W niniejszej pracy opisujemy pierwszą zgodną z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) metodę produkcji wirusowo-specyficznych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) z krwi pępowinowej, która jest źródłem głównie naiwnych limfocytów T.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa Epstein-Barr i adenowirusa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Infekcje wirusowe po transplantacji komórek macierzystych należą do najczęstszych przyczyn zgonów, zwłaszcza po transplantacji krwi pępowinowej (CBT), ponieważ krew pępowinowa nie zawiera znaczącej liczby limfocytów T z doświadczeniem wirusowym, które mogłyby chronić biorcę przed infekcją.1-4 My oraz inni badacze wykazaliśmy, że wirusowo swoiste limfocyty CTL generowane z seropozytywnych dawców i przetaczane biorcy są bezpieczne i pełnią funkcję ochronną.5-8 Jednakże aż do niedawna nie było możliwe generowanie wirusowo swoistych limfocytów T z krwi pępowinowej, prawdopodobnie ze względu na brak wirusowo swoistych limfocytów T pamięci.
W celu lepszego odwzorowania warunków primingu naiwnych limfocytów T in vivo, opracowaliśmy metodę wykorzystującą komórki dendrytyczne (DC) pochodzące z krwi pępowinowej (CB), transdukowane wektorem adenowirusowym (Ad5f35pp65) zawierającym immunodominujący antygen CMV pp65, co kieruje swoistość limfocytów T przeciwko CMV i adenowirusowi.9 Na początku wykorzystujemy te dojrzałe komórki DC oraz limfocyty T pochodzące z CB w obecności cytokin IL-7, IL-12 i IL-15.10 Podczas drugiej stymulacji zastosowano limfocyty B przekształcone przez EBV (EBV-LCL), które wykazują ekspresję zarówno latentnych, jak i litycznych antygenów EBV. EBV-LCL transdukowane Ad5f35pp65 są wykorzystywane do stymulacji limfocytów T w obecności IL-15 podczas drugiej stymulacji. Kolejne stymulacje przeprowadzane są z użyciem EBV-LCL transdukowanych Ad5f35pp65 oraz IL-2.
Z 50x106 mononuklearnych komórek krwi pępowinowej (CB) jesteśmy w stanie wygenerować ponad 150 x 106 limfocytów T specyficznych dla wirusa, które lizują cele stymulowane antygenem i uwalniają cytokiny w odpowiedzi na stymulację antygenową.11 Komórki te zostały wytworzone zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP), wykorzystując jedynie 20% frakcję z frakcjonowanej jednostki krwi pępowinowej, i zostały wdrożone do użytku klinicznego.
Protokół
1. Izolacja komórek mononuklearnych (dzień 0)
- Wprowadź kolec żeńskiego adaptera Luera do portu wylotowego frakcji 20% jednostki krwi pępowinowej, podłącz strzykawkę i odessij krew. Przenieś rozmrożoną krew do 20 mL podgrzanego medium RPMI w probówce wirówkowej o pojemności 50 mL. Przepłucz worek z krwią pępowinową 5 mL RPMI i przenieś płuczkę do tej samej probówki wirówkowej.
- Wiruj komórki przez 10 minut przy 400 x g. Odessij supernatant.
- Resuspenduj komórki w 20 mL ciepłego RPMI. Nanieś komórki warstwą na 15 mL Lymphoprep w probówce wirówkowej o pojemności 50 mL. Wiruj przez 40 minut przy 400 x g.
- Zbierz warstwę graniczną zawierającą komórki mononuklearne i przemyj je w 20 mL RPMI. Wiruj przez 10 minut przy 450 x g.
- Odessij supernatant i przemyj komórki w 20 mL RPMI. Policz komórki i wiruj przez 5 minut przy 400 x g.
- Odessij supernatant i resuspenduj komórki w stężeniu 5 x 106 komórek mononuklearnych/mL w medium Cellgenix DC (bezwerserumowe). Pobierz 1 mL do generowania EBV-LCL i przenieś do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL.
2. Generowanie komórek dendrytycznych (rozpoczęcie w dniu 0)
- Do każdej studni płytki 6-dołkowej nanieść 2 mL komórek (o stężeniu 5 x 106 komórek/mL w pożywce DC). Inkubować przez 1-2 godziny.
- Po 1-2 godzinach usunąć komórki nieprzylegające, płcząc 3-4 razy PBS. Zebrać komórki nieprzylegające i zamrozić. Do każdej studni dodać 2 mL pożywki DC zawierającej 1000 U/mL IL-4 oraz 800 U/mL GM-CSF.
