Artykuł metodologiczny

Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

10.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3518

⸱

23 kwietnia 2012

 ,  ,  ,  , 
1Tumour Virology Division F010, German Cancer Research Center (DKFZ), 2Inserm Unit 701, German Cancer Research Center (DKFZ)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oparty wyłącznie na infekcji komórek, który zwiększa wydajność produkcji rekombinowanego parwowirusa ponad 100-krotnie w porównaniu z innymi stosowanymi protokołami. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu nowego pomocniczego adenowirusa typu 5 zawierającego jednostkę transkrypcyjną VP parwowirusa (Ad-VP).

Streszczenie

Parwowirusy gryzoni (PV), takie jak szczurzy H-1PV i MVM, to małe, ikosaedryczne wirusy z jednoniciowym DNA. Ich genom zawiera dwa promotory, P4 i P38, które regulują odpowiednio ekspresję białek niestrukturalnych (NS1 i NS2) oraz białek kapsydu (VP1 i VP2)1. Budzą one duże zainteresowanie jako środki przeciwnowotworowe ze względu na swoje właściwości onkolityczne i onkosupresyjne, przy jednoczesnym braku patogenności dla ludzi2. NS1 jest głównym efektorem wirusowej cytotoksyczności3. W celu dalszego wzmocnienia ich naturalnej aktywności przeciwnowotworowej, opracowano pochodne tych wektorów poprzez zastąpienie genu kodującego białka kapsydu transgenem terapeutycznym (np. cytotoksycznym polipeptydem, cytokiną, chemokiną, genem supresora nowotworów itp.)4. Wektor rekombinowanych parwowirusów (recPV) zachowuje sekwencje kodujące NS1/2 oraz telomery genomu PV, które są niezbędne do amplifikacji i pakowania wirusowego DNA. Produkcja recPV zachodzi wyłącznie w komórkach producentach (zazwyczaj HEK293T), poprzez kotransfekcję komórek drugim wektorem (pCMV-VP) wykazującym ekspresję genu kodującego białka VP (Rys. 1)4. Wektory recPV generowane w ten sposób są defektywne w replikacji. Chociaż wykazano, że recPV posiadają zwiększoną aktywność onkotoksyczną w porównaniu z wirusami rodzicielskimi, z których zostały wytworzone, ich produkcja pozostaje głównym wyzwaniem i w znacznym stopniu utrudnia zastosowanie tych środków w klinicznych aplikacjach przeciwnowotworowych.

Odkryliśmy, że wprowadzenie do komórek HEK293T wektora pochodnego od Ad-5 zawierającego geny E2a, E4(orf6) oraz VA RNA (np. plazmid pXX6) zwiększyło produkcję recPV ponad 10-krotnie w porównaniu z innymi stosowanymi protokołami. W oparciu o to odkrycie skonstruowaliśmy nowy pomocniczy wektor Ad-VP-helper, który zawiera genomiczne elementy adenowirusowe niezbędne do zwiększenia produkcji recPV, a także jednostkę genu VP parwowirusa5. Zastosowanie Ad-VP-helper pozwala na produkcję rec-PV zgodnie z protokołem opierającym się wyłącznie na etapach infekcji wirusowej (w przeciwieństwie do transfekcji plazmidowej), co umożliwia wykorzystanie linii komórkowych trudnych do transfekcji (np. NB324K) (Rys. 2). Przedstawiamy metodę, która znacznie zwiększa ilość produkowanego wirusa rekombinowanego, skracając czas produkcji i redukując koszty, bez wpływu na jakość produktu końcowego5. Ponadto możliwe jest teraz prowadzenie produkcji recPV na dużą skalę (w komórkach w zawiesinie i bioreaktorach).

Protokół

Należy pamiętać, że do produkcji rekombinowanych parwowirusów (recPV) wymagane jest laboratorium z poziomem bezpieczeństwa biologicznego 2.

Protokół jest podzielony na dwie główne części. Pierwsza część (produkcja recPV poprzez transfekcję) jest niezbędna do wytworzenia minimalnej ilości recPV, która posłuży jako inokulum w drugiej części protokołu (produkcja recPV poprzez infekcję). Po uzyskaniu niewielkiej ilości recPV pierwszą część protokołu można pominąć, a rekombinowany parwowirus może być amplifikowany wyłącznie poprzez infekcję, zapewniając gen kodujący białka kapsydu parwowirusa za pomocą adenowirusowego helpera (patrz poniżej).

