Oznaczanie aktywności fagocytarnej próbek przeciwciał klinicznych

Podsumowanie

Przedstawiamy wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej do określania aktywności fagocytarnej przeciwciał swoistych dla antygenu z próbek klinicznych, z wykorzystaniem kuleczek pokrytych fluorescencyjnym antygenem oraz linii komórkowej monocytów wykazującej ekspresję wielu receptorów Fc, co pozwala na standaryzowane i powtarzalne określanie wykorzystania receptorów oraz aktywności fagocytarnej dla dowolnego wybranego antygenu.

Streszczenie

Fagocytoza indukowana przeciwciałami jest wywoływana poprzez zaangażowanie receptorów Fc na wyspecjalizowanych fagocytach i może przyczyniać się zarówno do eliminacji, jak i do patologii choroby. Podczas gdy właściwości domen zmiennych przeciwciał od dawna są uważane za krytyczne dla funkcji in vivo, zdolność przeciwciał do rekrutacji komórek odporności wrodzonej poprzez ich domeny Fc jest coraz bardziej doceniana jako kluczowy czynnik ich skuteczności, zarówno w kontekście terapii rekombinowanymi przeciwciałami monoklonalnymi, jak i w przebiegu naturalnej infekcji lub szczepienia^1-3.

Co istotne, pomimo nazwy wskazującej na stałą domenę, domena Fc przeciwciała nie wykazuje stałej funkcji i jest silnie modulowana przez podklasę IgG (IgG1-4) oraz glikozylację w Asparaginie 297^4-6. Zatem ta metoda badania różnic funkcjonalnych przeciwciał swoistych dla antygenu w próbkach klinicznych ułatwi korelację potencjału fagocytarnego przeciwciał ze stanem choroby, podatnością na infekcję, progresją lub wynikiem klinicznym.

Ponadto funkcja efektorowa ta jest szczególnie istotna w świetle udokumentowanej zdolności przeciwciał do nasilania infekcji poprzez zapewnienie patogenom dostępu do komórek gospodarza za pośrednictwem fagocytozy zależnej od receptorów Fc⁷. Ponadto istnieją dowody na to, że fagocytarne pobieranie kompleksów immunologicznych może wpływać na polaryzację odpowiedzi immunologicznej Th1/Th2⁸.

W niniejszej pracy opisujemy test zaprojektowany do wysokoprzepustowego wykrywania różnic w fagocytozie indukowanej przez przeciwciała, które mogą wynikać z odmiennych podklas IgG, struktury glikanów w pozycji Asn297, a także zdolności przeciwciał specyficznych dla antygenu do tworzenia kompleksów immunologicznych. W tym celu fluorescencyjne koraliki o średnicy 1 μm są powlekane antygenem, a następnie inkubowane z klinicznymi próbkami przeciwciał, co prowadzi do powstania fluorescencyjnych kompleksów immunologicznych specyficznych dla antygenu. Te opsonizowane przeciwciałami koraliki są następnie inkubowane z linią komórek monocytarnych wykazującą ekspresję wielu receptorów FcγR, w tym zarówno hamujących, jak i aktywujących. Wyniki testu mogą obejmować aktywność fagocytarną, sekrecję cytokin oraz wzorce wykorzystania FcγR i są one określane w sposób zstandaryzowany, co czyni ten system niezwykle użytecznym narzędziem do analizy różnic w tej efektorowej funkcji zależnej od przeciwciał, zarówno w kontekście infekcji, jak i ochrony indukowanej szczepionkami⁹.

Protokół

1. Hodowla komórek fagocytujących

1. Hodować komórki THP-1¹⁰ w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej jako zawiesinę stacjonarną w kolbach typu T. Gęstość komórek powinna być utrzymywana poniżej 0,5x10⁶/mL, aby zapewnić stałe poziomy ekspresji FcγR oraz powtarzalność wyników analizy.

