Artykuł metodologiczny

Dymorfizm płciowy mięśni szkieletowych w ujęciu proteomicznym

14.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/3536

⸱

14 grudnia 2011

 ,  ,  , 
1Center for Proteomics, Smith College, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Chemistry, Smith College, 4Department of Biological Sciences and Center for Proteomics, Smith College

W tym artykule

Podsumowanie

Prosty zestaw metod izolacji i identyfikacji najliczniej występujących białek ekspresjonowanych w mięśniach szkieletowych. Na żelu dwuwymiarowym z 10 mg mięśnia można wyróżnić około 800 plamek, co umożliwia określenie specyficznej dla płci ekspresji białek. Metody te dają porównywalne wyniki w większości tkanek.

Streszczenie

Ogólny skurcz mięśnia szkieletowego jest determinowany przede wszystkim przez stosunkowo niewielką liczbę białek kurczliwych, jednak tkanka ta jest również niezwykle podatna na czynniki środowiskowe1, takie jak hipertrofia wywołana ćwiczeniami oporowymi oraz zanik wynikający z nieużywania. Wykazuje ona zatem remodeling i adaptacje do stresorów (ciepła, niedokrwienia, metali ciężkich itp.)2,3. Uszkodzenia mięśni mogą powstać w wyniku wywierania siły podczas wydłużania mięśnia, co określa się mianem skurczu ekscentrycznego4. Białka kurczliwe mogą ulec uszkodzeniu podczas takich wysiłków i wymagają naprawy, degradacji i/lub resyntezy; funkcje te nie są domeną białek kurczliwych, lecz innych, znacznie mniej licznych białek w komórce. Aby ustalić, jaka podgrupa białek bierze udział w łagodzeniu tego typu uszkodzeń, należy opracować globalny proteom przed wysiłkiem5, a następnie monitorować go po ćwiczeniach, aby określić różnicową ekspresję białek i w ten sposób wyróżnić białka kandydackie uczestniczące w adaptacjach do uszkodzeń i ich naprawie. Ponadto większość badań nad mięśniami szkieletowymi była prowadzona na osobnikach płci męskiej, w związku z czym mogą one nie być reprezentatywne dla mięśni osobników płci żeńskiej.

W niniejszym artykule przedstawiamy metodę powtarzalnej ekstrakcji białek z mięśni samców i samic oraz ich rozdzielania za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej z następującym obrazowaniem cyfrowym o wysokiej rozdzielczości6. Zapewnia ona protokół dla plamek (i następnie zidentyfikowanych białek), które wykazują statystycznie istotny (p < 0,05) dwukrotny wzrost lub spadek, pojawiają się lub znikają w stosunku do stanu kontrolnego. Są one następnie wycinane, trawione trypsyną i rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrem mas (LC/MS) w celu identyfikacji białek (LC/MS/MS)5. Metodologia ta (Rysunek 1) może być stosowana w wielu tkankach przy niewielkich lub żadnych modyfikacjach (wątroba, mózg, serce itp.).