1. Produkcja recPV poprzez transfekcję

1.1 Transfekcja viralnego DNA

W tej sekcji protokołu możliwe jest zastosowanie dowolnej uznanej metody transfekcji DNA, opartej na kationowych lipidach lub fosforanie wapnia. Zazwyczaj stosujemy odczyn do transfekcji Fugene HD. Aby kontrolować wydajność transfekcji, zalecamy transfekcję dodatkowej płytki plazmidem kodującym wzmocnione zielone białko fluorescencyjne (np. pEGFP-N1, Clontech). Transfekcję uznaje się za wydajną i optymalną dla produkcji wirusa, gdy co najmniej 50% populacji komórek wykazuje pozytywny wynik dla EGFP 24 godziny po transfekcji.

  1. Na 1 dzień przed transfekcją wysiać 2 miliony komórek HEK293T na płytkę 10 cm, aby uzyskać 50% konfluencji w dniu transfekcji. Hodować komórki w 10 ml pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  2. Przygotować mieszaninę do produkcji wirusa (stosunek molowy 1:2:1) w probówce 1,5 ml:
    1. 3 μg wektora recPV zawierającego interesujący transgen (np. phH-1-GFP6).
    2. 6 μg wektora pCMV/VP5 zawierającego jednostkę genu kapsydu parwowirusa
    3. 8 μg plazmidu pomocniczego pXX67 pochodzenia adenowirusowego.
  3. Rozcieńczyć mieszaninę plazmidów w pożywce bezsurowiczej do objętości 850 μl (finalne stężenie 20 ng/μl).
  4. Dodać 42,5 μl Fugene HD (stosunek 2,5:1 μl Fugene : μg DNA). Podczas dodawania Fugene do pożywki nie dotykać ścianek probówki.
  5. Delikatnie mieszać na wortexie przez 5-10 sekund.
  6. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  7. Dodawać mieszaniny do transfekcji kroplami do komórek. Delikatnie potrząsać płytką, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę.

1.2 Produkcja wirusa

  1. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przy 92% wilgotności i 5% CO2 przez 72 godziny przed zbiorem. W tym okresie z plazmidów parwowirusowych powstają cząsteczki potomnego parwowirusa.

1.3 Pozyskiwanie wirusa

  1. W komorze do hodowli tkanek zeskrobcie komórki wraz z medium, odessijcie i przenieście zawiesinę z płytki do plastikowej probówki o pojemności 15 ml.
  2. Wirowarkujcie probówkę przy 250 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  3. Usuńcie 95% supernatantu.
  4. Delikatnie wymieszajcie zawartość probówki na wortexie, aby resuspenderować osad w pozostałym supernatancie (około 0,5 ml).
  5. Zamroźcie probówkę w temperaturze -80 °C. Na tym etapie można przerwać proces lub kontynuować protokół.
  6. Rozmroźcie zawiesinę i doprowadźcie ją do temperatury pokojowej.
  7. Zamroźcie zawiesinę w kąpieli z ciekłego azotu, a następnie rozmroźcie w ciepłej wodzie o temperaturze 37 °C. Intensywnie mieszajcie probówki na wortexie przez 15 s i powtórzcie cykl zamrażania i rozmrażania jeszcze dwa razy.
  8. Wirowarkujcie probówki przy 16 000x g przez 15 min w temperaturze 4 °C.
  9. Zbierzcie supernatant do nowej probówki. Na tym etapie probówka zawiera preparat surowego ekstraktu wirusowego.
  10. Przystąpcie do miareczkowania wirusa (patrz poniżej). W przypadku recPV niosącego gen GFP typowa produkcja powinna dać 1-3 x 107 zakaźnych jednostek wirusowych, co odpowiada około 1-3 x 1010 cząsteczek zawierających genom wirusowy.

1.4 Przechowywanie wirusa

  1. W celu długoterminowego przechowywania zamrozić probówkę zawierającą surowy ekstrakt wirusowy w temperaturze -80 °C. Surowe ekstrakty wirusowe można wykorzystać jako inokulum w drugiej części protokołu.

2. Produkcja recPV poprzez infekcję

Przed rozpoczęciem produkcji recPV metodą infekcji, należy wytworzyć i oczyścić adenowirusa 5 niosącego gen VP parwowirusa (pomocniczy Ad-VP, opisany w5) zgodnie ze standardowym protokołem8. Niezbędne jest również posiadanie minimalnej ilości recPV niosących interesujący transgen (np. wytworzonych poprzez transfekcję, jak opisano powyżej).

