Optymalizacja eksperymentalnego modelu chomika w leiszmaniozie skórnej poprzez wstrzyknięcie promastigot Leishmania do skóry grzbietu. Podejście to jest przydatne podczas inokulacji, obserwacji, charakteryzacji zmian, stosowania leczenia oraz pobierania próbek klinicznych. Zachowane zostają zdolność poruszania się, poszukiwanie pokarmu i wody, zabawa oraz aktywności społeczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Leiszmanioza skóry na grzbietowej skórze chomików: użyteczny model do przesiewowych badań leków przeciwleiszmanialnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tradycyjnie chomiki są eksperymentalnie inokulowane w okolicy nosa lub na poduszeczkach stóp. Jednak w tych miejscach nie zawsze powstaje owrzodzenie, pomiar wielkości zmiany jest trudną procedurą, a zwierzęta mają trudności z jedzeniem, oddychaniem i poruszaniem się z powodu lokalizacji zmian. W celu optymalizacji modelu chomika w przypadku skórnej leiszmaniozy, młodym dorosłym samcom i samicom chomików syryjskich (Mesocricetus auratus) wstrzyknięto śródskórnie w skórę grzbietu od 1 do 1,5 x 107 promastigot gatunków Leishmania, a następnie oceniano progresję powstałych zmian przez okres do 16 tygodni po zakażeniu. Wybrano chomika syryjskiego, ponieważ jest on uważany za odpowiedni biomodel do oceny leków przeciwko Leishmania, gdyż wykazuje podatność na zakażenie różnymi gatunkami. Zakażenie skórne chomików prowadzi do powstania przewlekłych, lecz kontrolowanych zmian oraz przebiegu klinicznego z objawami podobnymi do tych obserwowanych u ludzi. Dzięki temu możliwe jest określenie zakresu zakażenia poprzez pomiar wielkości zmiany na podstawie obszaru stwardnień i owrzodzeń. Podejście to udowodniło swoją wszechstronność i łatwość prowadzenia podczas inokulacji, monitorowania i charakteryzacji typowych zmian (owrzodzeń), stosowania leczenia różnymi drogami oraz pobierania próbek klinicznych po różnych terapiach. Dzięki zastosowaniu tej metody zachowana zostaje również jakość życia zwierząt w zakresie lokomocji, poszukiwania pokarmu i wody, zabawy oraz aktywności społecznych.
Protokół
1. Zakażanie chomików
1. Zwierzęta
Użyto inbredowych samic i samców złotych chomików (Mesocricetus auratus) w wieku 6-8 tygodni, o masie 140-160 g. Są one utrzymywane w zwierzęcym zoologicum, w pomieszczeniach z kontrolowaną temperaturą, karmione standardową suchą karmą dla gryzoni i mają dostęp do wody ad libitum. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez instytucjonalną Komisję Etyczną ds. Eksperymentów na Zwierzętach. Przed eksperymentalną infekcją dermotropnymi pasożytami z rodzaju Leishmania zwierzęta są poddawane określeniu płci, znakowaniu i ważeniu zgodnie ze standardowymi procedurami. W celu określenia płci zwierzęta są badane pod kątem cech charakterystycznych, takich jak widoczność linii sutków i krótka odległość odbytniczo-płciowa u samic lub widoczność jąder i większa odległość między odbytem a naprzystępkiem u samców. Następnie zwierzęta są znakowane poprzez kolczykowanie uszu lub barwienie fragmentu skóry tamponem nasączonym kwasem pikrynowym. W przypadku perforacji ucha, po oczyszczeniu 70% alkoholem, ucho jest przebijane za pomocą dziurkacza do uszu gryzoni. Należy unikać obszarów z naczyniami krwionośnymi. Zaleca się sedację lub znieczulenie mieszanką ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (20 mg/kg) w stosunku 9:1, podaną dostrytonalnie w objętości 260-300μl za pomocą igły 25-G. Na koniec zwierzęta są ważone poprzez umieszczenie ich w pułapce lub pudełku ustawionym na wadze precyzyjnej.
