Artykuł metodologiczny

Dymorfizm płciowy mięśni szkieletowych w ujęciu proteomicznym

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3536

⸱

14 grudnia 2011

 ,  ,  , 
1Center for Proteomics, Smith College, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Chemistry, Smith College, 4Department of Biological Sciences and Center for Proteomics, Smith College

W tym artykule

Podsumowanie

Prosty zestaw metod izolacji i identyfikacji najliczniej występujących białek ekspresjonowanych w mięśniach szkieletowych. Na żelu dwuwymiarowym z 10 mg mięśnia można wyróżnić około 800 plamek, co umożliwia określenie specyficznej dla płci ekspresji białek. Metody te dają porównywalne wyniki w większości tkanek.

Streszczenie

Ogólny skurcz mięśnia szkieletowego jest determinowany przede wszystkim przez stosunkowo niewielką liczbę białek kurczliwych, jednak tkanka ta jest również niezwykle podatna na czynniki środowiskowe1, takie jak hipertrofia wywołana ćwiczeniami oporowymi oraz zanik wynikający z nieużywania. Wykazuje ona zatem remodeling i adaptacje do stresorów (ciepła, niedokrwienia, metali ciężkich itp.)2,3. Uszkodzenia mięśni mogą powstać w wyniku wywierania siły podczas wydłużania mięśnia, co określa się mianem skurczu ekscentrycznego4. Białka kurczliwe mogą ulec uszkodzeniu podczas takich wysiłków i wymagają naprawy, degradacji i/lub resyntezy; funkcje te nie są domeną białek kurczliwych, lecz innych, znacznie mniej licznych białek w komórce. Aby ustalić, jaka podgrupa białek bierze udział w łagodzeniu tego typu uszkodzeń, należy opracować globalny proteom przed wysiłkiem5, a następnie monitorować go po ćwiczeniach, aby określić różnicową ekspresję białek i w ten sposób wyróżnić białka kandydackie uczestniczące w adaptacjach do uszkodzeń i ich naprawie. Ponadto większość badań nad mięśniami szkieletowymi była prowadzona na osobnikach płci męskiej, w związku z czym mogą one nie być reprezentatywne dla mięśni osobników płci żeńskiej.

W niniejszym artykule przedstawiamy metodę powtarzalnej ekstrakcji białek z mięśni samców i samic oraz ich rozdzielania za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej z następującym obrazowaniem cyfrowym o wysokiej rozdzielczości6. Zapewnia ona protokół dla plamek (i następnie zidentyfikowanych białek), które wykazują statystycznie istotny (p < 0,05) dwukrotny wzrost lub spadek, pojawiają się lub znikają w stosunku do stanu kontrolnego. Są one następnie wycinane, trawione trypsyną i rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrem mas (LC/MS) w celu identyfikacji białek (LC/MS/MS)5. Metodologia ta (Rysunek 1) może być stosowana w wielu tkankach przy niewielkich lub żadnych modyfikacjach (wątroba, mózg, serce itp.).