Poniżej opisujemy produkcję recPV w kolbach o powierzchni 175 cm2 (T175). Dalsza amplifikacja zapasu wirusa otrzymanego w ten sposób może być przeprowadzona w 10-warstwowych komorach hodowlanych CellSTACK (Corning) przy niewielkich modyfikacjach proponowanego protokołu.

2.1 Infekcja

  1. 1 dzień przed infekcją wysiać 10 milionów komórek NB324K do kolby T175, aby uzyskać 60-80% konfluencji komórek w dniu infekcji. Przygotować drugą kolbę zawierającą taką samą liczbę komórek jako kontrolę (komórki nieinfekowane). Każda kolba T175 powinna zawierać 20 ml Minimum Essential Medium (MEM) jako objętość końcową, uzupełnionej o 5% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, 100U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  2. Następnego ranka przygotować w plastikowej probówce o pojemności 2 ml mieszaninę wirusową składającą się z:
    1. Ad-VP-helper5 przy wielokrotności zakażenia (MOI, jednostek zakaźnych/komórkę) = 10 (co odpowiada 1 x 108 jednostek zakaźnych);
    2. recPVs przy MOI = 0,5 (co odpowiada 5 x 106 jednostek zakaźnych). Uzupełnić do 1,5 ml za pomocą MEM.
  3. Nanieść całą mieszaninę wirusową do jednej z kolb T175.
  4. Inkubować kolbę przez 2 hr w temperaturze 37 °C i wilgotności 92%, przy 5% CO2, delikatnie wstrząsając co 15 min.
  5. Inkubować przez kolejne 20-24 hr w temperaturze 37 °C i wilgotności 92%, przy 5% CO2.
  6. Wymienić pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę.

2.2 Produkcja wirusa

Inkubować kolby w temperaturze 37 °C przy 92% wilgotności i 5% CO2 przez 48 godzin. Jako wskaźnik wydajnej produkcji wirusowej, od 36 do 48 godzin po infekcji w kolbie zawierającej zainfekowane komórki powinny być widoczne wyraźne oznaki cytotoksyczności.

2.3 Zbiór wirusa

  1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odessać i przenieść supernatant pożywki z kolby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  2. Przemyć komórki dwukrotnie 1,5 ml PBS.
  3. Poddać komórki trypsynizacji, używając 1,5 ml 0,25 % Trypsyny-EDTA. Dodać zawiesinę komórkową do wcześniej usuniętej pożywki.
  4. Odwirować komórki wraz z supernatantem przy 5,000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  5. Odlać supernatant.
  6. Do osadu komórkowego dodać 1 ml buforu TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) i delikatnie wymieszać probówkę na wortexie w celu resuspensji komórek.
  7. Zamrozić zawiesinę komórkową w kąpieli z ciekłym azotem, a następnie rozmrozić w ciepłej wodzie o temperaturze 37 °C. Energicznie mieszać probówkę na wortexie przez 15 s i powtórzyć cykl zamrażania i rozmrażania trzy razy.
  8. Potraktować zawiesinę komórkową nukleazą Benzonase w stężeniu 50 U/ml przez 30 min w temperaturze 37 °C, aby strawić genomiczne DNA komórek oraz nieopakowane DNA wirusowe.
  9. Odwirować probówkę przy 5,000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C.
  10. Zebrać supernatant do nowej probówki. Supernatant na tym etapie stanowi surowy ekstrakt wirusowy. Typowe wydajności recPV-GFP otrzymywane według tego protokołu powinny mieścić się w zakresie 1-10 x 108 zakaźnych jednostek wirusowych.

2.4 Przechowywanie wirusa

  1. W przypadku przechowywania krótkoterminowego (maksymalnie 2 miesiące) przechowywać wirusa w temperaturze 4 °C.
  2. W przypadku przechowywania długoterminowego (powyżej 2 miesięcy) przechowywać wirusa w temperaturze -80 °C.

3. Oczyszczanie RecPV

  1. W celu oczyszczania recPV z surowych lizatów zalecamy przeprowadzenie dyskretnego gradientu Iodixanolu zgodnie z metodą Zolotukhin et al. 9. Dla zapewnienia efektywnego oczyszczania wirusa zalecamy użycie co najmniej 5 ml surowego ekstraktu wirusowego (uzyskanego z produkcji w pięciu kolbach T175).