- 3-4 dni po inicjacji DC uzupełnić IL-4 oraz GM-CSF, dodając 100 μL/studnię pożywki o końcowym stężeniu 1000 U/mL IL-4 i 800 U/mL GM-CSF.
- W 5. lub 6. dniu zebrać DC, zeskrobując je ze studni za pomocą pipety transferowej. Policzyć duże komórki i odwirować przez 5 minut przy 400 x g. Odessać pożywkę i resuspender DC w pożywce DC w stężeniu 2x106 komórek/mL. Przenieść po 0,5 mL na studnię do płytki 24-dołkowej.
- Przeprowadzić transdukcję DC przy użyciu wektora Ad5f35pp65 przy MOI wynoszącym 10 jednostek infekcyjnych na komórkę. Dodać wektor do każdej studni w płytce 24-dołkowej. Inkubować komórki przez 1,5 godziny. Po 1,5 godziny dodać 1,5 mL/studnię pożywki DC zawierającej: 1000 U/mL IL-4, 800 U/mL GM-CSF, 10 ng/mL TNF-alpha, 1 μg/mL PGE-1, 100 ng/mL IL-6 oraz 10 ng/mL IL-1beta. Cytokiny te służą do dojrzewania komórek DC.
3. Generowanie EBV-LCL (począwszy od dnia 0)
- Odwiruj probówkę zawierającą 5 x 106 komórek jednojądrowych. Dodaj 200 μL skoncentrowanego supernatantu EBV B95.8 oraz 1,8 mL pełnej pożywki (RPMI + 10% FBS + 2mM L-glutaminy) zawierającej cyklosporynę (1 μg/mL).
- Rozdziel komórki w aliquotach po 100 μL do 10 studzienek płytki 96-dołkowej oraz po 200 μL do 5 studzienek. Do studzienek zawierających jedynie 100 μL komórek dodaj 100 μL pełnej pożywki z cyklosporyną. Pozostałe studzienki wypełnij sterylną wodą.
- Dokarmiaj LCL co tydzień i przenieś hodowlę z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej po około 2 tygodniach. Po kolejnym tygodniu przenieś komórki do kolby T25, a w następnym tygodniu do kolby T75. Na tym etapie zaleca się zamrożenie aliquotów LCL. Wygenerowanie wystarczającej liczby LCL zajmuje zazwyczaj 1 miesiąc.
4. Inicjacja CTL – 7 dni po inicjacji komórek DC
- Zebrać komórki DC i napromieniować dawką 30 Gy. Przemyć 4 razy i policzyć. Resuspendować DC w pożywce do limfocytów T zawierającej surowicę ludzką (45% RPMI, 45% CLICK's, 10% surowicy ludzkiej, 2mM L-glutaminy) w stężeniu 1 x 105 DCs/mL.
- Rozmrozić komórki nieprzylegające z kroku 2.2. Przemyć komórki i policzyć. Resuspendować w stężeniu 2 x 106 komórek nieprzylegających/mL w pożywce do limfocytów T zawierającej surowicę ludzką. Dodać 10 ng/mL IL-7 i IL-12 oraz 5 ng/mL IL-15. Przenieść po 1 mL komórek do każdej studni płytki 24-dołkowej. Dodać 1 mL komórek DC do każdej studni. Puste studnie płytki 24-dołkowej wypełnić wodą sterylną.
- 7 dni po inicjacji limfocytów T dokarmić i/lub przesiewać komórki, używając pożywki do limfocytów T zawierającej surowicę ludzką.
- 9-12 dni po inicjacji limfocytów T zamrozić limfocyty T do czasu przygotowania linii LCL.
