Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Podsumowanie

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Streszczenie

Kluczową cechą złośliwości nowotworu jest inwazja i przerzutowanie ¹W niektórych nowotworach (np.gglejak ²), miejscowa inwazja do otaczających zdrowych tkanek jest główną przyczyną choroby i zgonu. W przypadku innych nowotworów (np.gpierś, płuco, itp..), to proces przerzutowania, w którym komórki nowotworowe przemieszczają się z pierwotnej masy guza, kolonizują odległe miejsca i ostatecznie przyczyniają się do niewydolności narządów, co w konsekwencji prowadzi do zachorowalności i śmiertelności ³Szacuje się, że inwazja i przerzuty odpowiadają za 90% zgonów z powodu nowotworów. ⁴W rezultacie pojawiło się ogromne zainteresowanie identyfikacją procesów molekularnych oraz kluczowych białkowych mediatorów inwazji i przerzutowania w celu usprawnienia diagnostyki i leczenia. ⁵.

Wyzwaniem dla naukowców zajmujących się nowotworami jest opracowanie testów inwazji, które w wystarczającym stopniu przypominają sytuację in vivo, aby umożliwić dokładne modelowanie choroby ⁶. Dwuwymiarowe testy motywności komórek dostarczają informacji tylko o jednym aspekcie inwazji i nie uwzględniają przebudowy białek macierzy pozakomórkowej (ECM), która również jest kluczowym elementem. Niedawne badania doprecyzowały naszą wiedzę na temat inwazji komórek nowotworowych i wykazały, że poszczególne komórki mogą przemieszczać się w trybie wydłużonym lub zaokrąglonym ⁷. Ponadto większą wagę przywiązano do roli inwazji zbiorczej, w której komórki naciekają w postaci pasm, płatów i skupisk, szczególnie w nowotworach wysoko zróżnicowanych, zachowujących cechy nabłonkowe, w rozprzestrzenianiu się raka ⁸.

Przedstawiamy udoskonaloną metodę ⁹ badania wpływu białek kandydackich na inwazję zbiorczą ¹⁰. W szczególności, poprzez zaprojektowanie oddzielnych pul komórek eksprymujących różne białka fluorescencyjne, możliwe jest molekularne rozdzielenie aktywności i białek wymaganych w komórkach prowadzących w porównaniu z tymi wymaganymi w komórkach podążających. Zastosowanie RNAi dostarcza narzędzi molekularnych do eksperymentalnego rozbicia procesów zaangażowanych w inwazję pojedynczych komórek, jak również w różnych pozycjach inwazji zbiorczej. W tej procedurze mieszaniny komórek znakowanych fluorescencyjnie wysiewa się na dno wkładki Transwell, którą wcześniej wypełniono białkiem ECM Matrigel, a następnie pozwala się im na inwazję „w górę” przez filtr do wnętrza Matrigelu. Rekonstrukcja stosów obrazów z serii z, uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego, w reprezentacje trójwymiarowe pozwala na wizualizację zbiorczo inwadujących pasm oraz analizę rozmieszczenia komórek znakowanych fluorescencyjnie w pozycjach prowadzących w stosunku do podążających.

Protokół

1. Retrowirusowe znakowanie komórek białkami fluorescencyjnymi

1. wysiać komórki do pakowania retrowirusów (np. Phoenix) przy 0,25 x 10⁶ liczba komórek na dołek w płytce 6-dołkowej szalkę z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS)/DMEM.
2. Po 48 godzinach przeprowadzić transfekcję komórek retrowirusowym DNA przy użyciu Effectene zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Po 24 godzinach przepłukać dołki dwukrotnie pożywką, a następnie dodać 1,5 ml 10% FBS/DMEM do każdego dołka.
4. Zapakowany wirus w pożywce do hodowli tkankowych należy zebrać po 48 godzinach, pipetując go i przenosząc do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml.
5. Wirować przy 1600 obr./min przez 5 min w celu osadzenia komórek.
6. Przenieść supernatant do czystej probówki i przechowywać w temperaturze -80°C.
7. Komórki przeznaczone do transdukcji retrowirusowej wysiewa się w zagęszczeniu 1,5 x 10⁵ komórek na dołek w płytce 6-dołkowej i umieszczone w inkubatorze z nawilżaniem przy 37°C przez noc.
8. Następnego dnia usunąć medium z komórek i dodać 1 ml zapasu wirusa uzupełnionego o 4 μl polybrene (2 mg/mL) do każdej dołki. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze.
9. Po inkubacji trwającej 5–6 godzin do każdej studzienki należy dodać 2 ml 10% FBS/DMEM, a następnie ponownie umieścić płytki w 37°C inkubować przez noc.
10. Następnego dnia wymienić pożywkę i odczekać 24 godziny przed dodaniem odpowiedniej pożywki selekcyjnej.
11. Po osiągnięciu konfluencji (co zależy od szybkości wzrostu komórek oraz wydajności transdukcji retrowirusowej, lecz zazwyczaj trwa od 4 do 14 dni), należy poddać komórki trypsynizacji, a następnie przeprowadzić sortowanie pod kątem fluorescencji, wykorzystując komórki nietransdukowane jako punkt odniesienia; zebrać i połączyć komórki wykazujące fluorescencję wyższą niż komórki nietransdukowane, a następnie zamrozić aliquoty w temperaturze -80° C do przyszłego użytku.