4. Miareczkowanie rekombinowanego parwowirusa

  1. Przeprowadź miareczkowanie recPV zgodnie z opisem w pracy El-Andaloussi et al.5

5. Kontrola jakości

  1. Należy zastosować protokół opisany przez El-Andaloussi et al.5 w celu sprawdzenia obecności niepożądanych wirusów zdolnych do replikacji (RCV), przeprowadzając test plackowy dla parwowirusów w komórkach wskaźnikowych NB324K.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykład produkcji recPV poprzez transfekcję w obecności lub przy braku genomicznych elementów adenowirusa przedstawiono na Rysunku 3. Komórki poddano transfekcji pCMV/VP (plazmidem niosącym gen kodujący białka kapsydu parwowirusa VP) wraz z phH-1-GFP (recPV zawierającym gen GFP) lub phH-1-luciferase (recPV zawierającym gen lucyferazy świetlika), z (+ pXX6) lub bez (-pXX6) plazmidu pXX6 (niosącego geny adenowirusa E2A, E4(orf6) oraz VA RNA). Równe objętości surowych ekstraktów komórkowych naniesiono na komórki NB324K, a następnie przeprowadzono testy transdukcji GFP lub testy lucyferazy zgodnie z opisem El-Andaloussi et al.5. W obecności pXX6 uzyskano wyraźny wzrost produkcji recPV, gdzie produkcja wzrosła z 0,3 jednostek transdukcyjnych (TU)/komórkę GFP uzyskanych zgodnie z konwencjonalnymi protokołami do około 5 TU/komórkę uzyskanych za pomocą naszej metody (Rys. 3A, B). Znaczący wzrost (około 24-krotny) produkcji recPV zaobserwowano również w przypadku phH-1-luciferase (Rys. 3C). Wyniki te wskazują, że materiał genetyczny zawarty w pXX6 jest w stanie zwiększyć produkcję parwowirusa.

Reprezentatywny przykład produkcji recPV poprzez infekcję przedstawiono na Ryc. 4. Komórki NB324K poddano koinfekcji różnymi recPV (zgodnie z oznaczeniami na rysunku) oraz Ad-VP-helper (zawierającym gen kodujący białka kapsydu PV VP). Ad-VP helper dodatkowo zwiększył produkcję recPV do poziomu >70 TU na wysianą komórkę (Ryc. 4A) bez zwiększenia częstotliwości występowania niepożądanych, zdolnych do replikacji cząstek wirusowych (Ryc. 4B).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Wektory oparte na autonomicznych parwowirusach. (A) Góra: Transgen zastępuje część genów kodujących VP i znajduje się pod kontrolą wirusowego promotora P38. Geny NS1/2 zostają zachowane, a ich ekspresja jest kontrolowana przez wirusowy promotor P4. Genom wektora jest flankowany przez parwowirusowe sekwencje ITR, które zawierają elementy działające w cis, niezbędne do replikacji i pakowania rekombinowanego genomu. Dół: Plazmid niosący gen VP pod promotorem heterologicznym (np. CMV) lub autologicznym (np. P38) (Px) jest dostarczany in trans podczas produkcji rekombinowanych parwowirusów w celu zrekompensowania przerwania genów strukturalnych w rekombinowanym genomie. ITR, odwrócone powtórzenia końcowe. Rysunek zaadaptowano z 4. (B) Schematyczny widok klasycznego protokołu stosowanego do produkcji recPV. Komórki HEK293T są przejściowo transfekowane wirusowym DNA (plazmidy wektorowe i pomocnicze), a po trzech dniach komórki są zbierane i odzyskuje się wirusy.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Produkcja recPV przy użyciu Ad-VP. (A) Schematyczne mapy genomów recPV i Ad-VP. recPV zawiera heterologiczny transgen, który zastępuje część regionu VP. Ad-VP niesie gen VP parwowirusa. (B) Schematyczny widok protokołu opisanego w niniejszej pracy. Komórki NB324K są współzakażone wirusami recPV i Ad-VP. Po trzech dniach komórki są zbierane, a cząsteczki recPV odzyskiwane z lizatu komórkowego.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Stymulacja produkcji recPV przez plazmidy pXX6 oparte na adenowirusie. Komórki HEK293T, wysiane w szalkach 10 cm, przetransfekowano pCMV/VP w połączeniu z phH-1-GFP (A i B) lub phH-1-luciferase (C) w celu produkcji recPV. Jednocześnie komórki ko-transfekowano pomocniczymi plazmidami pXX6 pochodzenia adenowirusowego lub nie, zgodnie z oznaczeniem. Trzy dni po transfekcji komórki zebrano i poddano lizie poprzez trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Równe objętości surowych ekstraktów wirusowych naniesiono na komórki wskaźnikowe NBK i przeprowadzono testy transdukcji. (A) Reprezentatywne mikrofotografie przedstawiające komórki GFP-dodatnie w konfluencyjnych monowarstwach NB324K. (B) Ilościowe oznaczenie testów transdukcji GFP wyrażone w jednostkach transdukcji (TU) na wysianą komórkę. (C) Ilościowe oznaczenie aktywności lucyferazy wyrażone w względnych jednostkach lucyferazy (RLU). Test lucyferazowy przeprowadzono zgodnie z opisem El-Andaloussi et al.5. Słupki reprezentują wartości średnie z trzech powtórzeń z naniesionym odchyleniem standardowym. Liczba nad słupkiem + pXX6 w częściach (B i C) wskazuje krotność wzrostu mian wirusa recPV uzyskanego w obecności pXX6 w porównaniu do jego braku.