- Po namnożeniu i pasażowaniu LCL w kolbach T75, przeprowadzić transdukcję LCL poprzez wirowanie przez 5 minut przy 400 x g. Dodać wektor do osadu komórkowego przy MOI wynoszącym 100 jednostek zakaźnych na komórkę. Inkubować przez 1,5 godziny. Po 1,5 godzinach resuspendować w pożywce kompletnej w stężeniu 5 x 105 LCL/mL i dodać po 2 mL do każdej studni płytki 24-dołkowej.12
- Po 2 dniach zebrać LCL i napromieniować dawką 40 Gy. Przemyć 4 razy i policzyć. Resuspendować LCL w pożywce do limfocytów T zawierającej surowicę ludzką w stężeniu 2,5 x 105 komórek/mL. Dodać 1 mL LCL do każdej studni płytki 24-dołkowej. Dodatkowo przenieść 5 x 106 LCL do urządzenia hodowlanego Grex40 oraz dodać 5 ng/mL IL-15.13
- Zebrać limfocyty T. Wirować przez 5 minut przy 400 x g, odprowadzić naddestylat i resuspendować w pożywce do limfocytów T zawierającej surowicę ludzką w stężeniu 1 x 106 limfocytów T/mL. Dodać 5 ng/mL IL-15 i przenieść po 1 mL/studnię limfocytów T (łącznie 1 x 106 limfocytów T) do LCL znajdujących się już w płytce 24-dołkowej. W urządzeniu Grex40 uzupełnić całkowitą objętość pożywki do 30 mL.
- W 3-4 dniu po stymulacji, jeśli komórki osiągnęły konfluencję, przesiewać je (na płytce) w stosunku 1:1 i dodać świeżą pożywkę zawierającą 50 U/mL IL-2. Jeśli nie osiągnęły konfluencji, po prostu odprowadzić ½ pożywki i zastąpić ją pożywką zawierającą 50 U/mL IL-2. W urządzeniu Grex40 odprowadzić połowę pożywki, zastąpić świeżą pożywką i dodać 50 U/mL IL-2.
- W 7 dniu powtórzyć czynność zgodnie z krokiem 4.6, ale w dniu stymulacji zastosować IL-2 zamiast IL-15.
5. Reprezentatywne wyniki
Schemat zgodnego z GMP i zatwierdzonego przez FDA protokołu produkcyjnego przedstawiono na Rysunku 1. Proces ten trwa około 50 dni. Typowe metody generowania limfocytów T swoistych dla wirusa opierają się na namnażaniu istniejących limfocytów T pamięci; jednak krew pępowinowa nie zawiera limfocytów T z doświadczeniem wirusowym, dlatego konieczne jest pobudzenie naiwnych limfocytów T ex vivo. W tym celu wykorzystujemy komórki dendrytyczne oraz cytokiny IL-7, IL-12 i IL-15, które są niezbędne do wygenerowania swoistości wirusowej.
Po 3 stymulacjach wydajność powinna przekroczyć 100x106 komórek. Jeśli nie uzyskano wystarczającej liczby komórek, można przeprowadzić dodatkowe stymulacje, aż do uzyskania pożądanej liczby CTL. Większość tych komórek powinna być CD3+, z mieszaniną limfocytów T CD4+ i CD8+. Odsetek komórek NK (CD3-/CD56+) powinien wynosić mniej niż 15%, a limfocytów B CD19+ mniej niż 1% (Rysunek 2).
Rozszerzone CTL powinny rozpoznawać antygen pp65 z CMV, hekson i penton z adenowirusa, a także liczne antygeny EBV wykazujące ekspresję na EBV-LCL. W teście ELISPOT CTL powinny wydzielać więcej IFN-? w odpowiedzi na te antygeny niż na antygeny nieistotne (Rysunek 3).
Limfocyty CTL powinny również lizować cele pulsowane peptydami wirusowymi, takie jak blasty PHA. W teście uwalniania 51Cr limfocyty CTL powinny lizować LCL pulsowane CMVpp65 oraz cele pulsowane heksonem i/lub pentonem adenowirusa, ale nie cele pulsowane nieistotnymi peptydami (Rycina 4).
Rysunek 1. Generowanie CTL specyficznych dla wielu wirusów z krwi pępowinowej. Schemat przedstawiający cały proces wytwarzania CTL z krwi pępowinowej. Najpierw komórki mononuklearne krwi pępowinowej są izolowane z 20% frakcji rozwarstwionej jednostki krwi pępowinowej. Z wyjątkiem 5x106 komórek zarezerwowanych do generowania LCL, wszystkie komórki są następnie wysiewane w pożywce dla komórek dendrytycznych na 1-2 godziny, po czym zbiera się i mrozi komórki nieprzywierające. Następnie komórki DC są hodowane w pożywce DC zawierającej IL-4 i GM-CSF. Po 5 dniach hodowli komórki DC dojrzewają i są transdukowane wektorem adenowirusowym zawierającym immunodominujący antygen CMV pp65. Na początku komórki DC są łączone z komórkami nieprzywierającymi oraz cytokinami IL-7, IL-12 i IL-15. Podczas kolejnych stymulacji ten sam wektor adenowirusowy jest wykorzystywany do transdukcji EBV-LCL, które służą jako komórki prezentujące antygen. Podczas drugiej stymulacji stosuje się IL-15, a w dalszej kolejności IL-2.
