Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Podsumowanie

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Streszczenie

Kluczową cechą złośliwości nowotworu jest inwazja i przerzutowanie ¹W niektórych nowotworach (np.gglejak ²), miejscowa inwazja do otaczających zdrowych tkanek jest główną przyczyną choroby i zgonu. W przypadku innych nowotworów (np.gpierś, płuco, itp..), to proces przerzutowania, w którym komórki nowotworowe przemieszczają się z pierwotnej masy guza, kolonizują odległe miejsca i ostatecznie przyczyniają się do niewydolności narządów, co w konsekwencji prowadzi do zachorowalności i śmiertelności ³Szacuje się, że inwazja i przerzuty odpowiadają za 90% zgonów z powodu nowotworów. ⁴W rezultacie pojawiło się ogromne zainteresowanie identyfikacją procesów molekularnych oraz kluczowych białkowych mediatorów inwazji i przerzutowania w celu usprawnienia diagnostyki i leczenia. ⁵.

Wyzwaniem dla naukowców zajmujących się nowotworami jest opracowanie testów inwazji, które w wystarczającym stopniu przypominają sytuację in vivo, aby umożliwić dokładne modelowanie choroby ⁶. Dwuwymiarowe testy motywności komórek dostarczają informacji tylko o jednym aspekcie inwazji i nie uwzględniają przebudowy białek macierzy pozakomórkowej (ECM), która również jest kluczowym elementem. Niedawne badania doprecyzowały naszą wiedzę na temat inwazji komórek nowotworowych i wykazały, że poszczególne komórki mogą przemieszczać się w trybie wydłużonym lub zaokrąglonym ⁷. Ponadto większą wagę przywiązano do roli inwazji zbiorczej, w której komórki naciekają w postaci pasm, płatów i skupisk, szczególnie w nowotworach wysoko zróżnicowanych, zachowujących cechy nabłonkowe, w rozprzestrzenianiu się raka ⁸.

Przedstawiamy udoskonaloną metodę ⁹ badania wpływu białek kandydackich na inwazję zbiorczą ¹⁰. W szczególności, poprzez zaprojektowanie oddzielnych pul komórek eksprymujących różne białka fluorescencyjne, możliwe jest molekularne rozdzielenie aktywności i białek wymaganych w komórkach prowadzących w porównaniu z tymi wymaganymi w komórkach podążających. Zastosowanie RNAi dostarcza narzędzi molekularnych do eksperymentalnego rozbicia procesów zaangażowanych w inwazję pojedynczych komórek, jak również w różnych pozycjach inwazji zbiorczej. W tej procedurze mieszaniny komórek znakowanych fluorescencyjnie wysiewa się na dno wkładki Transwell, którą wcześniej wypełniono białkiem ECM Matrigel, a następnie pozwala się im na inwazję „w górę” przez filtr do wnętrza Matrigelu. Rekonstrukcja stosów obrazów z serii z, uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego, w reprezentacje trójwymiarowe pozwala na wizualizację zbiorczo inwadujących pasm oraz analizę rozmieszczenia komórek znakowanych fluorescencyjnie w pozycjach prowadzących w stosunku do podążających.

Protokół

1. Retrowirusowe znakowanie komórek białkami fluorescencyjnymi

1. Wysiewać komórki do pakowania retrowirusów (np. Phoenix) przy 0,25 x 10⁶ liczba komórek na dołek w płytce 6-dołkowej szalkę w DMEM z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
2. Po 48 godzinach przeprowadzić transfekcję komórek retroviralnym DNA przy użyciu odczynnika Effectene zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Po 24 godzinach przepłukać dołki dwukrotnie pożywką, a następnie dodać do każdego dołka 1,5 ml DMEM z dodatkiem 10% FBS.
4. Po 48 godzinach zebrać zapakowany wirus w pożywce do hodowli tkankowych, pipetując go i przenosząc do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml.
5. Wirować przy 1600 obr./min przez 5 min w celu osadzenia komórek.
6. Przenieś nadsącz do czystej probówki i przechowuj w temperaturze -80°C.
7. Komórki przeznaczone do transdukcji retrowirusowej wysiewa się w zagęszczeniu 1,5 x 10⁵ komórek na dołek w płytce 6-dołkowej i umieszczono w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C przez noc.
8. Następnego dnia usunąć pożywkę z komórek i dodać do każdego dołka 1 ml zapasu wirusa z dodatkiem 4 μl polybrene (2 mg/ml). Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze.
9. Po inkubacji trwającej 5–6 godzin do każdego dołka należy dodać 2 ml DMEM z 10% FBS, a następnie płytki należy ponownie umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C na noc.
10. Następnego dnia należy wymienić medium i odczekać 24 godziny przed dodaniem odpowiedniego medium selekcyjnego.
11. Po osiągnięciu konfluencji (co zależy od szybkości wzrostu komórek i wydajności transdukcji retrowirusowej, lecz zazwyczaj trwa od 4 do 14 dni), komórki należy poddać trypsynizacji, a następnie wyizolować za pomocą sortowania fluorescencyjnego, przyjmując komórki nietransdukowane jako punkt odniesienia. Należy zebrać i połączyć komórki o fluorescencji wyższej niż w przypadku komórek nietransdukowanych, a następnie zamrozić alikwoty w temperaturze -80° C do późniejszego wykorzystania.