2. Przygotowanie biotynilowanego antygenu

1. Obliczyć ilość zestawu odczynników do biotinylacji sulfo-NHS LC niezbędną do biotinylacji badanego antygenu docelowego zgodnie z instrukcją producenta.
2. Rozpuścić odczynnik do biotinylacji w wodzie i bezzwłocznie dodać obliczoną ilość do antygenu w buforze niezawierającym amin pierwszorzędowych. Pozostawić reakcję na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, okazjonalnie mieszając.
3. Usunąć nadmiar nie sprzężonej biotyny poprzez wymianę buforu w odśrodkowej jednostce koncentrującej Amicon o odpowiednim progu odcięcia masy cząsteczkowej (molecular weight cutoff), aby zatrzymać antygen docelowy. Dodać próbkę do górnej komory jednostki koncentrującej i dolać PBS, aby zwiększyć całkowitą objętość do linii wypełnienia 15 mL. Odwirować przy 4000 x g, aby zmniejszyć objętość do około 1,5 mls. Powtórzenie tego procesu dwukrotnie usunie 99% wolnej biotyny, co zapewni maksymalne pokrycie kulek antygenem.

3. Przygotowanie kulek nasyconych antygenem

1. Wymyć 100 μl fluorescencyjnych kulek neutravidyny o stężeniu 1 mm dwukrotnie w 1 ml 0,1% PBS-BSA po odwirowaniu w mikrowirówce przy wysokiej prędkości. Ponownie zawiesić wymyte kulki w 100 μl PBS-BSA i podzielić na 10 probówek.
2. W celu określenia warunków powlekania antygenem, które nasycą kulki, połączyć 10 μl zawiesiny wymytych kulek z różnymi stężeniami biotynilowanego antygenu w dwukrotnych rozcieńczeniach. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C w probówce do mikrowirówki na rotatorze.

UWAGA: Stopień nasycenia kulek musi zostać określony eksperymentalnie. Można to osiągnąć poprzez zidentyfikowanie warunków powlekania kulek, które zapewniają maksymalną fagocytozę, gdy kulki zostaną następnie opsonizowane kontrolnym przeciwciałem monoklonalnym.

3. Usuń niezwiązany antygen, przemywając go 1 mL PBS-BSA, a następnie odwiruj z dużą prędkością aż do osadzenia kulek. Usuń PBS-BSA i powtórz czynność.
4. Resuspenduj kulki pokryte antygenem w końcowej objętości 1 ml PBS-BSA. Kulki można przechowywać do tygodnia w temperaturze 4°C przed użyciem.

4. Przygotowanie próbek przeciwciał

1. Kliniczne próbki przeciwciał można oczyścić z osocza, korzystając z zestawu do oczyszczania IgG Melon gel zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczone IgG można przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia.

UWAGA: Należy zawsze przestrzegać odpowiednich środków ostrożności podczas pracy z próbkami pochodzenia ludzkiego.

2. Wyznaczyć stężenie oczyszczonych przeciwciał poprzez pomiar absorbancji przy A280, a następnie rozcieńczyć próbki do stężenia 1 mg/ml w PBS.
3. Przygotować pozytywne i negatywne przeciwciała kontrolne monoklonalne poprzez rozcieńczenie do stężenia 1 mg/ml w PBS.

5. Wysiewanie eksperymentu

1. Resuspender przygotowany wcześniej roztwór wypłukanych i nasyconych antygenem kulek poprzez mieszanie w wortexie, a następnie przenieść 10 μl do każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym. Należy dbać o ciągłe mieszanie zawiesiny kulek, aby do każdego dołka trafiła taka sama liczba kulek fluorescencyjnych.
2. Do każdego dołka dodać przeciwciała o różnych stężeniach, tworząc krzywą zależności odpowiedzi od dawki dla każdego przeciwciała. Optymalne stężenia będą się różnić w zależności od miana przeciwciał obecnych w próbkach, jednak zakres końcowych stężeń od 0,01 do 100 μg/ml zapewni odpowiedni zakres i pozwoli na zidentyfikowanie interesującego przedziału stężeń. Należy upewnić się, że przeciwciała są dodawane w objętościach nieprzekraczających 20 μl.
3. Inkubować kulki i próbki przeciwciał przez 2 godziny w temperaturze 37°C, aby umożliwić opsonizację kulek przez przeciwciała.
4. Przygotować zawiesinę komórek THP-1 o stężeniu 2,5 x 10⁵ komórek/ml i dodać 200 μl tej zawiesiny do każdego dołka, tak aby w każdym dołku znalazło się łącznie 5 x 10⁴ komórek THP-1.
5. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO₂ w inkubatorze stacjonarnym, pozwalając komórkom i kulkom osadzić się pod wpływem grawitacji.