Rycina 2. Fenotyp uzyskanych limfocytów T. Przedstawiono procent żywych komórek w bramce limfocytów. CTL są CD3+ oraz CD4+ lub CD8+, lecz w przeważającej mierze CD3-/CD56- i CD19-.
Rysunek 3. Funkcjonalność limfocytów T. Specyficzność limfocytów T badano za pomocą testu IFN- γELISPOT. Limfocyty T poddano inkubacji z nakładającymi się peptydami obejmującymi całe białka hexonu, pentonu, pp65 oraz nieistotnym antygenem IE-1. CTL alone oznacza zastosowanie samego medium. Autologiczne LCL zostały napromieniowane i dodane w ilości 1x105/studzienkę. Przedstawiono średnią liczbę komórek tworzących plamki z trzech powtórzeń.
Rysunek 4. Aktywność cytolityczna CTL. Zdolność otrzymanych CTL do lizy celów wykazujących antygeny wirusowe została zbadana w teście z użyciem 51Cr. Autologiczne blasty PHA znakowane 51Cr poddano pulsacji nakładającymi się peptydami obejmującymi cały antygen lub autologiczne LCL znakowane 51Cr hodowano wspólnie z CTL. Po 4 godzinach zmierzono uwalnianie promieniowania gamma za pomocą licznika gamma.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecne strategie nakierowane na kontrolowanie infekcji wirusowych po CBT mogą być skuteczne, ale wiążą się ze znaczną toksycznością, są kosztowne i nie zapewniają długotrwałej ochrony przed późniejszym zakażeniem. W rzeczywistości stosowanie niektórych leków przeciwwirusowych może ograniczać ekspansję swoistych dla wirusa limfocytów T, które w przeciwnym razie działałyby ochronnie.14 Inną opcją jest infuzja limfocytów T swoistych dla wirusa pochodzących od dawcy. My oraz inni wykazaliśmy, że takie limfocyty T ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana z grantu badawczego Dan L. Duncan (C.M.B i E.J.S), Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (US4HL081007), nagrody Clinical Research Scholar przyznanej przez Leukemia and Lymphoma Society (C.M.B) oraz Narodowy Instytut Nowotworów (RO1 CA06150816; E.J.S).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| podłoże DC | CellGenix | 20801-0500 | |
| EHAA (Click’pożywka Medium) | Irvine Scientific | 9195 | |
| Surowica ludzka | Gemini Bio Products | 100-110 | |
| Naczynia hodowlane przepuszczalne dla gazów18 | Wilson Wolf Manufacturing | 80040S | |
| IL-2 | Chiron (TCH Pharmacy) | ||
| IL-12 | Krajowy Instytut Raka | ||
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 | |
| IL-7 | R&D Systems | AFL207 | |
| IL-1beta | R&D Systems | AFL201 | |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 | |
| GM-CSF | Apteka TCH | ||
| IL-4 | R&D Systems | AFL204 | |
| TNF-alfa | R&D Systems | AFL210 | |
| Ad5f35pp65 | Zakład Produkcji Wektorów BCM CAGT | ||
| Zestaw do transferu osocza z żelejącym adapterem luer | Charter Medical | 89-550-66j | |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
Bibliografia
- Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).
- Hanley, P. J. Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood. Cytotherapy. 12, 713(2010).
- Szabolcs, P., Cairo, M. S. Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution. Semin. Hematol. 47, 22(2010).
- Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR. J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).
- Leen, A. M. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).
- Riddell, S. R. Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science. 257, 238(1992).
- O'Reilly, R. J. Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants. Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).
- Peggs, K. S. Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines. Lancet. 362, 1375-1375 (2003).
- Sili, U. Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy. J. Immunother. 26, 241(2003).
- Bollard, C. M. Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma. Cytotherapy. 13, 518(2011).
- Hanley, P. J. Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes. Blood. 114, 1958(1958).
- Hanley, P. J. Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation. Cytotherapy. , (2011).
- Gerdemann, U. Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant. J. Vis. Exp. (51), e2736(2011).
- Mori, T., Kato, J. Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation. Int. J. Hematol. 91, 588(2010).
- Einsele, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916(2002).
- Bao, L. Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156(2008).
- Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. Novel cord blood transplant therapies. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S39-S45 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex. J. Immunother. 33, 305(2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