2. Pasożyty
Promastigoty dermotropowych gatunków Leishmania, takich jak L. amazonensis, hoduje się w dwufazowym podłożu hodowlanym Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) w temperaturze 26°C. Do zakażania chomików wykorzystuje się promastigoty w fazie metacyklicznej (stacjonarnej) (5 dni). W skrócie: pasożyty są zbierane, dwukrotnie płukane w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), przeliczane i dostosowywane do stężenia 1 x 107 (dla samców) lub 1,5 x 107 (dla samic) pasożytów w 0,1 ml PBS w celu inokulacji odpowiednio samców lub samic, przy czym wielkość inokulum może się różnić w zależności od gatunku Leishmania (procedura nie pokazana na filmie).
3. Infekcja eksperymentalna
Przed inokulacją obszar skóry zostaje ogolony. W skrócie, znieczulone zwierzęta umieszcza się w pozycji brzusznej i za pomocą nożyczek usuwa się włosy dwa cale od nasady ogona. Po oczyszczeniu ogolonego obszaru sterylnym roztworem soli fizjologicznej inokulum pasożyta wstrzykuje się do skóry, aż do momentu powstania grudki.
4. Obserwacja kliniczna
Zwierzęta są monitorowane co 7 dni aż do 4–6 tygodni po inokulacji pod kątem pojawienia się zmian chorobowych. W skrócie, zwierzęta są unieruchamiane w pułapce, a miejsce inokulacji skóry jest poddawane palpacji. Następnie wyznacza się obszar twardzieli powstałego owrzodzenia, a szerokość i długość owrzodzenia mierzy się za pomocą cyfrowego suwmiarki.
2. Leczenie chomików
1. Podawanie związków
Harmonogram leczenia rozpoczyna się, gdy u zwierząt rozwiną się owrzodzenia (4-6 tygodni po inokulacji). Zwierzęta są dzielone na grupy po 5-6 osobników dla każdego testowanego związku. Związki mogą być podawane drogą miejscową, doustną, domięśniową lub wewnątrzlesyjną. Przed aplikacją leków chomiki są znieczulane, a obszar zmiany oczyszczany roztworem soli fizjologicznej lub PBS. W przypadku podawania związku drogą miejscową lub wewnątrzlesyjną, chomiki są unieruchamiane w pułapkach umożliwiających odsłonięcie obszaru terapeutycznego, natomiast przy podawaniu doustnym lub domięśniowym zwierzęta są bezpiecznie unieruchamiane u podstawy szyi. a) Aplikacja miejscowa: związek nanosi się na zmianę, a po kilku minutach zwierzę wraca do klatki. b) W przypadku iniekcji domięśniowej, lek (maksymalnie 200 μl) wstrzykuje się w mięśnie półścięgniste lub półbłone tylnych kończyn. c) W przypadku podawania doustnego, lek (maksymalnie 200 μl) podaje się zwierzęciu za pomocą zgłębnikoro-gastrycznej 14G połączonej z strzykawką 1 ml. d) W przypadku iniekcji wewnątrzlesyjnej, lek (maksymalnie 100 μl) wstrzykuje się stopniowo u podstawy owrzodzenia, używając igły 26G z fazą skierowaną w dół. Cały obszar zmiany jest pokrywany poprzez obrotowe przemieszczanie igły. Leczenie prowadzi się codziennie przez 10-20 dni, zgodnie z określonym schematem terapeutycznym.
2. Kontrola kliniczna
Ponieważ w tym modelu eksperymentalnym skuteczność nowych związków przeciwleiszmanialnych określa się na podstawie gojenia i bliznowacenia zmian po leczeniu, monitorowanie kliniczne każdego zwierzęcia odbywa się co tydzień od momentu zakończenia stosowania związku oraz do trzech miesięcy po nim. Podczas monitorowania opisuje się rodzaj zmiany, a stopień zgrubienia oraz obszar owrzodzenia mierzy się za pomocą cyfrowego suwmiarki. Opisuje się i rejestruje również obecność zmian w obszarach oddalonych od miejsca inokulacji, a także pojawienie się nawrotów zmian. Co dwa tygodnie zwierzęta są ważone, a zmiany są fotografowane. Zwierzęta są obserwowane codziennie w celu monitorowania: a) wyglądu fizycznego (sierść, koordynacja, temperatura, oczy, ułożenie uszu, pielęgnacja, defekacja, obecność płynu w jamie brzusznej, pobudzenie i odwodnienie) oraz b) zachowania (stan czuwania, czujność, ciekawość, uważność, pozostawanie w grupie, oczekiwanie na pokarm i wodę, trudność w chwyceniu). Miejsce aplikacji związku jest również obserwowane pod kątem obecności przekrwienia, stanu zapalnego, gryzienia i utraty włókien włosa.