Protokół

1. Przygotowanie próbek

  1. Jako materiał wyjściowy należy wykorzystać świeżą, błyskawicznie zamrożoną lub utrwaloną w RNAlater tkankę mysi. Przed przystąpieniem do dalszych prac należy odsączyć nadmiar konserwantu za pomocą chusteczki Kimwipe.
  2. Należy usunąć wszystkie ścięgna i powięzi z otoczenia mięśnia, a następnie rozdrobnić tkankę za pomocą jednokrawędziowych żylet na schłodzonych szklanych płytkach w pomieszczeniu chłodniczym (4°C) przez 2 min, aż tkanka zostanie dobrze rozdrobniona lub przyjmie postać proszku. Próbkę należy zebrać do wcześniej zważonej probówki do mikrocentryfugi i określić masę tkanki. Jako materiał wyjściowy należy użyć nie więcej niż 10 mg tkanki.
  3. W temperaturze pokojowej należy dodać 45 μL buforu do ekstrakcji (8 M mocznika, 50 mM DTT, 4% CHAPS, 0,2% amfolitów nośnikowych 5/8, 0,0002% błękitu bromofenolowego) na każdy 1 mg rozdrobnionej tkanki. Jeśli objętość przekracza 350 μL, należy początkowo dodać 350 μL i przeprowadzić homogenizację (krok 1.4), a następnie dodać pozostałą część buforu, aby zminimalizować rozpryski.
  4. Tkankę należy homogenizować siedmiokrotnie za pomocą zmotoryzowanego tłuczka (Kontes Corp) przez 15 sekund w temperaturze 4°C, z dwuminutowym chłodzeniem na lodzie pomiędzy każdą homogenizacją.
  5. Próbki należy wirować przy 15 600 x g przez 30 minut w temperaturze 4°C. Należy zebrać nadsącz i zmierzyć jego objętość. Osad z debris komórkowych należy odrzucić.
  6. Białka w nadsączu należy wytrącić za pomocą lodowatego acetonu czystości odczynnikowej (stosunek objętościowy 3:1). Probówki należy wymieszać na wirówce typu vortex przez 15 sekund. Następnie wirować przy 15 600 x g przez 10 sekund w celu utworzenia osadu, a następnie resuspender w buforze do ekstrakcji za pomocą silnika Kontes i polipropylenowych prętów mieszających (BioSpec Prod).
  7. Należy powtórzyć krok 1.6.
  8. Następnie można przystąpić do szacowania stężenia białka w próbkach lub przechowywać je w temperaturze -20°C.

2. Oznaczenie stężenia białka

Należy zastosować metodę Lowry'ego7 lub metodę BCA8 (Pierce); dążyć do uzyskania stężenia około 4,5 mg ml-1.

3. Fokuszowanie izoelektryczne

  1. Wyjąć pasek IPG ReadyStrip (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad) z temperatury -20°C i pozostawić do wyrównania temperatury w RT przez 10-15 min.
  2. Wymieszać próbkę w vortexie i nanieść pipetą 600-800 μg (całkowita objętość 200 μL) próbki białka w linii prostej przy tylnej krawędzi kanału w kuwecie do rehydratacji próbek, pozostawiając około 1 cm wolnego miejsca na każdym końcu.
  3. Za pomocą pęsety zdjąć plastikową osłonkę z paska IPG – należy chwytać pasek wyłącznie za końce i unikać kontaktu z żelem. Zidentyfikować koniec zasadowy paska i umieścić go po lewej stronie kuwety. Położyć pasek IPG stroną z żelem do dołu na próbkę, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza pod spodem. Pozostawić do rehydratacji na jedną godzinę.
  4. Przykryć 2,5 mL oleju mineralnego (BioRad). Przykryć kuwetę pokrywką i pozostawić do rehydratacji przez noc w temperaturze pokojowej.
  5. Umieścić knot papierowy na obu końcach kanału kuwety do ogniskowania i zwilżyć każdy z nich 10 μL wody Millipore.
  6. Wyjąć pasek IPG i trzymać go pionowo przez około 10 sekund, aby odlać olej. Osuszyć plastikową podkładkę za pomocą chusteczki Kimwipe.
  7. Umieścić pasek IPG w kuwecie do ogniskowania stroną z żelem do dołu, z końcem zasadowym po lewej stronie. Przykryć pasek 2,5 mL oleju mineralnego.
  8. Umieścić kuwetę w komorze PROTEAN IEF (Bio-Rad) i zaprogramować 3-etapowy protokół (Tabela 1) przy domyślnej temperaturze komory 20°C, maksymalnym natężeniu prądu 50 μA/pasek oraz bez czasu rehydratacji.
     NapięcieCzasVolt-godzinyRampa
    Krok 125020 min Liniowa
    Krok 28 0002,5 h Liniowa
    Krok 38 000 40 000Szybka
    Suma 6,5 h40 000 