Protokół

1. Przygotowanie próbki

  1. Jako materiał wyjściowy należy wykorzystać świeżą, zamrożoną błyskawicznie lub potraktowaną preparatem RNAlater tkankę mysią. Przed przystąpieniem do dalszych prac należy odsączyć nadmiar konserwantu za pomocą chusteczki Kimwipe.
  2. Usunąć wszystkie ścięgna i powięzi wokół mięśnia, a następnie rozdrobnić tkankę za pomocą jednokrawędziowych żyletek przez 2 min na schłodzonych szklanych płytkach w pomieszczeniu chłodniczym (4°C), aż tkanka zostanie dobrze rozdrobniona lub uzyska postać proszku. Próbkę zebrać do uprzednio zważonej probówki do wirówki i określić masę tkanki. Jako materiał wyjściowy należy użyć nie więcej niż 10 mg tkanki.
  3. W temperaturze pokojowej dodać 45 μL buforu do ekstrakcji (8 M mocznika, 50 mM DTT, 4% CHAPS, 0,2% amfolitów nośnikowych 5/8, 0,0002% błękitu bromofenolowego) na 1 mg rozdrobnionej tkanki. Jeśli objętość przekracza 350 μL, należy początkowo dodać 350 μL i homogenizować (krok 1.4), a następnie dodać resztę buforu, aby zminimalizować rozpryskiwanie.
  4. Homogenizować tkankę siedem razy za pomocą zmechanizowanego tłuczka (Kontes Corp) przez 15 sekund w temperaturze 4°C, z dwuminutowym chłodzeniem na lodzie pomiędzy każdą homogenizacją.
  5. Próbki wirować przy 15 600 x g przez 30 minut w temperaturze 4°C. Zebrać nadsącz i zmierzyć jego objętość. Osad z debris komórkowych należy odrzucić.
  6. Wytrącić białka z nadsączu za pomocą lodowatego acetonu czystości reagentowej (stosunek objętościowy 3:1). Mieszać próbki na wirówce Vortex przez 15 sekund. Wirować przy 15 600 x g przez 10 sekund w celu utworzenia osadu, a następnie resuspendować w buforze do ekstrakcji przy użyciu silnika Kontes i polipropylenowych prętów mieszających (BioSpec Prod).
  7. Powtórzyć krok 1.6.
  8. Przejść do oznaczania stężenia białek w próbkach lub przechowywać je w temperaturze -20°C.

2. Oznaczanie stężenia białka

Należy zastosować metodę Lowry'ego7 lub metodę BCA8 (Pierce); dążyć do uzyskania stężenia około 4.5 mg ml-1.

3. Fokusowanie izoelektryczne

  1. Wyjąć pasek IPG ReadyStrip (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad) z temperatury -20°C i pozostawić do wyrównania temperatury w RT przez 10-15 min.
  2. Zamieszać próbkę w wirówce typu vortex i nanieść pipetą 600-800 μg (całkowita objętość 200 μL) próbki białka w linii prostej przy tylnej krawędzi kanału w kuwecie do rehydratacji próbek, pozostawiając około 1 cm wolnego miejsca na każdym końcu.
  3. Używając pęsety, zdjąć plastikową osłonę paska IPG – należy chwytać pasek wyłącznie za końce i unikać kontaktu z żelem. Zidentyfikować koniec zasadowy paska i umieścić go po lewej stronie kuwety. Położyć pasek IPG stroną z żelem do dołu na próbce, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza pod spodem. Pozostawić do rehydratacji na jedną godzinę.
  4. Przykryć 2,5 mL oleju mineralnego (BioRad). Przykryć kuwetę pokrywką i pozostawić do rehydratacji przez noc w temperaturze pokojowej.
  5. Umieścić knot papierowy na obu końcach kanału kuwety do ogniskowania i zwilżyć każdy z nich 10 μL wody Millipore.
  6. Wyjąć pasek IPG i trzymać go pionowo przez około 10 sekund, aby odlać olej. Osuszyć plastikową podkładkę za pomocą chusteczki Kimwipe.
  7. Umieścić pasek IPG stroną z żelem do dołu, z końcem zasadowym po lewej stronie, w kuwecie do ogniskowania. Przykryć pasek 2,5 mL oleju mineralnego.
  8. Umieścić kuwetę w komorze PROTEAN IEF (Bio-Rad) i zaprogramować 3-stopniowy protokół (Tabela 1) przy domyślnej temperaturze komory 20°C, maksymalnym natężeniu prądu 50 μA/pasek i bez czasu rehydratacji.
     NapięcieCzasWolto-godzinyRampa
    Krok 125020 min Liniowa
    Krok 28,0002,5 h Liniowa
    Krok 38,000 40,000Szybka
    Suma 6,5 h40,000 


    Tabela 1. Trzystopniowy protokół komory PROTEAN IEF dla pasków IPG 11 cm.
  9. Wyjąć paski IPG z komory IEF za pomocą pęsety. Osuszyć plastikową podkładkę chusteczką Kimwipe i umieścić pasek IPG stroną z żelem do góry w czystej kuwecie do rehydratacji. Można przykryć kuwetę do rehydratacji, owinąć ją folią spożywczą i przechowywać w -80°C lub kontynuować procedurę.

4. Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS

  1. Przenieś pasek (stroną z żelem do góry) do 11-centymetrowej kuwety do równoważenia.
  2. Do kanału należy dodać 4 ml buforu redukującego (mocznik 6 M, SDS 2%, Tris/HCl 0,05 M pH 8,8, glicerol 20%, DTT 2%) i inkubować pasek przez 10 min przy łagodnym wstrząsaniu w celu osiągnięcia stanu równowagi.
  3. Usunąć bufor redukujący, dodać 4 ml buforu do alkilacji (mocznik 6 M, SDS 2%, Tris/HCl 0,05 M pH 8,8, glicerol 20%, jodoacetamid 2,5%) i inkubować pasek przez 10 minut przy łagodnym wstrząsaniu w celu wyrównania stężeń.
  4. Opłucz pasek IPG, zanurzając go krótko w 1X buforze do elektroforezy SDS (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS, pH 8,2).
  5. Połóż pasek stroną żelu do góry na tylnej płytce 11-centymetrowego gotowego żelu poliakryloamidowego Criterion SDS Tris-HCl o stężeniu 10,5%–14% (Bio-Rad) i delikatnie dociśnij go, aby zapewnić pełny kontakt z żelem SDS; upewnij się, że pomiędzy powierzchniami żeli nie pozostały pęcherzyki powietrza.
  6. Przykryj pasek IPG 1 ml stopionego roztworu agarozy (0,5% agarozy, 25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS, błękit bromofenolowy) i pozostaw agarozę do stężenia przez 5 minut.
  7. Załaduj 5 μL znacznika białek 10-225 kDa (USB, P/N: 76740) do pojedynczej studzienki jako standardów masy cząsteczkowej.
  8. Przeprowadź elektroforezę żelu w buforze SDS (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS, pH 8,2) przy napięciu 200 V w temperaturze pokojowej lub w pomieszczeniu chłodniczym (4°C) monitorując elektroforezę za pomocą migracji czoła barwnika błękitu bromofenolowego.
  9. Wyjmij żel z plastikowej formy i barw przez noc, delikatnie wstrząsając w barwniku Coomassie Brilliant Blue R-250 (45,5% metanolu, 45,5% dH2O, 9,0% kwasu octowego, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250).
  10. Wstrząśnij żel w roztworze do odbarwiania Destain 1 (45,5% metanolu, 45,5% dH2O, 9,0% kwas octowy) dwukrotnie po 3 godziny, a następnie w roztworze Destain 2 (5% metanol, 90% dH2O)2(O, 5% kwas octowy) przez noc. Żel przechowywać w 7% kwasie octowym do czasu analizy.

5. Obrazowanie i analiza żelu

  1. Należy wykonać obrazy żeli za pomocą programu Quantity One obsługującego system obrazowania VersaDoc (BioRad). Obszary obrazów dla wszystkich żeli w eksperymencie należy przyciąć w jednolity sposób.
  2. Przycięte obrazy należy wczytać do programu PDQuest 8.0 w celu utworzenia zestawu eksperymentalnego. Należy postępować zgodnie z kreatorem konfiguracji eksperymentu (Experiment setup wizard), aby zdefiniować parametry detekcji plamek oraz dopasowania plamek pomiędzy żelami. W razie potrzeby wyniki dopasowania plamek należy sprawdzić i skorygować ręcznie.
  3. Należy przeprowadzić analizę ilościową i statystyczną żeli w celu wykrycia dopasowanych plamek białkowych, wykazujących dwukrotną lub wyższą statystycznie istotną różnicę w ekspresji pomiędzy dwiema grupami żeli. Z plamek tych należy utworzyć zestaw analizy, a następnie wyciąć je za pomocą wycinarki plamek EXQuest (BioRad) w celu przeprowadzenia trawienia trypsyną i identyfikacji białek metodą LC-MS.