Od chomików pobierano również krew w 45. dniu po zakończeniu leczenia w celu określenia wartości hematologicznych i serologicznych, które mogłyby być powiązane z toksycznością związków (patrz poniżej).
Skuteczność każdej terapii ocenia się poprzez porównanie wielkości zmian przed i po leczeniu, stosując następujący system punktowy: wyleczony (gojenie 100% obszaru i całkowite zniknięcie zmiany); poprawa kliniczna (zmniejszenie wielkości zmiany o >50% obszaru); niepowodzenie kliniczne (zwiększenie wielkości zmiany); nawrót (ponowne pojawienie się zmiany po wyleczeniu). Po zakończeniu badania zwierzęta uśpiono poprzez inhalację CO2 po uprzednim podaniu anestetyku. Po śmierci pobierane są niezbędne próbki do analizy parazytologicznej, histologicznej i serologicznej.
3. Badania parazytologiczne
Obecność Leishmania w próbkach pobranych ze skóry (zmiana lub blizna), wątroby, śledziony i nerki określa się bezpośrednio poprzez badanie rozmazów barwionych metodą Giemsy 1 oraz badanie histopatologiczne tych tkanek (patrz poniżej).
Obciążenie pasożytami w miejscu zmiany szacuje się za pomocą testu rozcieńczeń granicznych zgodnie z metodą Titusa i współpracowników (1985) 2. W skrócie, od każdego zwierzęcia pobiera się mały fragment tkanki, waży go i homogenizuje w zimnym roztworze PBS przy użyciu tłoka strzykawki. Otrzymaną zawiesinę wiruje się przy 600g przez 10 min w temperaturze 4°C. Następnie odrzuca się nadsącz, a osad resuspenduje w medium RPMI 1640 uzupełnionym o 1% antybiotyków i 10% płodowej surowicy cielęcej. Sto μl zawiesiny przenosi się do każdego z 96 dołków płytki mikrotitracyjnej zawierającej medium NNN, przykrytej 50 μl medium Schneidera i przechowywanej w temperaturze 26°C. Liczbę żywych pasożytów w każdej próbce określa się na podstawie najwyższego rozcieńczenia, przy którym wykryto promastigoty podczas badania pod mikroskopem odwróconym, przeprowadzanego co tydzień przez miesiąc.
4. Badanie histopatologiczne zmiany skórnej (lub blizny) oraz innych tkanek
Trzeci fragment materiału z biopsji pobrany ze skóry, wątroby i nerki jest utrwalany w 10% formalinie i zatapiany w parafinie. Można również przetworzyć materiał śledzie z śledziony i serca. Pięciomikronowe skrawki utrwalonych tkanek barwiono hematoksyliną i eosiną, a następnie badano pod mikroskopem optycznym przy powiększeniach 200X, 400X lub 1000X z zastosowaniem imersji olejowej, aby ocenić mikroarchitekturę, charakterystykę nacieków komórkowych oraz obecność lub brak pasożytów. Wykonano mikrofotografie i zarejestrowano obrazy cyfrowe.
5. Ocena toksyczności terapii
Toksyczność związku ocenia się na podstawie stanu fizycznego i behawioralnego zwierząt, zgodnie z parametrami monitorowanymi podczas obserwacji klinicznych (patrz wyżej). Toksyczność określa się również na podstawie parametrów hematologicznych i metabolicznych w próbkach krwi oraz zmian histopatologicznych zaobserwowanych w przekrojach tkanek barwionych hematoksyliną i eozyną, zgodnie z opisem powyżej.
