Parkinsona, pozostaje przedmiotem dyskusji.
W celu oceny aktywności kinazy LRRK2 zastosowano szereg różnych podejść. Początkowo testy przeprowadzano z wykorzystaniem białka z tagiem epitopowym, nadeksponowanego w liniach komórkowych ssaków i immunoprecypitowanego, przy czym testy realizowano z białkiem unieruchomionym na kuleczkach agarozowych4,5,7. Następnie wykorzystywano również oczyszczone w roztworze rekombinowane fragmenty LRRK2, na przykład fragment z tagiem GST oczyszczony z komórek owadziej, zawierający reszty 970 do 2527 LRRK212. Niedawno Daniëls et al. opisali izolację pełnej długości LRRK2 w roztworze z komórek embrionalnej nerki człowieka, jednak białko to nie jest szeroko dostępne13. W przeciwieństwie do niego, skrócona forma fuzji GST LRRK2 jest dostępna komercyjnie (od firmy Invitrogen, szczegóły w tabeli 1) i stanowi wygodne narzędzie do zaprezentowania testu aktywności kinazy LRRK2. Opisano kilka różnych wskaźników aktywności kinazy LRRK2. Wykorzystywano autofosforylację samego LRRK2, fosforylację białka zasadowego mieliny (MBP) jako generycznego substratu kinazy oraz fosforylację sztucznego substratu – nazwanego LRRKtide, opartego na fosforylacji treoninowej 558 w moezynie – a także szereg domniemanych substratów fizjologicznych, w tym α-synukleinę, moezynę i 4-EBP14-17. Status tych białek jako substratów dla LRRK2 pozostaje niejasny, dlatego opisany poniżej protokół skupi się na zastosowaniu MBP jako substratu generycznego, z zaznaczeniem użyteczności tego systemu do oceny aktywności kinazy LRRK2 skierowanej przeciwko różnym potencjalnym substratom.
Protokół
Bezpieczeństwo
Opisany poniżej protokół wykorzystuje ATP znakowany radioaktywnym 32P w pozycji fosforanu γ do monitorowania aktywności kinazy LRRK2. Opiera się on na standardowych protokołach stosowanych w naszym laboratorium, zatem w odniesieniu do wielu etapów procesu, takich jak prowadzenie elektroforezy na żelach, western blotting et cetera, materiały i dokładne warunki należy traktować jako wytyczne, ponieważ sprzęt i protokoły stosowane w tych procesach różnią się w zależności od laboratorium. Związki zawierające izotopy emitujące promieniowanie jonizujące są potencjalnie szkodliwe dla zdrowia ludzi, a ich stosowanie podlega ścisłemu licencjonowaniu i regulacjom na poziomie instytucjonalnym i krajowym. Eksperymenty w tym protokole zostały przeprowadzone po przejściu szkolenia z zakresu użytkowania otwartych źródeł promieniowania w University College London oraz zgodnie z wytycznymi dobrej praktyki laboratoryjnej dostarczonymi przez służby bezpieczeństwa uczelni (wytyczne dostępne pod adresem http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/). Nie należy podejmować prób korzystania z otwartych źródeł promieniowania przed odpowiednim przeszkoleniem i uzyskaniem zgody organów regulacyjnych. Organ regulacyjny odpowiedzialny za otwarte źródła promieniowania w badaniach laboratoryjnych różni się w zależności od kraju. Przykładami są: w Wielkiej Brytanii Health and Safety Executive (http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm), w Stanach Zjednoczonych Nuclear Regulatory Commission ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html), w Kanadzie Canadian Nuclear Safety Commission (http://nuclearsafety.gc.ca/eng/) oraz w Niemczech Das Bundesamt für Strahlenschutz (http://www.bfs.de/de/bfs). Użytkownicy w innych krajach powinni potwierdzić lokalne zasady, regulacje i organy licencjonujące u swojego inspektora ochrony radiologicznej. Środki ostrożności istotne dla tego protokołu zostały odnotowane w tekście i zaznaczone symbolem koniczyny radioaktywnej (
).
1. Przygotowanie reakcji kinazy
Wszystkie mieszaniny reakcyjne przygotowano w probówkach o pojemności 1.5ml z nakrętkami zakręcanymi zawierającymi uszczelkę typu O-ring w celu zapobiegania rozprzestrzenianiu się promieniotwórczości.
- Od thawing białka na lodzie – LRRK2 typu dzikiego, D1994A, G2019S.
- Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej na lodzie – 10nM LRRK2, 0,5μg/μl MBP, 5ul 10x buforu kinazowego, dopełnić wodą do objętości 50μl.