2. Odwrócony test inwazji w Matrigelu

1. Powoli rozmroź na lodzie alikwot kompletnego Matrigelu (tzn. zawierającego czynniki wzrostu) (Rycina 1A).
2. Po rozmrożeniu rozcieńczyć Matrigel w stosunku 1:1 w schłodzonym w lodzie PBS (dodając wszelkie pozostałe odczynniki w stężeniu 2x do PBS przed rozcieńczeniem; Rysunek 1B). Aby ułatwić manipulowanie Matrigelem przed polimeryzacją, wszystkie elementy plastikowe (np. końcówki, probówki itp.) powinny być schłodzone w lodzie.
3. Wstaw do dołków płytki hodowlanej o 24 dołkach odpowiednią liczbę niepowlekanych Transwelli o średnicy 6,5 mm i rozmiarze porów 8 μm, a następnie ostrożnie nanieś pipetą 100 μl rozcieńczonego Matrigelu do dołków i pozostawić do inkubacji przez około 30 min w temperaturze 37°C aby stężało (Rycina 1C).
4. W tym czasie należy przygotować jedną lub więcej zawiesin komórek znakowanych fluorescencyjnie o stężeniu od 1 do 4 x 10⁵ komórek na ml, w zależności od linii komórkowej, dla każdego warunku wstępnego traktowania (np.g. siRNA, traktowanie lekiem) w ich standardowej pożywce wzrostowej (Rycina 1D).
5. Po zestaleniu Matrigelu należy odwrócić wkładki Transwell i nanieść pipetą 100 μl zawiesiny komórkowej na skierowaną ku górze dolną stronę filtra (Rysunek 1E).
6. Ostrożnie przykryj Transwelle dnem płytki hodowlaną do 24 dołków, tak aby zetknęła się ona z każdą kropelką zawiesiny komórkowej (Rycina 1F).
7. Inkubuj płytkę w pozycji odwróconej przez 4 godziny, aby umożliwić adhezję komórek (Rycina 1G).
8. Po upływie tego czasu odwróć płytki i przemyj każdy Transwell, zanurzając go sekwencyjnie dwukrotnie w 1 ml pożywki bezsurowiczej (Rysunek 2A).
9. Pozostaw Transwell-e w trzecim dołku zawierającym wszelkie wymagane leki lub substancje terapeutyczne (Ryc. 2B).
10. Ostrożnie nanieś pipetą 100 μl z 10% FBS/DMEM z dodatkiem chemoatraktanta (np.g. EGF w stężeniu 25 ng/ml) do wkładki Transwell na zastygłą mieszaninę Matrigelu i PBS, zamknąć pokrywkę i inkubować przez 3–5 dni w temperaturze 37°C z dodatkiem 5% CO₂ (Ryc. 2C).

3. Barwienie i wizualizacja

1. Komórki wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych mogą pominąć poniższe kroki przed wykonaniem mikroskopii konfokalnej.
2. W celu obrazowania komórek niefluorescencyjnych naciekających Matrigel, należy umieścić Transwelle w nowych płytkach 24-dołkowych i nanieść pipetą 1 ml roztworu barwiącego Calcein AM o stężeniu 4 μM na wierzch każdego wkładu Matrigel, pozwalając barwnikowi spłynąć po bokach i zabarwić próbkę od góry i od dołu. Calcein AM (estry acetoksymetylowe kalceiny) jest barwnikiem do żywych komórek, który barwi całe komórki na zielono i nie wymaga fiksacji.
3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO₂; po tym czasie komórki są w pełni zabarwione i gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.
4. Alternatywnie, komórki niefluorescencyjne naciekające Matrigel mogą zostać ufiksowane i zabarwione zgodnie z opisem w punktach 3.5–3.9 poniżej.
5. Przenieść każdy Transwell do nowej płytki 24-dołkowej. Przykryć 1 ml roztworu 4% paraformaldehydu/0,2% Triton-X 100.
6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 0,5 godziny.
7. Usunąć utrwalacz i przemyć 3 razy 1 ml PBS.
8. Usunąć RNA cytoplazmatyczne poprzez 30-minutową obróbkę RNazą w stężeniu 100 μg/ml. Przemyć 2 razy PBS.
9. W celu wizualizacji dodać 0,01 mg/ml jodku propidyny (PI) rozcieńczonego w PBS i pozostawić w temperaturze pokojowej w ciemności przez 0,5 godziny. Przemyć 3 razy PBS. Na tym etapie zabarwione PI transwelle można przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności przez co najmniej 1 miesiąc.
10. Dokładne metody obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej zależą od dostępnych zasobów. Używając odwróconego mikroskopu konfokalnego, należy umieścić Transwell z niewielką ilością pozostałego PBS na dużym szkiełku nakrywkowym (upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza) nad nieimersyjnym obiektywem 20 X i rejestrować przekroje optyczne co 10-15 μm od dna wkładu matrigelu. Pojedyncze przekroje optyczne mogą służyć do ilościowego określenia zakresu naciekania (Rysunek 3A) lub do budowy obiektów trójwymiarowych przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, takiego jak Volocity (Rysunek 3B).