Próbki krwi pobiera się z serca, najlepiej z komory. Do badań hematologicznych krew przenosi się do probówek z antykoagulantem EDTA i przetwarza zgodnie ze standardowymi protokołami oznaczania morfologii krwi. Do badań serologicznych krew przenosi się do probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml i wiruje w celu uzyskania surowicy do analizy metabolicznej poziomu kreatyniny, ALT oraz BUN, mierzonej za pomocą analizatora chemicznego Kodak Ektachemdry 3.
6. Analiza danych
Dane z organizmów leczonych i nieleczonych porównuje się za pomocą testu ANOVA. Poziom istotności ustalono na p < 0.05.
3. Reprezentatywne wyniki
Podsumowanie
Udoskonalecono chomży model leiszmaniozy skórnej w celu wykorzystania go do oceny skuteczności leków. Badano rozwój zmian oraz parametry parazytologiczne po pierwotnej infekcji skóry właściwej chomąży. Inbredowe samice i samce złotych chomąży (Mesocricetus auratus) w wieku 6–8 tygodni otrzymali do skóry w zastrzyku 1 x 107 (samce) lub 1,5 x 107 (samice) metacyklicznych (faza stacjonarna) promastigot L. amazonensis. Guzki pojawiły się 20–35 dni po infekcji, a owrzodzenia powstały po 4–6 tygodniach po infekcji. Po ustanowieniu infekcji oceniono skuteczność antymonu pięciowartościowego (SbV) w dwóch dawkach. Chomąży losowo przydzielono do trzech grup po 5 zwierząt w każdej i leczono antymonianem megluminy w dawkach 80 lub 120 mg SbV/kg codziennie przez 10 dni drogą domięśniową. Trzecia grupa otrzymała domięśniowo PBS jako placebo. Grupa trzech zwierząt nie była leczona i służyła jako kontrola negatywna. Reakcję na każde leczenie monitorowano przez 3 miesiące po zakończeniu okresu terapeutycznego.
1. Przebieg kliniczny po zakażeniu złotego chomika (Mesocricetus auratus) L. amazonensis
Chomiki zakażone w skórze grzbietowej konsekwentnie wykazują klinicznie widoczne owrzodzenie naskórka w 4–6 tygodniu po zakażeniu. Zmiany zaczynają się od małych guzków, a kończą na owrzodzeniach, które zwiększają swój rozmiar wraz z czasem po zakażeniu i osiągają wielkość uznaną za optymalną do oceny działania leków eksperymentalnych w czwartym do szóstego tygodnia po zakażeniu (18,99 do 54,7 mm2 w 4. tygodniu oraz 35,55 do 92,71 mm2 w 6. tygodniu) (Ryciny 1, 2). W zmianach tych utrzymywało się wyraźne owrzodzenie do 20. tygodnia po zakażeniu, kiedy to zakończono eksperymenty (Rycina 1).
Zakażenie L. amazonensis nie wpłynęło na masę ciała chomików, która wynosiła odpowiednio od 104,9 do 124,69 gr u zwierząt niezakażonych oraz od 129,71 do 134,02 gr u zwierząt zakażonych (p > 0,05, Anova). Podczas badania zwierzęta uzyskały średnią przyrostkę masy ciała na poziomie 25,58 ± 5,98 %. Stężenia kreatyniny iy aminotransferazy alaninowej (ALT) w surowicy oraz parametry morfologii krwi były zbliżone do wartości referencyjnych u chomików niezakażonych i zakażonych Leishmania. Jedynie poziom azotem mocznika we krwi (BUN) był podwyższony u 60% zakażonych zwierząt.