6. Trawienie trypsynowe w żelu

W tym kroku zastosowano zmodyfikowany protokół z zestawu Pierce In-Gel Tryptic Digest Kit (#89871X, Pierce).

  1. Do wycinków żelu dodać 200 μL roztworu odbarwiającego (25 mM wodorowęglanu amonu, 50% acetonitrylu). Przemieszać na wirówce typu vortex i inkubować próbki w temperaturze 37°C przez 30 minut z wytrząsaniem. Ostrożnie usunąć i odrzucić roztwór.
  2. Powtórzyć krok 6.1.
  3. Do probówek zawierających wycinki żelu dodać 30 μL świeżo przygotowanego buforu redukującego (50 mM Tris[2-karboksyetylo]fosfiny, 22,5 mM wodorowęglanu amonu) i inkubować w temperaturze 60°C przez 10 minut.
  4. Pozostawić próbki do ostygnięcia, a następnie usunąć i odrzucić bufor redukujący.
  5. Dodać 30 μL buforu alkilującego (100 mM jodoacetamidu, 20 mM wodorowęglanu amonu, przygotowanego bezpośrednio przed użyciem w probówkach owiniętych folią aluminiową). Inkubować próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  6. Usunąć i odrzucić bufor alkilujący. Przemyć wycinki żelu, dodając do każdej probówki 200 μL roztworu odbarwiającego. Inkubować próbki w temperaturze 37°C przez 15 minut.
  7. Usunąć i odrzucić roztwór odbarwiający i powtórzyć płukanie.
  8. Do wycinków żelu dodać 50 μL acetonitrylu i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby uległy skurczeniu i wysuszeniu, a następnie ostrożnie usunąć acetonitryl.
  9. Powtórzyć krok 6.8 jeszcze raz. Fragmenty żelu powinny być białe i małe.
  10. Pozostawić fragmenty żelu do wyschnięcia w koncentratorze Centrivap (Labconco, model EX1245) przez 10 minut.
  11. Napęcznieć fragmenty żelu, dodając 10 μL roztworu aktywowanej trypsyny (10 ng/μL trypsyny, 25 mM wodorowęglanu amonu). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  12. Do probówek dodać 25 μL buforu trawiennego (25 mM wodorowęglanu amonu). Inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez noc z wytrząsaniem.
  13. Sonicować próbki przez 10 minut (Branson, sonikator kąpielowy model 2510) i odwiruwać przed przeniesieniem supernatantu do nowej probówki. Zachować supernatant.
  14. Aby dodatkowo wyekstrahować peptydy, dodać 10 μL 0,1% kwasu mrówkowego i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Sonicować próbki przez 10 minut, zebrać supernatant i połączyć go z supernatantem zachowanym w kroku 6.13.

7. Mikroskalowe odsalanie ekstraktów peptydowych

  1. Usunąć wodorowęglan amonu oraz inne sole z ekstraktów peptydowych za pomocą kolumienek PepClean C-18 Spin Columns (ThermoFisher) zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Wyeluować peptydy dwukrotnie, używając 20 μL 70% acetonitrylu, odparować próbki do suchości w koncentratorze Centrivap przez 1 godzinę, a następnie ponownie zawiesić peptydy w 10 μL 0,1% kwasu mrówkowego do analizy MS.