2. Przeprowadzenie analizy
Wszystkie etapy wykorzystujące 32P ATP powinny być przeprowadzane w wyznaczonych strefach promieniowania.
Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej – zgodnie ze standardową procedurą operacyjną w naszym laboratorium obejmują one fartuch laboratoryjny, podwójne rękawiczki oraz okulary ochronne.
Próbki zawierające 32P ATP powinny być oddzielone od użytkowników ekranami z pleksiglasu o grubości 6mm w celu zminimalizowania ekspozycji.
W stosownych przypadkach należy stosować osobiste dozymetry – w ramach UCL każdy certyfikowany użytkownik otwartych źródeł promieniowania musi posiadać dozymetr filmowy w celu monitorowania ekspozycji na promieniowanie podczas eksperymentów.
Wszystkie powierzchnie eksperymentalne powinny zostać sprawdzone pod kątem skażenia promieniotwórczego przed i po użyciu przy użyciu licznika Geigera.
Wszystkie potencjalnie skażone materiały eksploatacyjne należy utylizować w ścisłej zgodności z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi utylizacji odpadów promieniotwórczych.
- Przed rozpoczęciem analizy ustaw bloki grzewcze odpowiednio na 30°C i 100°C.
- Wyjmij 32P ATP z zamrażarki -20°C (należy pamiętać, że warunki przechowywania 32P ATP mogą się różnić w zależności od dostawcy lub rodzaju użytych radionukleydów). Przed użyciem wykonaj pomiar skażenia z zewnątrz pojemnika, a następnie rozmroź próbkę za ekranem z pleksiglasu.
- Trzymając reakcje na lodzie, dodaj do każdej 1μl 32P ATP wraz z 10μM nieznacznika ATP.
- Wymieszaj dokładnie za pomocą pipety. Wykonaj krótkie wirowanie, aby zebrać ciecz na dnie probówki i zminimalizować ryzyko kontaminacji.
- Pobierz alikwot 15μl dla punktu czasowego zero i zatrzymaj reakcję w alikwocie poprzez dodanie 5μl 4x buforu do próbek SDS oraz denaturację w 100°C przez 10 minut. Wykonaj krótkie wirowanie, aby zebrać ciecz na dnie probówki i zminimalizować ryzyko kontaminacji.
- Pozostałą próbkę umieść w bloku grzewczym i inkubuj w 30°C przez 60 minut.
- W 60. minucie pobierz 15μl i zatrzymaj reakcję poprzez dodanie 5μl 4x buforu do próbek SDS oraz denaturację w 100°C przez 10 minut. Wykonaj krótkie wirowanie, aby zebrać ciecz na dnie probówki i zminimalizować ryzyko kontaminacji.
3. Immunoblotting próbek i analiza wyników
- Próbki poddane elektroforezie SDS-PAGE
- Żel poliakrylamidowy Bis-tris 4-12%, 10 studzienek, przygotowany do elektroforezy z użyciem buforu do prowadzenia MOPS.
- 20μl każdej próbki naniesionej na żel wraz z 7μl drabinki standardowej białek SharpStain.
- Elektroforezę żelu prowadzono przy napięciu 160 V przez 90 minut lub do momentu, gdy czoło barwnika dotarło do końca żelu. Wszystkie ciecze mające kontakt z radioizotopami należy traktować jako odpady promieniotwórcze i utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji. Przepisy UCL stanowią, że ciekłe odpady promieniotwórcze należy usuwać poprzez wylanie ich do wyznaczonych zlewozmywaków do utylizacji odpadów promieniotwórczych przy jednoczesnym użyciu obfitej ilości wody.
- Białko przeniesione na membranę PVDF poprzez western blot
- Przygotowano bufor do transferu: 1x Tris-glicyna z dodatkiem 20% metanolu. Membranę PVDF oraz papier filtracyjny wycięto do odpowiedniego rozmiaru żelu, a następnie aktywowano membranę lodowatym metanolem lub nawilżono papier filtracyjny buforem do transferu. Membranę należy wcześniej oznakować długopisem, aby umożliwić identyfikację jej orientacji. Żel wyjęto z plastikowej obudowy, a nadmiar akryloamidu usunięto i zutylizowano jako odpady promieniotwórcze.
- Żel należy ułożyć w formie kanapki wraz z membraną i papierem filtracyjnym, upewniając się, że pomiędzy membraną a żelem nie ma pęcherzyków powietrza, a następnie umieścić w aparaturze do western blotu w taki sposób, aby membrana znajdowała się pomiędzy żelem a anodą.
- Transfer przeprowadzono przy napięciu 25 V przez 16 godzin.