Analiza histopatologiczna zmian u chomików zakażonych L. amazonensis wykazała różnice w stosunku do zwierząt niezakażonych. W ogóle biopsje skóry z chomików niezakażonych nie wykazują reakcji zapalnej ani żadnych zmian histologicznych (Rysunek 3a), podczas gdy u tych zakażonych L. amazonensis rozwija się ziarniniakowe zapalenie skóry oraz występuje obfita obecność makrofagów naciekających skórę właściwą (Rysunek 3b). Analiza histopatologiczna tkanek chomików zakażonych L. amazonensis i leczonych antimoniatem megluminy w dawkach 80 i 120 mg SbV/kg/dobę przez 10 dni wykazała zmiany związane z procesem infekcji podobne do tych obserwowanych w grupie kontrolnej (zakażonej i nieleczonej). Ogólnie próbki skóry chomików wykazały niewielki poziom plazmocytów (20%) i granulocytów PMN (80%) wraz z umiarkowanym naciekiem limfocytów (80%) oraz łagodnym (20%) lub silnym (80%) naciekiem makrofagów (Tabela 2). Obserwacje te odpowiadają diagnozie ziarniniakowego zapalenia skóry, czyli zdarzeniu zapalnemu, które obejmuje skórę właściwą i leżący pod nią mięsień. Jest to główna zmiana związana z infekcją, co jest zgodne z ciężkim przebiegiem skórnej lejszmaniozy u wszystkich zwierząt w badaniu. Powiązanie to zostało skorelowane statystycznie za pomocą testu chi-kwadrat Pearsona, który dał wynik p < 0,05. Próbki nerek u 60-100% zwierząt wykazały umiarkowaną hiperplazję w korze nerkowej i kłębuszkach, którym towarzyszył lekki zanik nerek u 75% zwierząt. Obserwacje te są zgodne z błoniaste proliferacyjnym kłębuszkowo-cewkowym zapaleniem nerek, diagnozą, która była wcześniej wiązana z zakażeniem innymi gatunkami Leishmania. Związek statystyczny był istotny przy chi-kwadracie Pearsona p < 0,05. Wątroby 40-100% zwierząt we wszystkich grupach wykazały lekkie zmiany wakuolarne w hepatocytach, co może być związane z procesami fizjologicznymi, takimi jak hepatocytarna akumulacja glikogenu. Inne nieprawidłowości w tkance wątroby, takie jak degeneracja tłuszczowa, włóknienie i przekrwienie, odpowiadają procesowi infekcyjnemu. Inne obserwacje, takie jak zmiany wakuolarne w hepatocytach, kardiomegalie, obecność wewnątrzcytoplazmatycznych inkluzji eozynofilnych, a także wakuolizacja komórek w cewkach nerkowych, nie są statystycznie powiązane (p > 0,05) z toksycznym działaniem badanego związku i prawdopodobnie wynikają z procesów fizjologicznych u chomików.
2. Skuteczność terapeutyczna antimonianu megluminy w modelu chomika
Fenotyp kliniczny zainfekowanych chomątek w różnych punktach czasowych po leczeniu podsumowano w Tabeli 1. Leczenie domięśniowe antymoniatem megluminy w dawce 120 mg SbV/kg/dobę przez 10 dni było wysoce skuteczne, indukując całkowity zanik zmian wywołanych przez L. amazonensis u wszystkich zwierząt (Rysunek 4). Odsetek wyleczeń wyniósł 100 % w okresie od 2 do 8 tygodni po zakończeniu terapii. Jednak po trzech miesiącach u 20% chomątek zaobserwowano nawrót zmian. Gdy antymoniat megluminy podawano w dawce 80 mg SbV/kg masy ciała, całkowite wyleczenie zaobserwowano tylko u 3 zwierząt. U dwóch pozostałych zwierząt wielkość zmiany zmniejszyła się odpowiednio o 33,9 i 69,0% (Rysunek 5). Po trzech miesiącach L. amazonensis nadal występował w skórze wszystkich zwierząt leczonych antymoniatem megluminy w dawce 80 mg SbV/kg/dobę oraz u jednego z zwierząt leczonych dawką 120 mg SbV/kg/dobę antymoniatu megluminy. Ustalono, że dawką leczniczą jest 120 mg SbV/kg/dobę podawane domięśniowo przez 10 dni.