8. Identyfikacja białek za pomocą spektrometrii mas sprzężonej z HPLC

  1. Rozdziel 5 μL mieszaniny peptydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w czasie 40 minut, stosując liniowy gradient acetonitrylu 2-50% z 0,2% kwasem mrówkowym na monolitycznej kolumnie Pepswift PS-DVB (Dionex) sprzężonej ze źródłem Nanospray I i pułapką jonową spektrometru mas (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) przy szybkości przepływu 400 nL/min na końcówce.
  2. Wykrywaj sygnały MS1 peptydów w zakresie 400 - 1400 m/z i izoluj 3 najintensywniejsze piki jonowe w celu sekwencjonowania MS2 metodą CID z zastosowaniem dynamicznej ekskluzji.
  3. W celu identyfikacji białek przeanalizuj wyniki peptydowe poprzez przeszukanie mysiej bazy referencyjnej Sequest (oprogramowanie BioWorks, Thermo-Fisher Scientific) z uwzględnieniem statycznej modyfikacji alkilowanej cysteiny oraz modyfikacji dynamicznych dla fosforylacji (seryna, treonina, tyrozyna), metylacji (histydyna), utleniania (metionina), ADP-rybozylowania (arginina) i acetylacji N-końca. Zastosuj konserwatywne kryteria dopasowania (np. tolerancja peptydów ustawiona na 2 AMU i tolerancja fragmentów na 1,00, białka zawierające co najmniej 2 peptydy przechodzące przez filtr Xcorr vs Charge State [z=1/x=1,5, z=2/x=2,00, z=3/x=2,50, z=4/x=3,00] oraz prawdopodobieństwo p < 0,05)5 i dokonaj ręcznej inspekcji widm MS w celu pewnej identyfikacji białek.

9. Reprezentatywne wyniki:

Wyizolowano mięśnie szkieletowe (biceps brachii) od niećwiczących samców i samic myszy, a następnie rozdzielono je na mapie dwuwymiarowej5, stanowiącej pierwszy poziom porównawczego proteomu mięśniowego (rycina 2). Po wizualizacji przy użyciu cyfrowego obrazowania o wysokiej rozdzielczości w każdym przypadku wykryto około 800 plamek białkowych. Przyjmując mapę proteomu samca jako punkt odniesienia, wyraźnie widać liczne plamki, których obfitość zmienia się w proteomie samicy. Intensywność plamek jest miarą zmiany ilości białek (rycina 3). Tożsamość plamek białkowych, których obfitość zmieniła się ponad dwukrotnie (wzrost lub spadek) i które są istotne statystycznie (p < 0,05) przy n=5 myszy, określono poprzez analizę sekwencji aminokwasów z wykorzystaniem chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. Wyniki te wskazują, że u samic obserwuje się spadek obfitości enzymów metabolizmu energetycznego cukrów oraz izoform enzymu kinazy kreatynowej (CK), który stanowi odmienny system dostarczania energii w mięśniach. Zarówno u ludzi, jak i u zwierząt stwierdza się wyższe poziomy CK w surowicy samców w spoczynku oraz po wysiłku fizycznym9,10, jednak poziomy CK w surowicy nie muszą korelować z zakresem uszkodzeń miofibrylarnych11,12. Ten dymorfizm płciowy w komórkowej obfitości CK w mięśniu biceps brachii myszy jest nowym odkryciem5 i może wyjaśniać fizjologiczne różnice w poziomach CK w surowicy.

Ryciny:

Schemat identyfikacji białek: przygotowanie próbek, analiza, chromatografia, spektrometria mas, eksploracja danych.
Rysunek 1. Ogólny schemat protokołu dla proteomiki porównawczej. Protokół jest podzielony na trzy grupy: przygotowanie próbek, analizę próbek oraz identyfikację białek. Końce każdej z tych trzech grup protokołów stanowią odpowiednie miejsca na przerwy, choć najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy cały protokół jest przeprowadzany bez przerywania.

Analiza białek mięśnia dwugłowego ramienia myszy, wyniki elektroforezy 2D, porównanie mięśni samców i samic.
Rysunek 2. Porównanie plamek białkowych z mięśnia dwugłowego ramienia samic myszy w odniesieniu do identycznych plamek w mięśniu dwugłowym ramienia samców (zielone okręgi o). Plamki, których intensywność u samic wzrosła dwukrotnie lub więcej, obokreślono na czerwono (o), a plamki, których intensywność spadła dwukrotnie lub bardziej, obokreślono na niebiesko (o).