    Tabela 1. Trzyetapowy protokół dla komory PROTEAN IEF dla pasków IPG 11 cm.
  9. Wyjąć paski IPG z komory IEF za pomocą pęsety. Osuszyć plastikową podkładkę chusteczką Kimwipe i umieścić pasek IPG stroną z żelem do góry w czystej kuwecie do rehydratacji. Można przykryć kuwetę do rehydratacji, owinąć ją folią spożywczą i przechowywać w -80°C lub kontynuować procedurę.

4. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym SDS

  1. Przenieś pasek (stroną z żelem do góry) do 11 cm kuwety do równoważenia.
  2. Dodaj do kanału 4 mL buforu redukcyjnego (6 M mocznika, 2% SDS, 0.05 M Tris/HCl pH 8.8, 20% glicerolu, 2% DTT) i równoważ pasek przez 10 min przy łagodnym wstrząsaniu.
  3. Usuń bufor redukcyjny, dodaj 4 mL buforu alkilującego (6 M mocznika, 2% SDS, 0.05 M Tris/HCl pH 8.8, 20% glicerolu, 2.5% jodoacetamidu) i równoważ pasek przez 10 minut przy łagodnym wstrząsaniu.
  4. Opłucz pasek IPG, zanurzając go krótko w 1 X buforze do elektroforezy SDS (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0.1% SDS, pH 8.2).
  5. Połóż pasek stroną z żelem do góry na płytce tylnej 11 cm gotowego żelu poliakrylamidowego Criterion 10.5%-14% Tris-HCl SDS (Bio-Rad) i dociśnij go delikatnie, aby zapewnić pełny kontakt z żelem SDS; upewnij się, że między powierzchniami obu żeli nie pozostały pęcherzyki powietrza.
  6. Przykryj pasek IPG 1 mL roztopionego roztworu agarozy (0.5% agarozy, 25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0.1% SDS, błękit bromofenolowy) i pozostaw agarozę do zastygnięcia na 5 minut.
  7. Nanieś 5 μL markera białkowego 10-225 kDa (USB, P/N: 76740) do pojedynczej studni jako standardy masy cząsteczkowej.
  8. Przeprowadź elektroforezę żelu w buforze SDS (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0.1% SDS, pH 8.2) przy napięciu 200 V w temperaturze pokojowej lub w pomieszczeniu chłodniczym (4°C), monitorując migrację czoła barwnika błękitu bromofenolowego.
  9. Wyjmij żel z plastikowej formy i barw go przez noc, delikatnie wstrząsając w barwniku Coomassie Brilliant Blue R-250 (45.5% metanolu, 45.5% dH2O, 9.0% kwasu octowego, 0.25% Coomassie Brilliant Blue R-250).
  10. Wstrząsaj żel w roztworze do odbarwiania Destain 1 (45.5% metanolu, 45.5% dH2O, 9.0% kwasu octowego) dwukrotnie po 3 godziny, a następnie w roztworze Destain 2 (5% metanolu, 90% dH2O, 5% kwasu octowego) przez noc. Przechowuj żel w 7% kwasie octowym do czasu analizy.

5. Obrazowanie i analiza żeli

  1. Należy wykonać obrazy żeli przy użyciu oprogramowania Quantity One obsługującego system obrazowania VersaDoc (BioRad). Obszary obrazów dla wszystkich żeli w eksperymencie należy przyciąć w sposób jednolity.
  2. Przycięte obrazy należy wczytać do programu PDQuest 8.0 w celu utworzenia zestawu eksperymentalnego. Należy postępować zgodnie z kreatorem konfiguracji eksperymentu, aby zdefiniować parametry detekcji plamek oraz dopasowania plamek pomiędzy żelami. W razie potrzeby wyniki dopasowania plamek należy sprawdzić i dopracować ręcznie.
  3. Należy przeprowadzić analizę ilościową i statystyczną żeli w celu wykrycia dopasowanych plamek białek wykazujących statystycznie istotne różnice w ekspresji o wartości dwukrotnej lub wyższej pomiędzy dwiema grupami żeli. Na podstawie tych plamek zainteresowania należy utworzyć zestaw analizy, a następnie wyciąć je za pomocą wycinarki plamek EXQuest (BioRad) w celu trawienia trypsyną i identyfikacji białek metodą LC-MS.