Stosując test rozcieńczeń ograniczających, oszacowana liczba pasożytów wykazała istotną redukcję w grupie leczonej antimoniatem megluminy w porównaniu z grupą kontrolną ujemną (nieleczoną) oraz grupą otrzymującą nośnik (placebo) (p < 0.001). Żywe pasożyty (od 0,4 do 1,6 pasożyta na mg tkanki skóry) wykryto w miejscu zmiany u zwierząt nieleczonych oraz tych leczonych PBS. Pasożyty wyizolowano wyłącznie od zwierząt, które nie zareagowały na leczenie antimoniatem megluminy: od jednego zwierzęcia leczonego dawką 120 mg/kg/day (Rysunek 5b) oraz dwóch chomików leczonych dawką 80 mg/kg/day (Rysunek 5c). Nie zaobserwowano różnic w obciążeniu pasożytami u chomików, u których nie nastąpiło wyleczenie po otrzymaniu antymonianu megluminy, w porównaniu do zwierząt nieleczonych lub leczonych PBS.
W badaniu histopatologicznym biopsji skóry chomiątek leczonych domięśniowo antimoniatem megluminy w dawce 120 mg SbV/kg/dobę nie zaobserwowano pasożytów; widoczne są nieliczne makrofagi i limfocyty naciekające skórę właściwą (Rycina 6a, 6b). Przeciwnie, u chomiątek leczonych antimoniatem megluminy w dawce 80 mg SbV/kg/dobę zaobserwowano zapalne zmiany ziarniniakowe skóry z obfitą obecnością makrofagów szeroko naciekających skórę właściwą (Rycina 6c, 6d).
3. Toksyczność
Stosując ten sam schemat terapeutyczny co w badaniu skuteczności, oceniono toksyczność antimoniatu megluminy w dawkach 80 i 120 mg SbV/kg masy ciała. Ogólny stan zdrowia oraz masę ciała monitorowano do 3 miesięcy po ostatnim podaniu dawki. Leczenie nie wpłynęło na masę ciała chomików, która wynosiła odpowiednio od 104,9 do 124,69 gr u osobników niezarażonych oraz od 129,71 do 134,02 gr u osobników zarażonych. Zwierzęta zyskały średnio 27,59 ± 4,22 % masy ciała podczas leczenia oraz 28,74 ± 2,26 % w okresie obserwacji (p > 0,05, Anova). W żadnej z grup leczonych nie zaobserwowano spadku masy ciała (Dane nie pokazano). Surowicze stężenia kreatyniny i aminotransferazy alaninowej (ALT) oraz parametry morfologii krwi były zbliżone do wartości referencyjnych u chomików nieleczonych i leczonych antimoniatem megluminy. Jedynie poziom azotu mocznikowego we krwi (BUN) był podwyższony u 20% leczonych zwierząt.
Analiza histopatologiczna tkanek chomiąków zainfekowanych L. amazonensis i leczonych antimoniatem megluminy w dawkach 80 i 120 mg SbV/kg/dobę przez 10 dni nie wykazała zmian związanych z toksycznością leku.
aBufor fosforanowo-solny, bDni po leczeniu.
Tabela 1. Fenotyp kliniczny chomątek zainfekowanych eksperymentalnie L. amazonensis po leczeniu antymoniatem megluminy.
Skuteczność każdej metody leczenia oceniano poprzez porównanie wielkości zmian przed i po zabiegach, stosując następujący system punktacji: wyleczenie (gojenie 100% powierzchni i całkowite ustąpienie zmiany); poprawa kliniczna (zmniejszenie wielkości zmiany o > 50% powierzchni); niepowodzenie kliniczne (zwiększenie wielkości zmiany); nawrót (ponowna aktywacja zmiany po wyleczeniu).
A: brak objawów; NA: nie dotyczy; m: łagodne; M: umiarkowane; S: ciężkie; PMN: neutrofile wielorodakowe; NSL: brak istotnych zmian; GDM: ziarniniaki mięśnia i skóry; PGD: zapalenie skóry ropno-ziarniniakowe. 1. limfangiektazja; 2. materiał przypominający minerały.
Tabela 2. Histopatologia skóry chomiątek eksperymentalnie zakażonych L. amazonensis i leczonych antymoniatem megluminy.