4. Reprezentatywne wyniki

Przykład serii Z przekrojów optycznych przedstawiono na rysunku 3A. W tym przypadku komórki zabarwiono Calcein AM i można zauważyć, że liczba komórek naciekających w górę z filtra maleje wraz z odległością. Ilościową ocenę inwazji można przeprowadzić, analizując stosunek pikseli pozytywnych dla Calcein AM do pikseli negatywnych w każdym interwale, lub stosując opisaną powyżej metodę fiksacji i barwienia oraz licząc jądra pozytywne dla PI w każdej pozycji. Jedną z zalet barwienia Calcein AM jest możliwość stworzenia trójwymiarowych rekonstrukcji inwazji komórkowej przy użyciu oprogramowania takiego jak Volocity, co pozwala na wizualne przedstawienie sposobu inwazji (rysunek 3B). Jeśli komórki są znakowane ekspresją białek fluorescencyjnych, pozycje komórek każdego koloru można zwizualizować w rekonstrukcjach 3D, oglądając je z boku (rysunek 3C) lub wykonując przekroje przez rekonstrukcję (rysunek 3D).

Rysunek 1. Schematyczny rysunek etapów przygotowania testu odwrotnej inwazji. A) Matrigel ECM rozmrożony na lodzie. B) Matrigel rozcieńczony w stosunku 1:1 z PBS zawierającym leki w dwukrotnym stężeniu końcowym. C) Wkładki Transwell umieszczone w płytkach wielodołkowych, a następnie do każdej z nich naniesiono Matrigel za pomocą pipety. D) Przygotowanie zawiesiny komórkowej o pożądanym stężeniu. E) Po zastygnięciu Matrigelu płytka zostaje odwrócona i wyjęta, a komórki są wysiewane na dolną stronę filtra wkładki Transwell. F) W pozycji odwróconej płytka wielodołkowa zostaje ostrożnie umieszczona nad wkładkami Transwell, zapewniając kontakt z zawiesiną komórkową. G) Komórkom pozostawiono 4 godziny na przywieranie do filtra.

Rysunek 2. Kontynuacja schematu blokowego testu odwrotnej inwazji. A) Po adhezji komórek należy dwukrotnie zanurzyć każdy Transwell w pożywce bez surowicy, aby usunąć luźne komórki. B) Przemyty Transwell należy umieścić w docelowej studzience zawierającej pożywkę oraz ewentualne substancje testowe. C) Pożywkę zawierającą chemoatraktant (np. 10% fetal bovine serum) wraz z ewentualnymi substancjami testowymi należy ostrożnie nanieść warstwą na Matrigel.

Rysunek 3. Reprezentatywne obrazy wyników testu inwazji odwrotnej. A) Sekcje optyczne komórek barwionych Calcein AM naciekających Matrigel, wykonane w odstępach 15 μm za pomocą mikroskopii konfokalnej. B) Rekonstrukcja trójwymiarowa inwazji komórek z serii obrazów konfokalnych Z, widziana z boku. Przedruk z referencji ¹⁰. C) Rekonstrukcja trójwymiarowa komórek znakowanych GFP i RFP naciekających Matrigel, widziana z boku. D) Przekrój optyczny przez rekonstrukcję trójwymiarową komórek znakowanych GFP i RFP. Przedruk z referencji ¹⁰.

Dyskusja

Testy inwazji na Matrigelu tradycyjnie przeprowadzano poprzez umieszczenie komórek na warstwie białek macierzy zewnątrzkomórkowej, gdzie motywność indukowana chemoatraktantem kierowała je w stronę filtra znajdującego się na dnie i przez niego. Stopień inwazyjności oceniano na podstawie liczby komórek policzonych na spodniej stronie filtra. Choć w praktyce różnica w porównaniu z opisanym powyżej „odwróconym” testem inwazji jest niewielka, wizualizacja komórek inwazyjnych podczas ich przemieszczania się w górę i przez Matr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM (podłoże Eagle modyfikowane przez Dulbecco’’)	GIBCO, by Life Technologies	21969
Płodowa surowica bydlęca	PAA Laboratories	A15-101
Penicylina-streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140
200 mM L-glutamina (100x)	GIBCO, by Life Technologies	25050-032
Puromycyna	Sigma-Aldrich	P8833
0.05% trypsyna EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25300
Polybrene	Sigma-Aldrich	AL-118
Odczynnik Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Transwell 6.5mm, rozmiar porów 8.0 μm	Corning	3422
Complete Matrigel	BD Biosciences	354234
Calcein AM	Invitrogen	C1430
RNaza	Qiagen	19101
Jodek propidyny	Sigma-Aldrich	P4864
Mikroskop konfokalny	Leica Microsystems	SP2MP