6. Trawienie trypsynowe w żelu

W tym kroku zastosowano zmodyfikowany protokół z zestawu Pierce In-Gel Tryptic Digest Kit (#89871X, Pierce).

  1. Do wycinków żelu dodać 200 μL roztworu do odbarwiania (25 mM wodorowęglanu amonu, 50% acetonitrylu). Próbki wymieszać w wstrząsarku vortex i inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut z wytrząsaniem. Ostrożnie usunąć i odrzucić roztwór.
  2. Powtórzyć krok 6.1.
  3. Do probówek zawierających wycinki żelu dodać 30 μL świeżo przygotowanego buforu redukującego (50 mM Tris[2-karboksyetylo]fosfiny, 22,5 mM wodorowęglanu amonu) i inkubować w temperaturze 60°C przez 10 minut.
  4. Pozostawić próbki do ostygnięcia, a następnie usunąć i odrzucić bufor redukujący.
  5. Dodać 30 μL buforu alkilującego (100 mM jodoacetamidu, 20 mM wodorowęglanu amonu, przygotowanego bezpośrednio przed użyciem w probówkach owiniętych folią aluminiową). Próbki inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  6. Usunąć i odrzucić bufor alkilujący. Przemyć wycinki żelu, dodając do każdej probówki 200 μL roztworu do odbarwiania. Próbki inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut.
  7. Usunąć i odrzucić roztwór do odbarwiania i powtórzyć przemywanie.
  8. Do wycinków żelu dodać 50 μL acetonitrylu i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby uległy skurczeniu i wysuszeniu, a następnie ostrożnie usunąć acetonitryl.
  9. Powtórzyć krok 6.8 jeszcze raz. Fragmenty żelu powinny stać się białe i małe.
  10. Fragmenty żelu suszyć w koncentratorze Centrivap (Labconco, model EX1245) przez 10 minut.
  11. Napęcznieć fragmenty żelu, dodając 10 μL roztworu aktywowanej trypsyny (10 ng/μL trypsyny, 25 mM wodorowęglanu amonu). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  12. Do probówek dodać 25 μL buforu do trawienia (25 mM wodorowęglanu amonu). Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez noc z wytrząsaniem.
  13. Próbki sonikować przez 10 minut (Branson, sonikator kąpielowy model 2510) i odwirować, a następnie przenieść nadsącz do nowej probówki. Nadsącz zachować.
  14. W celu dalszej ekstrakcji peptydów dodać 10 μL 0,1% kwasu mrówkowego i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Próbki sonikować przez 10 minut, zebrać nadsącz i połączyć go z nadsączem zachowanym w kroku 6.13.

7. Mikroskalowe odsalanie ekstraktów peptydowych

  1. Usuń wodorowęglan amonu oraz pozostałe sole z ekstraktów peptydowych, korzystając z kolumienek PepClean C-18 Spin Columns (ThermoFisher) zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przeprowadź dwukrotną elucję peptydów za pomocą 20 μL 70% acetonitrylu, odparuj próbki do suchości w koncentratorze Centrivap przez 1 godzinę, a następnie zawieś ponownie peptydy w 10 μL 0,1% kwasu mrówkowego do analizy MS.