Rycina 1. Przebieg rozwoju zmian skórnych po zakażeniu chomików inokulowanych śródskórnie 1-1,5 x 107 metacyklicznych (fazy stacjonarnej) promastigot L. amazonensis w ciągu 20 tygodni. Oś y przedstawia powierzchnię owrzodzenia w mm.
Rysunek 2. Dokumentacja fotograficzna rozwoju zmiany owrzodziałej na skórze grzbietu chomika złotego po wewnątrzskórnym wstrzyknięciu 10 x 107 w 2. tygodniu (a), 4. tygodniu (b) i 6. tygodniu (c).
Rysunek 3. Biopsja skóry z (a) chomika niezinfekowanego i nieleczonego: nie obserwuje się reakcji zapalnej ani istotnych zmian histologicznych; (b) chomika zinfekowanego i nieleczonego: zapalenie skóry o charakterze ziarniniakowym z obecnością wielojądrowych komórek olbrzymich (strzałka i gwiazdka), licznymi pasożytami (czarne strzałki) oraz makrofagami (białe strzałki) infiltrującymi skórę właściwą. Barwienie hematoksyliną i eozyną, powiększenie 400x.
Rysunek 4. Dokumentacja fotograficzna odpowiedzi klinicznej chomików zakażonych L. amazonensis i leczonych domięśniowo glukonianem antymonu w dawce 120 mg SbV/kg/dobę przez 10 dni. Zdjęcia przedstawiają wygląd zmiany przed leczeniem (a), po zakończeniu leczenia (dzień 10) (b) oraz podczas obserwacji: w 30. dniu (c), 60. dniu (d) i 90. dniu (e) po leczeniu.
Rycina 5. Skuteczność antimonianu megluminy w leczeniu skórnej lejszmaniozy u chomików. Chomiki syryjskie zostały zainfekowane L. amazonensis w skórze grzbietu. Po 6 tygodniach od zakażenia pozostały nieleczone (a) lub były leczone domięśniowo przez dziesięć dni samym PBS (b), antymonianem megluminy w dawce 120 mg SbV/kg/day (c) lub 80 mg SbV/kg/day (d). Wykresy przedstawiają procentowy spadek wielkości zmiany w dniu zakończenia leczenia (dzień 0) oraz w 15, 30, 60 i 90 dniu obserwacji po zakończeniu leczenia. p < 0.001 dla dawek 120 lub 80 mg SbV/kg/day w porównaniu z grupą otrzymującą nośnik oraz grupą nieleczoną.
Rysunek 6. Biopsja skóry chomików zainfekowanych i leczonych domięśniowo antymoniatem meguminy w dawkach 120 mg SbV/kg/dzień (a, b) oraz 80 mg SbV/kg/dzień (c, d). Obecność nielicznych makrofagów i limfocytów infiltrujących skórę właściwą. Nie stwierdzono obecności pasożytów. Barwienie hematoksyliną i eozyną, powiększenie 200x (a), 1000x (c). Wzrostowe zapalenie skóry z licznymi makrofagami szeroko infiltrującymi skórę właściwą (c); makrofagi pianowate z fagocytowanymi pasożytami. Barwienie hematoksyliną i eozyną, powiększenie 200x (b), 1000x (d).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Leiszmanioza skórna jest endemiczna w tropikach i neotropikach. Często określa się ją mianem grupy chorób ze względu na zróżnicowane spektrum objawów klinicznych, które obejmują zarówno niewielkie guzki skórne, jak i rozległe zniszczenia tkanek śluzowych. Większość dostępnych leków jest kosztowna, wymaga długotrwałych schematów leczenia i staje się coraz mniej skuteczna, co sprawia, że konieczne jest odkrycie nowych środków terapeutycznych.