2. Odwrócony test inwazji w Matrigelu

1. Powoli rozmrozić na lodzie alikwot kompletnego Matrigelu (tj. zawierającego czynniki wzrostu) (Rysunek 1A).
2. Po rozmrożeniu należy rozcieńczyć Matrigel w stosunku 1:1 w lodowatym PBS (dodając wszelkie inne substancje w stężeniu 2x do PBS przed rozcieńczeniem; Rysunek 1B). Aby ułatwić manipulowanie Matrigelem przed polimeryzacją, wszystkie elementy plastikowe (np. końcówki, probówki itp.) powinny być lodowate.
3. Wstaw do dołków płytki hodowlanej 24-dołkowej odpowiednią liczbę niepowlekanych wkładów Transwell o średnicy 6,5 mm i porach o wielkości 8 μm, następnie ostrożnie pipetuj 100 μl rozcieńczonego Matrigelu do dołków i inkubuj przez ok. 30 min w temperaturze 37°C do czasu stężenia (Ryc. 1C).
4. W tym czasie należy przygotować jedną lub więcej zawiesin komórek znakowanych fluorescencyjnie o stężeniu od 1 do 4 x 10⁵ komórek na ml, w zależności od linii komórkowej, z każdego warunku wstępnego traktowania (np.g. siRNA, leczenie farmakologiczne) w ich normalnej pożywce wzrostowej (rycina 1D).
5. Po zestaleniu Matrigelu należy odwrócić wkładki Transwell i nanieść pipetą 100 μl zawiesiny komórkowej na skierowaną ku górze dolną stronę filtra (Rysunek 1E).
6. Ostrożnie przykryj Transwella dnem 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, tak aby stykała się ona z każdą kroplą zawiesiny komórkowej (Rysunek 1F).
7. Inkubować płytkę w pozycji odwróconej przez 4 godziny, aby umożliwić przywieranie komórek (Rycina 1G).
8. Po tym czasie obrócić płytki stroną górną do góry i przemyć każdy wkład Transwell poprzez sekwencyjne zanurzanie w 2 x 1 ml pożywki bez surowicy (Rycina 2A).
9. Pozostaw Transwelle w trzecim dołku zawierającym wszelkie wymagane leki lub substancje terapeutyczne (rycina 2B).
10. Ostrożnie nanieś pipetą 100 μl 10% FBS/DMEM z dodatkiem chemoatraktanta (np.g(EGF w stężeniu 25 ng/ml) do wkładki Transwell na powierzchnię zestalonej mieszaniny Matrigel/PBS, zamknąć pokrywkę i inkubować przez 3–5 dni w temperaturze 37°C przy 5% CO2₂ (Rysunek 2C).

3. Barwienie i wizualizacja

1. Komórki wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych mogą pominąć poniższe kroki przed przeprowadzeniem mikroskopii konfokalnej
2. Aby obrazować niefluorescencyjne komórki naciekające Matrigel, należy umieścić wkładki Transwell w nowych płytkach 24-dołkowych i nanieść pipetą 1 ml roztworu barwiącego Calcein AM o stężeniu 4 μM na górną powierzchnię każdej zatyczki z Matrigelu, pozwalając mu spłynąć po bokach i zabarwić próbkę od góry oraz od dołu. Calcein AM (ester acetoksymetylowy kalceiny) jest barwnikiem do żywych komórek, który barwi całe komórki na zielono i nie wymaga fiksacji.
3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO₂; w tym momencie komórki są w pełni zabarwione i gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.
4. Alternatywnie, niefluorescencyjne komórki naciekające Matrigel można ufiksować i zabarwić zgodnie z opisem w punktach 3.5 do 3.9.
5. Przenieść każdą wkładkę Transwell do nowej płytki 24-dołkowej. Przykryć 1 ml 4% paraformaldehydu/0,2% Triton-X 100.
6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 0,5 godziny.
7. Usunąć utrwalacz i przemyć 3 razy 1 ml PBS.
8. Usunąć RNA cytoplazmatyczne poprzez 30-minutową obróbkę RNazą w stężeniu 100 μg/ml. Przemyć 2 razy PBS.
9. W celu wizualizacji dodać 0,01 mg/ml jodku propidyny (PI) rozpuszczonego w PBS i pozostawić w temperaturze pokojowej w ciemności na 0,5 godziny. Przemyć 3 razy PBS. Na tym etapie zabarwione PI wkładki Transwell można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez co najmniej 1 miesiąc.
10. Precyzyjne metody obrazowania w mikroskopii konfokalnej zależą od dostępnych zasobów. Korzystając z odwróconego mikroskopu konfokalnego, należy umieścić wkładkę Transwell z niewielką ilością pozostałego PBS na dużym szkiełku nakrywowym (upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza) nad obiektywem 20 X (bez immersji) i zarejestrować przekroje optyczne co 10-15 μm od dna zatyczki z Matrigelu. Poszczególne przekroje optyczne mogą służyć do ilościowej oceny stopnia naciekania (Ryc. 3A) lub do budowy obiektów trójwymiarowych przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, takiego jak Volocity (Ryc. 3B).