8. Identyfikacja białek za pomocą spektrometrii mas sprzężonej z HPLC

  1. Rozdziel 5 μL mieszaniny peptydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w czasie 40 minut, stosując liniowy gradient acetonitrylu 2-50% z 0,2% kwasem mrówkowym na monolitycznej kolumnie Pepswift PS-DVB (Dionex) sprzężonej ze źródłem Nanospray I i spektrometrem mas z pułapką jonową (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) przy szybkości przepływu 400 nL/min na końcówce.
  2. Wykrywaj sygnały MS1 peptydów w zakresie 400 - 1400 m/z i umożliwij izolację 3 najintensywniejszych pików jonowych do sekwencjonowania MS2 metodą CID z dynamicznym wykluczaniem.
  3. W celu identyfikacji białek przeanalizuj wyniki peptydowe poprzez przeszukiwanie referencyjnej bazy danych myszy w programie Sequest (oprogramowanie BioWorks, Thermo-Fisher Scientific) z uwzględnieniem statycznej modyfikacji alkilowanej cysteiny oraz modyfikacji dynamicznych dla fosforylacji (seryna, treonina, tyrozyna), metylacji (histydyna), utleniania (metionina), ADP-rybozylacji (arginina) oraz acetylacji N-końcowej. Zastosuj konserwatywne kryteria dopasowania (np. tolerancja peptydów ustawiona na 2 AMU i tolerancja fragmentów 1,00; białka zawierają co najmniej 2 peptydy przechodzące przez filtr Xcorr względem stanu ładunku [z=1/x=1,5, z=2/x=2,00, z=3/x=2,50, z=4/x=3,00] oraz prawdopodobieństwo p < 0,05)5 i dokonaj ręcznej inspekcji widm MS w celu pewnej identyfikacji białek.

9. Reprezentatywne wyniki:

Wyizolowano mięśnie szkieletowe (biceps brachii) od niećwiczących myszy samców i samic, a następnie rozdzielono je na mapy dwuwymiarowe5, stanowiące pierwszy poziom komparatywnego proteomu mięśni (Rycina 2). Po wizualizacji za pomocą cyfrowego obrazowania o wysokiej rozdzielczości w każdej z nich wykryto około 800 plamek białkowych. Przyjmując mapę proteomu samców jako punkt odniesienia, wyraźnie widać liczne plamki, których obfitość zmienia się w proteomie samic. Intensywność plamek jest miarą zmiany ilości białek (Rycina 3). Tożsamość plamek białkowych, których obfitość zmienia się ponad dwukrotnie (wzrost lub spadek) i które są istotne statystycznie (p < 0,05) przy n=5 myszy, określono poprzez analizę sekwencji aminokwasów z wykorzystaniem chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Wyniki te pokazują, że u samic występuje spadek obfitości enzymów metabolizmu energetycznego cukrów oraz izoform enzymu kinazy kreatynowej (CK), innego systemu dostarczania energii w mięśniach. Zarówno u ludzi, jak i u zwierząt obserwuje się wyższe poziomy CK w surowicy u samców w spoczynku oraz po wysiłku9,10, jednak poziomy CK w surowicy nie muszą korelować z zakresem uszkodzeń miofibrylarnych11,12. Ten dymorfizm płciowy w komórkowej obfitości CK w mięśniu biceps brachii u myszy jest nowym odkryciem5 i może wyjaśniać fizjologiczne różnice w poziomach CK w surowicy.