- Przygotowano bufor do transferu: 1x Tris-glicyna z dodatkiem 20% metanolu. Membranę PVDF oraz papier filtracyjny wycięto do odpowiedniego rozmiaru żelu, a następnie aktywowano membranę lodowatym metanolem lub nawilżono papier filtracyjny buforem do transferu. Membranę należy wcześniej oznakować długopisem, aby umożliwić identyfikację jej orientacji.
- Po przeniesieniu białek na membranę PVDF, membranę należy wysuszyć w temperaturze pokojowej. Na koniec wysuszoną membranę należy umieścić pomiędzy arkuszami octanu celulozy i naświetlić ekranem fosforowym lub filmem rentgenowskim w celu detekcji białek znakowanych izotopowo. Czas ekspozycji może wynosić od kilku godzin do ponad tygodnia, w zależności od aktywności właściwej zastosowanego radioizotopu oraz kinetyki enzymatycznej reakcji.
- Skanowanie ekranu fosforowego/wywoływanie filmu. W przypadku użycia ekranu fosforowego obraz należy zapisać jako plik TIFF lub plik rastrowy o wysokiej rozdzielczości; w przypadku użycia filmu powstałą przezroczystość należy zeskanować za pomocą skanera biurkowego i zapisać jako plik TIFF lub plik rastrowy o wysokiej rozdzielczości. Obraz można następnie przeanalizować w programie ImageJ, który jest bezpłatnym oprogramowaniem dostępnym na stronie internetowej National Institutes of Health (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
4. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1 przedstawia reprezentatywne wyniki analizy przeprowadzonej z użyciem LRRK2 typu dzikiego oraz wariantów G2019S i D1994A, z zastosowaniem podstawowego białka mieliny (MBP) jako ogólnego substratu akceptora fosforanowego. Autofosforylacja LRRK2 jest widoczna przy ≈ 200kDa, natomiast wiele prążków reprezentujących fosforylowane MBP jest widocznych w zakresie 20-40kDa. Należy zwrócić uwagę na brak autofosforylacji w ścieżce D1994A (kinaza nieaktywna) oraz zwiększoną fosforylację wynikającą z mutacji G2019S. Zauważalna jest również resztkowa fosforylacja MBP w ścieżce z nieaktywną kinazą. Może to wynikać z niepełnej ablacji aktywności kinazowej LRRK2 przez mutant D1994A lub odzwierciedlać obecność śladowych ilości zanieczyszczających kinaz w reakcji.
Rysunek 1.
Dyskusja
Niniejszy artykuł opisuje podstawowy protokół badania aktywności kinazy LRRK2 z wykorzystaniem systemu in vitro. Ze względu na zwięzłość, opis ograniczono do jednogodzinnego szablonu punktu końcowego z użyciem generycznego substratu, jednak ogólny protokół można zastosować do szeregu potencjalnych substratów oraz dostosować do bardziej zaawansowanych analiz badających kinetykę aktywności kinazy LRRK2. Podkreśla to jedną z kluczowych zalet stosowania systemu in vitro do badania zachowania kinazy białka tego typu: dzięki pełnej kontroli nad stężeniami enzymu i substratu możliwe jest wygenerowanie danych kinetycznych oraz obliczenie wartości Km i Vmax dla danej reakcji. W przypadku bardziej szczegółowych ocen kinetycznych lub oceny wpływu domniemanych inhibitorów, system o wyższej przepustowości (taki jak ten uzyskany dzięki zastosowaniu substratu LRRKtide, dostępnego w firmie Invitrogen) stanowi lepszą alternatywę dla opisanego tutaj podejścia.
Należy jednak pamiętać, że redukcjonistyczny model dostarczany przez testy kinaz in vitro jest jedynie jednym z narzędzi służących do badania biologii kinazy i jej relacji z potencjalnymi substratami. Dane z takich analiz powinny być wykorzystywane w połączeniu z innymi podejściami, aby uzyskać kompleksowy obraz zachowania kinazy in vitro oraz w kontekście komórkowym. Na przykład domniemany substrat fosforylowany in vitro można poddać analizie spektrometrią mas w celu zidentyfikowania możliwych miejsc fosforylacji, które następnie można modyfikować za pomocą celowanej mutogenezy (np. poprzez zamianę reszt seryny lub treoniny będących akceptorami fosforanów na reszty niefosforylowalne, takie jak alanina), aby zbadać funkcjonalne skutki fosforylacji ex vivo.