UWAGA: Stosunek sygnału do szumu można poprawić poprzez wyznaczenie optymalnych proporcji kulek:przeciwciał:komórek THP-1 dla danego antygenu i źródła przeciwciał.

6. Analiza cytometryczna

1. Odssać 100 μl supernatantu z każdej studni, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Supernatant można zachować, jeśli planowane jest oznaczanie sekrecji cytokin lub inne analizy.
2. W celu utrwalenia dodać 100 μl 4% paraformaldehydu do każdej studni, a następnie pipetować w celu resuspensji i wymieszania komórek.
3. Analizę cytometryczną wysokoprzepustową można przeprowadzić przy użyciu urządzenia BD LSR II wyposażonego w czytnik płytek HTS.
4. Zaprogramować oprogramowanie tak, aby mieszać każdą studnię trzykrotnie (objętość mieszania 100 μl) i analizować 30 μl lub co najmniej 2000 zdarzeń komórkowych z każdej próbki.
5. Zebrane dane można analizować w programie FlowJo lub równoważnym oprogramowaniu. Przydatne wskaźniki obejmują procent komórek bead+ lub fluorescencyjnych, co pozwala określić liczbę obecnych komórek fagocytujących, a także intensywność fluorescencji komórek fagocytujących, co pozwala określić liczbę sfagocytowanych kulek. Pomnożenie tych wartości pozwala uzyskać zintegrowaną średnią intensywność fluorescencji (iMFI).
6. Średnią liczbę kulek sfagocytowanych przez każdą komórkę fagocytującą można obliczyć, dzieląc iMFI przez średnią fluorescencję jednej kulki.

7. Reprezentatywne wyniki

Powinno wystąpić wyraźne rozróżnienie próbek przeciwciał pochodzących od osób chorych i zdrowych. Rysunek 1A przedstawia histogramy FACS z próbki przeciwciał od osoby HIV-ujemnej (linia czarna) oraz HIV-dodatniej (linia szara) i wykazuje zwiększoną fagocytozę indukowaną obecnością przeciwciał specyficznych dla antygenu.

Optymalna czułość testu zależy od nasycenia kulek antygenem biotynilowanym. Rycina 1B przedstawia fagocytozę zaobserwowaną w przypadku kulek pokrytych różnymi ilościami antygenu, które zostały opsonizowane trzema kontrolnymi przeciwciałami monoklonalnymi (w tym przeciwciałem niewiążącym, trójkąty), co pozwoliło ustalić stężenie 2μg antygenu/μl kulek jako stężenie nasycające dla tego antygenu.

Krzywa zależności dawka-odpowiedź została przedstawiona na rysunku 2 i wykazuje zróżnicowaną zdolność badanych próbek przeciwciał do indukowania fagocytozy w zakresie stężeń przeciwciał od 0,05-5 μg/ml. Ta zróżnicowana fagocytoza może wynikać z różnic w mianie lub właściwościach domeny Fc, takich jak podklasa IgG i stan glikozylacji.

Podczas obrazowania komórek THP-1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej widoczne są wyraźne dowody na fagocytozę kulek. Rysunek 3 przedstawia dwa nieruchome obrazy komórek THP-1 przy powiększeniu 63x po inkubacji z kuleczkami opsonizowanymi przeciwciałem (zielone) oraz nieopsonizowanymi (czerwone), co demonstruje brak wychwytu fagocytarnego w przypadku braku przeciwciał. W przypadku zastosowania mikroskopii poklatkowej specyficzny dla przeciwciał wychwyt fagocytarny fluorescencyjnych kulek jest jeszcze bardziej uderzający (Film 1, powiększenie 20x).

Wcześniejsze prace potwierdziły internalizację kulek związanych z komórkami, a eksperymenty z monocytami pierwotnymi były zgodne z wynikami fagocytozy (wartości iMFI) w tym wysokoprzepustowym teście (dane nie zostały przedstawione).

Rycina 1.  Kontrola jakości testu. 1A: Histogramy cytometrii przepływowej dla fagocytozy w próbce przeciwciał od osoby HIV-ujemnej (linia czarna) oraz osoby HIV-dodatniej (linia szara). 1B: Doświadczalne określenie optymalnych warunków powlekania kulek dla próbki antygenu. Monoklonalne przeciwciała specyficzne dla antygenu (koło, kwadrat) wykazują maksymalną fagocytozę kulek powlekanych ilością >2 μg antygenu/μl kulek, podczas gdy przeciwciało kontrolne (trójkąt) nie wykazuje aktywności fagocytycznej.