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład serii Z przekrojów optycznych przedstawiono na rysunku 3A. W tym przypadku komórki zabarwiono Calcein AM i można zauważyć, że liczba komórek naciekających w górę z filtra zmniejsza się wraz z odległością. Ilościową ocenę inwazji można przeprowadzić poprzez analizę stosunku pikseli pozytywnych pod kątem Calcein AM do pikseli negatywnych w każdym odstępie lub za pomocą opisanej powyżej metody fiksacji i barwienia oraz zliczania jąder pozytywnych pod kątem PI w każdej pozycji. Jedną z zalet barwienia Calcein AM jest możliwość stworzenia trójwymiarowych rekonstrukcji inwazji komórek przy użyciu oprogramowania takiego jak Volocity, co pozwala na wizualne przedstawienie sposobu inwazji (rysunek 3B). Jeśli komórki są znakowane poprzez ekspresję białek fluorescencyjnych, pozycje komórek każdego koloru można zwizualizować w rekonstrukcjach trójwymiarowych, oglądając je z boku (rysunek 3C) lub wykonując przekroje przez rekonstrukcję (rysunek 3D).

Rycina 1. Schemat etapów przygotowania odwróconego testu inwazyjności. A) Rozmrażanie Matrigelu ECM na lodzie. B) Rozcieńczenie Matrigelu w stosunku 1:1 w PBS zawierającym leki w dwukrotnym stężeniu końcowym. C) Umieszczenie wkładów Transwell w płytkach wielodołkowych i pipetowanie Matrigelu do każdego otworu. D) Przygotowanie zawiesin komórkowych o pożądanym stężeniu. E) Po zastygnięciu Matrigelu płytka zostaje odwrócona i usunięta, a komórki są wysiewane na dolną stronę filtra wkładów Transwell. F) W pozycji odwróconej płytka wielodołkowa jest ostrożnie przykładana do wkładów Transwell, aby nawiązać kontakt z zawiesiną komórkową. G) Pozostawienie komórek na 4 godziny w celu ich przylegania do filtra.

Rycina 2. Kontynuacja schematu testu inwazji odwrotnej. A) Po przylegnięciu komórek, zanurz każdy wkład Transwell dwukrotnie w pożywce bezsurowiczej, aby usunąć luźne komórki. B) Umieść wypłukany wkład Transwell w końcowej studni zawierającej pożywkę oraz wymagane substancje testowe. C) Pożywka zawierająca chemoatraktant (np. 10% płodowej surowicy bydlęcej) z wymaganymi substancjami testowymi jest ostrożnie nanoszona warstwą na Matrigel.

Rycina 3. Reprezentatywne obrazy wyników odwróconego testu inwazyjności. A) Przekroje optyczne komórek barwionych Calcein AM inwadujących Matrigel, wykonane w odstępach 15 μm za pomocą mikroskopii konfokalnej. B) Trójwymiarowa rekonstrukcja inwazji komórkowej stworzona ze stosu obrazów konfokalnych serii Z, widziana z boku. Przedrukowano z referencji ¹⁰. C) Trójwymiarowa rekonstrukcja komórek znakowanych GFP i RFP inwadujących Matrigel, widziana z boku. D) Przekrój optyczny przez trójwymiarową rekonstrukcję komórek znakowanych GFP i RFP. Przedrukowano z referencji ¹⁰.

Dyskusja

Testy inwazji na Matrigelu tradycyjnie przeprowadzano poprzez umieszczenie komórek na warstwie białek macierzy zewnątrzkomórkowej, gdzie motywność indukowana chemoatraktantem kierowała je w stronę filtra znajdującego się na dnie i przez niego. Stopień inwazyjności oceniano na podstawie liczby komórek policzonych na spodniej stronie filtra. Choć w praktyce różnica w porównaniu z opisanym powyżej „odwróconym” testem inwazji jest niewielka, wizualizacja komórek inwazyjnych podczas ich przemieszczania się w górę i przez Matr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM (podłoże Eagle modyfikowane przez Dulbecco’’)	GIBCO, by Life Technologies	21969
Płodowa surowica bydlęca	PAA Laboratories	A15-101
Penicylina-streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140
200 mM L-glutamina (100x)	GIBCO, by Life Technologies	25050-032
Puromycyna	Sigma-Aldrich	P8833
0.05% trypsyna EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25300
Polybrene	Sigma-Aldrich	AL-118
Odczynnik Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Transwell 6.5mm, rozmiar porów 8.0 μm	Corning	3422
Complete Matrigel	BD Biosciences	354234
Calcein AM	Invitrogen	C1430
RNaza	Qiagen	19101
Jodek propidyny	Sigma-Aldrich	P4864
Mikroskop konfokalny	Leica Microsystems	SP2MP