Analiza regresji liniowej; wykres rozrzutu, dopasowanie danych, trend statystyczny, wykres edukacyjny.
Rycina 3. Analiza intensywności plam żelu: oś X, samice przed ćwiczeniami (kontrola, n=5); oś Y, grupa samic w punkcie czasowym 0 h po pojedynczej serii ćwiczeń (n=5). Linia regresji: współczynnik korelacji = 0,919; nachylenie = 0,976; punkt przecięcia = -0,0293. Plamy powyżej czerwonej linii i poniżej niebieskiej linii wykazują zmianę większą niż +/- dwukrotność.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda proteomiki LC/MS stanowi wysoce niezawodny i powtarzalny protokół do szybkiej analizy pierwszego poziomu proteomu mięśni szkieletowych. Pozwala ona na stosunkowo sprawną analizę porównawczą specyfiki płciowej. Białka o niskiej zawartości wymagałyby frakcjonowania próbki mięśnia w celu usunięcia jak największej ilości białek kurczliwych, co zwiększyłoby stężenie białek o niskiej zawartości. Dostosowanie profilu proteomu można osiągnąć, stosując paski IPG o różnym zakresie pH oraz żele gradientowe o innym procencie, jeśli jest to pożądane. Istnieją bardziej czułe barwniki fluorescencyjne, jednak zalecamy, aby każde laboratorium samodzielnie określiło liniowość tych barwników w swoim systemie. Do bardziej rygorystycznej analizy ekspresji białek można zastosować system DIGE (system dwuwymiarowej elektroforezy w żelu, GE Healthcare Life Sciences), jednak wprowadza to dodatkowy poziom złożoności metodologii. Ponadto opisany tutaj protokół można zastosować do większości tkanek zwierzęcych, dla których zsekwencjonowano genom, a także do sekwencjonowania de novo białek z dowolnego źródła, o ile można je rozdzielić na żelu dwuwymiarowym, ponieważ poza trypsyną można generować nakładające się fragmenty enzymatyczne przy użyciu enzymów o wysokiej czystości. Próbki z innych źródeł tkankowych mogą wymagać pewnych zmian w metodologii ekstrakcji, zwłaszcza w przypadku poszukiwania białek błonowych i hydrofobowych, niemniej jednak uzyskaliśmy dobre wyniki stosując ten protokół w tkankach serca, wątroby, nerek i mózgu. Inne modyfikacje potranslacyjne można wykryć poprzez zmianę kryteriów wyszukiwania w bazie danych widma masowego. Podsumowując, przedstawiliśmy stosunkowo szczegółowy wstępny protokół analizy profilowania proteomu.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Yutian Gan za udostępnienie Ryciny 3. Praca ta była wspierana przez National Science Foundation 0420971; fundusze Blakeslee, Wilens i Holmes w Smith College oraz Howard Hughes Medical Institute.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolumny do spinowania PepClean C-18Produkt zużywalnyThermo Fisher Scientific, Inc.PI-89870
Kolumna monolityczna Pepswift (100um x 5 cm)Produkt zużywalnyDionex162348
Gotowe żele poliakryloamidowe SDS Criterion pre-cast 10,5%-14% Tris-HClProdukt zużywalnyBio-Rad345-0106
Paski IPG ReadystripProdukt zużywalnyBio-RadRóżne zakresy pH
Kwas octowyOdczynnikFisher ScientificA465-1
AcetonOdczynnikPharmco Products, Inc.329000
AcetonitrylOdczynnikFisher ScientificA955
AgarozaOdczynnikBio-Rad163-2111Roztwór
nakładczy
Wodorowęglan amonuOdczynnikFluka40867
Błękit bromofenolowyOdczynnikFisher ScientificBP114
Amfolity Bio-LyteOdczynnikBio-RadRóżne zakresy pH
CHAPSOdczynnikUSB Corp., Affymetrix13361
Błękit Coomassie R-250OdczynnikThermo Fisher Scientific, Inc.20278
Ditiotreitol (DTT)OdczynnikUSB Corp., Affymetrix15395
Kwas mrówkowyOdczynnikThermo Fisher Scientific, Inc.28905
GlicerolOdczynnikSigma-AldrichG6279
GlicynaOdczynnikUSB Corp., Affymetrix16407
JodoacetamidOdczynnikSigma-AldrichI6125
MetanolOdczynnikFisher ScientificA452
Olej mineralnyOdczynnikBio-Rad163-2129
Dodecylosiarczan soduOdczynnikSigma-AldrichL6026
Tris (zasada)OdczynnikSigma-Aldrich93349
Fosfina Tris[2-karb–oksyetylu]OdczynnikThermo Fisher Scientific, Inc.77720
Trypsyna endoproteinaza, traktowana TPCK, stopień MSOdczynnikPierce, Thermo Scientific90055modyfikowana
MocznikOdczynnikUSB Corp., Affymetrix75826
WodaOdczynnikBurdick & Jackson365
Koncentrator CentrivapNarzędzieLabconco Corp.
Wytnijnik plamek ExquestNarzędzieBio-Rad
Pułapkowa spektrometr mas LCQ Deca XP MaxNarzędzieThermo Fisher Scientific, Inc.
Zmotoryzowany tłuczekNarzędzieKontes Corp
Polipropylenowe prętyNarzędzieBiospec Products
mieszające
Komora IEF PROTEANNarzędzieBio-Rad
SonikatorNarzędzieBranson
System HPLC Surveyor PlusNarzędzieThermo Fisher Scientific, Inc.
System obrazowania VersaDocNarzędzieBio-Rad