Rysunki:

figure-protocol-1
Rysunek 1. Ogólny schemat protokołu proteomiki porównawczej. Protokół jest podzielony na trzy grupy: przygotowanie próbek, analiza próbek oraz identyfikacja białek. Zakończenie każdej z tych trzech grup protokołów stanowi również odpowiedni moment na przerwę, choć najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy cały protokół jest przeprowadzany bez przerwy.

figure-protocol-2
Rycina 2. Porównanie plamek białkowych mięśnia dwugłowego ramienia samic myszy w odniesieniu do analogicznych plamek w mięśniu dwugłowym ramienia samców (zielone kółka o). Plamki, których intensywność u samic wzrosła co najmniej dwukrotnie, obramowano na czerwono (o), natomiast plamki, których intensywność spadła co najmniej dwukrotnie, obramowano na niebiesko (o).

figure-protocol-3
Rysunek 3. Analiza intensywności plamek na żelu: oś X, samice przed ćwiczeniami (kontrola, n=5); oś Y, grupa samic po pojedynczej serii w punkcie czasowym 0 h (n=5). Linia regresji: współczynnik korelacji = 0,919; nachylenie = 0,976; punkt przecięcia = -0,0293. Plamki powyżej czerwonej linii i poniżej niebieskiej linii zmieniają się ponad +/- dwukrotnie.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda proteomiki LC/MS stanowi wysoce niezawodny i powtarzalny protokół do szybkiej analizy pierwszego poziomu proteomu mięśni szkieletowych. Pozwala ona na stosunkowo sprawną analizę porównawczą specyfiki płciowej. Białka o niskiej zawartości wymagałyby frakcjonowania próbki mięśnia w celu usunięcia jak największej ilości białek kurczliwych, co zwiększyłoby stężenie białek o niskiej zawartości. Dostosowanie profilu proteomu można osiągnąć, stosując paski IPG o różnym zakresie pH oraz żele gradientowe o innym procencie, jeśli jest to pożądane. Istnieją bardziej czułe barwniki fluorescencyjne, jednak zalecamy, aby każde laboratorium samodzielnie określiło liniowość tych barwników w swoim systemie. Do bardziej rygorystycznej analizy ekspresji białek można zastosować system DIGE (system dwuwymiarowej elektroforezy w żelu, GE Healthcare Life Sciences), jednak wprowadza to dodatkowy poziom złożoności metodologii. Ponadto opisany tutaj protokół można zastosować do większości tkanek zwierzęcych, dla których zsekwencjonowano genom, a także do sekwencjonowania de novo białek z dowolnego źródła, o ile można je rozdzielić na żelu dwuwymiarowym, ponieważ poza trypsyną można generować nakładające się fragmenty enzymatyczne przy użyciu enzymów o wysokiej czystości. Próbki z innych źródeł tkankowych mogą wymagać pewnych zmian w metodologii ekstrakcji, zwłaszcza w przypadku poszukiwania białek błonowych i hydrofobowych, niemniej jednak uzyskaliśmy dobre wyniki stosując ten protokół w tkankach serca, wątroby, nerek i mózgu. Inne modyfikacje potranslacyjne można wykryć poprzez zmianę kryteriów wyszukiwania w bazie danych widma masowego. Podsumowując, przedstawiliśmy stosunkowo szczegółowy wstępny protokół analizy profilowania proteomu.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Yutian Gan za udostępnienie Ryciny 3. Praca ta była wspierana przez National Science Foundation 0420971; fundusze Blakeslee, Wilens i Holmes w Smith College oraz Howard Hughes Medical Institute.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolumny do spinowania PepClean C-18Produkt zużywalnyThermo Fisher Scientific, Inc.PI-89870
Kolumna monolityczna Pepswift (100um x 5 cm)Produkt zużywalnyDionex162348
Gotowe żele poliakryloamidowe SDS Criterion pre-cast 10,5%-14% Tris-HClProdukt zużywalnyBio-Rad345-0106
Paski IPG ReadystripProdukt zużywalnyBio-RadRóżne zakresy pH
Kwas octowyOdczynnikFisher ScientificA465-1
AcetonOdczynnikPharmco Products, Inc.329000
AcetonitrylOdczynnikFisher ScientificA955
AgarozaOdczynnikBio-Rad163-2111Roztwór
nakładczy
Wodorowęglan amonuOdczynnikFluka40867
Błękit bromofenolowyOdczynnikFisher ScientificBP114
Amfolity Bio-LyteOdczynnikBio-RadRóżne zakresy pH
CHAPSOdczynnikUSB Corp., Affymetrix13361
Błękit Coomassie R-250OdczynnikThermo Fisher Scientific, Inc.20278
Ditiotreitol (DTT)OdczynnikUSB Corp., Affymetrix15395
Kwas mrówkowyOdczynnikThermo Fisher Scientific, Inc.28905
GlicerolOdczynnikSigma-AldrichG6279
GlicynaOdczynnikUSB Corp., Affymetrix16407
JodoacetamidOdczynnikSigma-AldrichI6125
MetanolOdczynnikFisher ScientificA452
Olej mineralnyOdczynnikBio-Rad163-2129
Dodecylosiarczan soduOdczynnikSigma-AldrichL6026
Tris (zasada)OdczynnikSigma-Aldrich93349
Fosfina Tris[2-karb–oksyetylu]OdczynnikThermo Fisher Scientific, Inc.77720
Trypsyna endoproteinaza, traktowana TPCK, stopień MSOdczynnikPierce, Thermo Scientific90055modyfikowana
MocznikOdczynnikUSB Corp., Affymetrix75826
WodaOdczynnikBurdick & Jackson365
Koncentrator CentrivapNarzędzieLabconco Corp.
Wytnijnik plamek ExquestNarzędzieBio-Rad
Pułapkowa spektrometr mas LCQ Deca XP MaxNarzędzieThermo Fisher Scientific, Inc.
Zmotoryzowany tłuczekNarzędzieKontes Corp
Polipropylenowe prętyNarzędzieBiospec Products
mieszające
Komora IEF PROTEANNarzędzieBio-Rad
SonikatorNarzędzieBranson
System HPLC Surveyor PlusNarzędzieThermo Fisher Scientific, Inc.
System obrazowania VersaDocNarzędzieBio-Rad