Rycina 2.  Krzywa zależności odpowiedzi fagocytozy od dawki. Kliniczne próbki przeciwciał od osób HIV-dodatnich (leczonych, nieleczonych oraz wykazujących kontrolę replikacji wirusa bez terapii antyretrowirusowej) i HIV-ujemnych w różny sposób stymulują fagocytozę kulek pokrytych gp120 (otoczką HIV).

Rycina 3.  Efektywna internalizacja. Mikroskopia potwierdza internalizację kulek opsonizowanych przeciwciałami (zielone), podczas gdy kuleczki nieopsonizowane pozostają w roztworze (powiększenie 63x).

Film 1. Mikroskopia poklatkowa fagocytozy indukowanej przeciwciałami była prowadzona przez 14 godzin i umożliwia wizualizację aktywności fagocytycznej komórek THP-1 wykorzystanych w teście wysokoprzepustowym. Zielone fluorescencyjne kuleczki są opsonizowane przeciwciałami, natomiast czerwone fluorescencyjne kuleczki stanowią kontrolę negatywną. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

Opisany tutaj test umożliwia wysokoprzepustową analizę aktywności fagocytycznej klinicznych próbek przeciwciał z wykorzystaniem linii komórek monocytarnych, długo stosowanej do badania procesów fagocytozy¹⁰, oraz automatycznej cytometrii przepływowej w płytkach. Test ten ma przewagę nad innymi metodami dzięki zdolności do precyzyjnej charakterystyki podzbiorów przeciwciał specyficznych dla antygenu, co pozwala nie tylko na badanie różnic w fagocytozie indukowanej przez przeciwciała specyficzne dla danej choroby u różnych osób, ale także na badanie wielu swoistości antygenowych u tego samego pacjenta. Ponieważ rekrutacja wrodzonych komórek efektorowych przez przeciwciała, w tym monocytów i innych komórek prezentujących antygen, silnie wpływa na wynik choroby^11-13 i jest zmienna biologicznie w zależności od geometrii przeciwciała, podklasy IgG oraz glikozylacji asparaginy 297 w domenie Fc^14-16, metoda ta umożliwia ocenę krytycznego mechanizmu działania przeciwciał. Ponadto, ponieważ fagocytoza pośredniczona przez przeciwciała jest wykorzystywana przez niektóre patogeny w przebiegu infekcji^7,17,18, test ten daje nadzieję na ocenę procesu wzmocnienia zależnego od przeciwciał (antibody-dependent enhancement) i podkreśla dwoistą naturę fagocytozy jako potencjalnie ochronnej, a zarazem potencjalnie szkodliwej aktywności przeciwciał.

Opisany test może być wykorzystany do analizy przeciwciał z próbek klinicznych populacji pacjentów, a także osób zaszczepionych, i może zostać dostosowany do wykorzystania surowicy zamiast oczyszczonego IgG. Ponadto, sekrecję cytokin w odpowiedzi na fagocytozę można analizować w nadsączu hodowli, a wpływ konkretnych FcR można określić za pomocą przeciwciał blokujących FcR, co pozwala na ustalenie nie tylko różnic w potencjale fagocytarnym, ale także późniejszych zdarzeń sygnalizacyjnych, dając wgląd w mechanizm, co może pomóc w wyjaśnieniu i doprecyzowaniu zrozumienia tego mechanizmu odpornościowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do biotynylacji EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21935
Wirówkowy moduł filtrujący Amicon Ultra-15 z membraną Ultracel-50	EMD Millipore	UFC905024	Rozmiar modułu filtrującego może się różnić w zależności od wielkości antygenu
Mikrosfery FluoSpheres znakowane NeutrAvidyną, 1,0 μm, fluorescencyjne żółto-zielone (505/515)	Invitrogen	F-8776	Producenci oferują ten produkt w różnych kolorach
Zestaw do oczyszczania IgG Melon Gel IgG Purification Kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	45212	Należy zadbać o weryfikację czystości próbek Ab za pomocą SDS-PAGE.