Model mysi jest szeroko stosowany, lecz posiada pewne...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badanie to zostało sfinansowane z grantów przyznanych przez Komitet Badawczy Uniwersytetu Antioquia (CODI), Kolumbijski Instytut Rozwoju Nauki i Technologii – COLCIENCIAS oraz Centrum Rozwoju Produktów przeciwko Chorobom Tropikalnym - CIDEPRO.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Ketamina | Odczynnik | Holliday –Scott S.A | ||
| Ksylazyna | Odczynnik | Synteza | ||
| PBS | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 14190-136 | |
| Suwmiarka cyfrowa | Sprzęt | Fisher Scientific | 15-077-958 | |
| Giemsa | Odczynnik | Sigma-Aldrich | GS1L-1L | |
| Formalina | Odczynnik | Nova lab | 11273 | |
| Parafina | Odczynnik | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
| Hematoksylina | Odczynnik | Nova lab | 10870103 | |
| Eozyna | Nova lab | 10870203 | ||
| chemia sucha Kodak Ektachem | Sprzęt | Kodak Ektachem | DT-60 | |
| antymonian megluminu | Odczynnik | Aventis | ||
| Mikroskopia | Sprzęt | Nikon Instruments | YS2-T |
Bibliografia
- WHO. Control of the leishmaniasis. Report of a Meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis WHO. 949, (2010).
- Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunol. 7, 545-555 (1985).
- Reynolds, K. M. The Kodak Ektachem dry layer technology for clinical chemistry. Upsala. J. Med. Sci. 91, 143-146 (1986).
- Handman, E., Ceredig, R., Mitchell, G. F. Murine cutaneous leishmaniasis: disease patterns in intact and nude mice of various genotypes and examination of some differences between normal and infected macrophages. Australian J. Exp. Biol. Med. Sci. 57, 9-29 (1979).
- Hanson, W., Chapman, W., Waits, V., Lovelace, J. Development of Leishmania (Viannia) panamensis lesions and relationship of numbers of amastigotes to lesion area antimony-treated and untreated hamsters. J. Parasitol. 77, 780-783 (1991).
- Henao, H. H., Osorio, Y., Saravia, N. G., Gómez, A., Travi, B. Efficacy and toxicity of pentavalentantimonials (Glucantime and Pentostam) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry application. Biomédica. 24, 393-402 (2004).
- Travi, B. L., Martinez, J. E., Zea, A. Antimonial treatment of hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis: assessment of parasitological cure with different therapeutic schedules. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 87, 567-569 (1993).
- Hommel, M., jaffe, C. L., Travi, B., Milon, G. Experimental models for leishmaniasis and for testing anti-leishmanial vaccines. Ann. Trop. Med. Parasitol. 89, 55-73 (1995).
- Travi, B. L., Osorio, Y., Saravia, N. G. The inflammatory response promotes cutaneous metastasis in hamsters infected with Leishmania (Viannia) panamensis. J. Parasitol. 82, 454-457 (1996).
- Travi, B. L., Osorio, Y. Failure of Albendazole as an alternative treatment of cutaneous Leishmaniasis in the hamster model. Memorias Instituto Oswaldo. 93, 515(1998).
- Travi, B. L., Osorio, Y., Melby, P. C., Chandrasekar, B., Arteaga, L., Saravia, N. G. Gender is a major determinant of the clinical evolution and immune response in hamsters infected with Leishmania spp. Infect Immun. 70, 2288-2296 (2002).
- Osorio, Y., Melby, P. C., Pirmez, C., Chandrasekar, B., Guarín, N., Travi, B. L. The site of cutaneous infection influences the immunological response and clinical outcome of hamsters infected with Leishmania panamensis. Parasite Immunol. 25, 139-148 (2003).
- Osorio, Y., Bonilla, D. L., Peniche, A. G., Melby, P. C., Travi, B. L. Pregnancy enhances the innate immune response in experimental cutaneous leishmaniasis through hormone-modulated nitric oxide production. J. Leukoc. Biol. 83, 1413-1422 (2008).
- Espitia, C. M., Zhao, W., Saldarriaga, O., Osorio, Y., Harrison, L. M., Cappello, M., Travi, B. L., Melby, P. C. Duplex real-time reverse transcriptase PCR to determine cytokine mRNA expression in a hamster model of New World cutaneous leishmaniasis. BMC Immunol. 22, 11-31 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