figure-protocol-4
Rycina 4. Stymulacja produkcji recPV za pomocą rekombinowanego wirusa pomocniczego Ad-VP. (A) Komórki NB324K zainfekowano oczyszczonym wirusem pomocniczym Ad-VP przy MOI wynoszącym 10 (jednostki Ad-X/komórkę, mianowane za pomocą zestawu Adeno-X Rapid Titer Kit), a następnie przeprowadziono superinfekcję przy użyciu jednego z następujących rekombinowanych parwowirusów: Chi-hH-1-EGFP11 (0.1 TU/komórkę) lub H-1-GFP (0.5 TU/komórkę)5. Jeden dzień po infekcji wymieniono podłoże, a dwa dni później komórki zebrano i poddano lizie poprzez trzy cykle zamrażania i rozmrażania. Surowe ekstrakty komórkowe wykorzystano do oznaczenia miana wirusów za pomocą testu transdukcji zgodnie z metodą El-Andaloussi et al.5. TU, jednostka transdukcji. (B) Partie wirusów otrzymane w obecności lub przy braku Ad-VP przeanalizowano pod kątem zawartości zdolnych do replikacji cząstek wirusowych (RCV) za pomocą testu plackowego na komórkach wskaźnikowych NB324K.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykazaliśmy, że produkcja recPV może zostać zwiększona dzięki obecności elementów genomowych adenowirusa. Zwiększyliśmy wydajność recPV ponad 10-krotnie (z 0,3 do 5 TU/komórkę) poprzez dostarczenie elementu genomowego adenowirusa za pomocą transfekcji, a ponad 100-krotnie poprzez koinfekcję komórek Ad-VP-helper w połączeniu z recPV w porównaniu do konwencjonalnych protokołów. Opisany tutaj protokół można dalej zoptymalizować, określając najbardziej odpowiedni czas dostarczenia elementów genomowych adenowirusa oraz optyma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy zespołowi jednostki produkcji i rozwoju wirusów DKFZ, w szczególności Marcusowi Müllerowi, Silvii Münstermann, Barbarze Liebetrau i Mandy Roscher. Badanie to zostało częściowo wsparte grantami z Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (BMBF) oraz Stowarzyszenia Helmholtza w ramach wspólnego programu Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est w zakresie stosowanej wirusologii nowotworów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM Sigma-AldrichD5796
MEMSigma-AldrichM4655
Płodowe surowica bydlęca (F–tal Bovine Serum)PAA LaboratoriesA15-101
L-glutaminaGIBCO, by Life Technologies25030-024
FugeneRoche Group047097050001
Trypsyna-EDTAInvitrogen25300062
Nukleaza BenzonaseSigma-AldrichE8263
Zestaw do szybkiego oznaczania miana Adeno-X Rapid Titer Kit Clontech Laboratories632250

Bibliografia

  1. Cotmore, S. F., Tattersall, P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv. Virus. Res. 70, 183(2007).
  2. Rommelaere, J. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185(2010).
  3. Hristov, G. Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species. J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).
  4. Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. J. Virol. 6, 193-193 (2004).
  5. El-Andaloussi, N. Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus. Cancer Gene Ther. 18, (2011).
  6. Kestler, J. cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses. Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).
  7. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J. Virol. 72, 2224(1998).
  8. He, T. C. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509(1998).
  9. Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene. Ther. 6, 973(1999).
  10. Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation. J. Virol. Methods. 63, 129(1997).
  11. Wrzesinski, C. Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. J. Virol. 77, 3851(2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transfekcja kom rek HEK293Tinfekcja NB324Ktest miareczkowania wirusatest plackowycykl zamra ania i rozmra aniatraktowanie nukleaz Benasesurowy ekstrakt wirusowypomocniczy adenowirus VP

Powiązane artykuły