Bibliografia

  1. Fehrenbach, E. Molecular and Cellular Exercise Physiology. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 199-217 (2005).
  2. Mooren, F. C. The Cell. Molecular and Cellular Exercise Physiology. Mooren, F. C., Völker, K. , Human Kinetics. New York. 3-18 (2005).
  3. Thompson, H. S., Clarkson, P. M., Scordilis, S. P. The repeated bout effect and heat shock proteins: intra-muscular HSP27 and HSP70 expression following two bouts of eccentric exercise in humans. Acta. Physiol. Scand. 174, 47-56 (2002).
  4. McHugh, M. P. Recent advances in the understanding of the repeated bout effect: the protective effect against muscle damage from a single bout of eccentric exercise. Scand. J. Med. Sci. Sports. 13, 88-97 (2003).
  5. Metskas, L. A., Kulp, M., Scordilis, S. P. Gender Dimorphism in the Exercise-Naïve Murine Skeletal Muscle Proteome. Cell Molec. Biol. Lett. 15, 507-516 (2010).
  6. Lopez, J. L. Two-dimensional electrophoresis in proteome expression analysis. J. Chromatogr. B. 849, 190-202 (2007).
  7. Lowry, O. H., Rosenburg, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
  8. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  9. Norton, J. P., Clarkson, P. M., Graves, J. E., Litchfield, P. L., Kirwan, J. Serum creatine kinase activity and body composition in males and females. Hum. Biol. 57, 591-598 (1985).
  10. Amelink, G. J., Kamp, H. H., Bär, P. R. Creatine kinase isoenzyme profiles after exercise in the rat: sex-linked differences in leakage of CK-MM. Pflügers. Arch. 412, 417-421 (1988).
  11. Kendall, B., Eston, R. Exercise-induced muscle damage and the potential protective role of estrogen. Sports Med. 32 (2), 103-123 (2002).
  12. Tiidus, P. M. Can oestrogen influence skeletal muscle damage, inflammation, and repair? Br. J. Sports Med. 39, 251-253 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Proteomika mięśni szkieletowychdwuwymiarowa elektroforeza żelowaspektrometria masekstrakcja białekogniskowanie izoelektryczneSDS-PAGELC/MS/MStrawienie trypsynąróżnicowa ekspresja
Dymorfizm płciowy mięśni szkieletowych w ujęciu proteomicznym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.