Kluczowym aspektem przy interpretacji danych z systemu testowego in vitro, takiego jak ten, jest prawdopodobieństwo wystąpienia błędów typu I lub typu II (wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych). Redukcyjny charakter tego systemu niestety predysponuje go do obu tych rodzajów błędów – w przypadku pierwszego, zastosowanie oczyszczonego domniemanego substratu oraz oczyszczonej kinazy w sztucznie bliskiej odległości i przy wysokim stężeniu (w porównaniu do środowiska komórkowego) może prowadzić do artefaktowych zdarzeń fosforylacji. Z drugiej strony, wiele kinaz funkcjonuje jako część kompleksu w kontekście komórkowym i wymaga kofaktorów, aby doszło do fosforylacji danego substratu. Jak wspomniano powyżej, dodatni wynik fosforylacji domniemanego substratu uzyskany w systemie testowym in vitro powinien zostać następnie zweryfikowany w systemie komórkowym w celu walidacji wyniku, natomiast wynik ujemny należy interpretować z ostrożnością.
W związku z tym, w miarę możliwości kluczowe jest zastosowanie zarówno kontroli pozytywnej, jak i negatywnej, aby umożliwić porównawcze badanie aktywności analizowanej kinazy. Niezwykle cenny jest staranny dobór kontroli pozytywnej o znanej aktywności wobec badanego białka oraz kontroli negatywnej, która z dużym prawdopodobieństwem nie będzie fosforylować domniemanego substratu. Jednym z potencjalnych kontroli dla LRRK2 jest kinaza receptorowa 3 (RIK3), która posiada sekwencję pierwotną blisko spokrewnioną z domeną kinazy LRRK2, ale ma zupełnie inną ogólną strukturę domen18. Jest ona dostępna jako białko rekombinowane firmy Invitrogen i jest stosowana jako standardowa kontrola w naszym laboratorium.
Należy również zauważyć, że komercyjnie dostępna forma białka LRRK2 nie posiada końca N-końcowego i jest oznakowana transferazą S-glutationową; należy wziąć to pod uwagę jako potencjalny czynnik zakłócający podczas przeprowadzania testów kinazowych z tym białkiem, ponieważ nie jest znane, jaką rolę końcówka N-końcowa LRRK2 może odgrywać w normalnym funkcjonowaniu tego białka. Jeśli na przykład fragment N-końcowy LRRK2, który jest nieobecny w białku wykorzystanym w niniejszym protokole, ma krytyczne znaczenie dla rekrutacji konkretnego substratu do domeny kinazy LRRK2, będzie to miało istotny wpływ na obserwowaną fosforylację wspomnianego substratu w opisanym powyżej układzie in vitro.
Pomimo tych zastrzeżeń, znaczenie przypisywane biologii LRRK2 w badaniach nad chorobą Parkinsona podkreśla użyteczność niniejszego protokołu jako cennego narzędzia do badania zachowania tego białka w warunkach in vitro.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autor jest stypendystą badawczym Parkinson's UK (grant F1002). Praca ta była częściowo wspierana przez fundusze z konkursu Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration (nagroda WT089698) dla UK Parkinson's Disease Consortium (UKPDC), którego członkowie pochodzą z UCL Institute of Neurology, University of Sheffield oraz MRC Protein Phosphorylation Unit na University of Dundee.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| LRRK2 typ dziki | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Bufor kinazowy | Cell Signaling Technology | 9802S | |
| MBP | Sigma-Aldrich | M1891 | |
| 32P g ATP | PerkinElmer, Inc. | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci /mMole |
| 4x bufor do próbek LDS | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-merkapto–etanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Standardy białkowe | Invitrogen | LC5800 | |
| Bufor do elektroforezy MOPS | Invitrogen | NP0001 | |
| Żel z bis-tris akrylamidu | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| Membrana PVDF | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| Bufor do transferu | Invitrogen | NP0006 | |
| Tabela 1. Odczynniki | |||
| Do wszystkich etapów rozcieńczania użyto wody destylowanej i dejonizowanej | |||
| Licznik Geigera | Mini Instruments | ||
| Kuweta do SDS PAGE | Invitrogen | ||
| Kuweta do transferu | Invitrogen | ||
| Bloki grzewcze (2) | Eppendorf | ||
| Ekran fosforowy | GE Healthcare | Można zastąpić folią rentgenowską | |
| Skaner fosforowy | GE Healthcare | ||
| Kaseta do naświetlania | GE Healthcare | ||
| Wirówka | Eppendorf | ||
| Osłona z pleksiglasu | |||
| Proびki 1,5ml | VWR international | Zakrętka z pierścieniem O | |
| Tabela 2. Sprzęt |
Bibliografia
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
- Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
- Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
- West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
- Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
- Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
- Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
- Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
- Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
- Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
- Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
- Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
- Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
- Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. , (2007).
- Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
- Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
- Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
Przedruki i uprawnienia