Bibliografia

  1. Fehrenbach, E. Molecular and Cellular Exercise Physiology. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 199-217 (2005).
  2. Mooren, F. C. The Cell. Molecular and Cellular Exercise Physiology. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 3-18 (2005).
  3. Thompson, H. S., Clarkson, P. M., Scordilis, S. P. The repeated bout effect and heat shock proteins: intra-muscular HSP27 and HSP70 expression following two bouts of eccentric exercise in humans. Acta. Physiol. Scand. 174, 47-56 (2002).
  4. McHugh, M. P. Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise. Scand. J. Med. Sci. Sports. 13, 88-97 (2003).
  5. Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. Gender Dimorphism in the Exercise-Naïve Murine Skeletal Muscle Proteome. Cell Molec. Biol. Lett. 15, 507-516 (2010).
  6. Lopez, J. L. Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis. J. Chromatogr. B. 849, 190-202 (2007).
  7. Lowry, O. H., Rosenburg, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
  8. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  9. Norton, J. P., Clarkson, P. M., Graves, J. E., Litchfield, P. L., Kirwan, J. Serum creatine kinase activity and body composition in males and females. Hum. Biol. 57, 591-598 (1985).
  10. Amelink, G. J., Kamp, H. H., Bär, P. R. Creatine kinase isoenzyme profiles after exercise in the rat: sex-linked differences in leakage of CK-MM. Pflügers. Arch. 412, 417-421 (1988).
  11. Kendall, B., Eston, R. Exercise-induced muscle damage and the potential protective role of estrogen. Sports Med. 32 (2), 103-123 (2002).
  12. Tiidus, P. M. Can oestrogen influence skeletal muscle damage, inflammation, and repair? Br. J. Sports Med. 39, 251-253 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Proteomika mi ni szkieletowychdwuwymiarowa elektroforeza elowaspektrometria masekstrakcja bia ekogniskowanie izoelektryczneSDS PAGELC MS MStrawienie trypsynr nicowa ekspresja

Powiązane artykuły